Зміни окислювально-відновного потенціалу середовища культивування стійкою до важких металів бактерії Pseudomonas diminuta: взаємозв'язок з виділенням з клітин металлотіонеінподобних білків

Особливе положення важких металів (ТМ) серед забруднювачів пов'язано як з можливістю їх накопичення організмами і передачі по харчових ланцюгах, так і з високою токсичністю (Reddy, Prasad, 1990). Вплив ТМ, передусім, позначається на первинних продуцента - Мікроводоростей і ціанобактеріям, які нарівні з гетеротрофних мікроорганізмами можуть використовуватися для детоксикації і витягу коштовних металів, оскільки здатні акумулювати їх з водного середовища та донних відкладень у кількості, що багато разів перевищує потребу в них, як в компонентах мінерального живлення (Nagase et al., 1994). Найбільшою стійкістю до ТМ відрізняються мікроорганізми, виділені в місцях, що містять промислові забруднення, або родовища відповідного металу (Горленко та ін, 1977).

Ванадій, як один із широко поширених ТМ, використовується зеленими, жовто-зеленими і бурими водоростями, міститься в альтернативних Нітрогеназа деяких грунтових бактерій, але не є необхідним елементом для розвитку більшості прокаріотних мікроорганізмів, серед яких найбільш активними біоаккумуляторамі ванадію є бактерії роду Pseudomonas, а також ряд ціанобактерій (Rehder, 1991). Його токсичний ефект обумовлений головним чином тим, що відновлюючись в клітинах, він стимулює утворення вільнорадикальних станів О2 (Popper et al., 1991).

Іони ТМ утворюють меркаптіди з SH-групами тіоловою сполук клітин: реакція оборотна, але рівновага її зміщена в бік слабодіссоціірующіх металлтіолатов (Торчинське, 1977). Стійкість фототрофних та інших мікроорганізмів до дії ТМ найбільшою мірою зумовлена специфічним зв'язуванням основної частини поглинених клітинами ТМ суміжними залишками цистеїну в молекулі спеціалізованих білків -- металлотіонеінов (МТ). Спільним для цих білків є молекулярна маса до 10 кДа і високий вміст тіоловою груп. У спектрі оптичного поглинання МТ в УФ-області близько 250 нм, спостерігаються типові для металлтіолатних комплексів шіpокіе смуги, які зникають пpи видалення металу (Ang, Wong, 1992). Ціанобактерії, культивовані в присутності високих концентрацій ванадати синтезують зв'язує іони металу МТ другого класу (Саваніна та ін, 1995).

У даній роботі встановлена кореляція між залежним від ванадати накопиченням у середовищі культивування бактерій Ps. diminuta низькомолекулярних, багатих SH-групами білків та змінами окисно-відновного потенціалу (Eh) середовища. Матеріали та методи

У роботі використовували гетеротрофні бактерії, виділені з придонного осаду ванадійсодержащего промислового водойми та ідентифіковані нами як Ps. diminuta (Саваніна та ін, 1998). Бактерії культивували при температурі 25-27 ° в конічних колбах на середовищі, що містить в 100 мл водопровідної води глюкозу і пептони в концентрації по 1 г/л (pH 7,2).

Для визначення в культуральной рідини Ps. diminuta вмісту низькомолекулярних білків і SH-груп проби діалізовалі 24 годину при 0о проти 50 мМ трис-HCl буфера, pH 7,6, що включає 10 мМ ЕДТА з використанням мембрани фірми Serva (Німеччина) з діаметром пір, що пропускають молекули масою <10-15 КД. У присутності ЕДТА, сульфгідрильні групи МТ та інших SH-вмісних сполук звільняються від більшої частини пов'язаного ванадію і стають реакційноздатні.

Щільність клітинних суспензій визначали нефелометріческі при 540 нм на спектрофотометрі фірми Hitachi (Японія), модель U-2000. Для визначення концентрації ванадію в біологічному матеріалі і культуральної рідини використовували кольорову реакцію ванадію з 4 - (2-піріділазо)-резорцином. Клітини попередньо тричі відмивали від середовища культивування і озолялі азотною кислотою. Оптичну щільність вимірювали на тому ж спектрофотометрі при 520 нм використовуючи коефіцієнт молярній екстинкції 24500М-1см-1. Зміст діалізованних низькомолекулярних білків визначали за Лоурі (Lowry et al., 1951). Концентрацію тіоловою груп в цих білках та інших сполуках визначали за реактивом Елман (5,5 '-дітіобіс (2-нітробензойная) кислота) в присутності ЕДТА (Верьовкін та ін, 1977) і реєстрували при довжині хвилі 412 нм на тому ж спектрофотометрі використовуючи коефіцієнт молярній екстікціі 11400М-1см-1. Величини pH і Eh середовища култівірованія вимірювали на електрометрії фірми Cole-Parmer (США), модель DigipHase, pH визначали за допомогою комбінованого скляного електрода з подвійним Ag/AgCl електродом порівняння фірми Radiometer (Голландія), для визначення Eh використовували Pt-електрод, а в якості електрода порівняння - Ag/AgCl (обидва електроди Російського виробництва); потенціал електрода порівняння щодо нормального водневого електроду, виміряний як в роботі (Barsky, Samuilov, 1979), становить 225 ± 10 мВ. Таким чином, справжня величина Eh середовища являє собою суму вимірюваної величини Eh і потенціалу електрода порівняння.

Рис. 1. Ефект ванадати на зростання культури Ps. diminuta; 1 - контроль; 2, 3 - у присутності 100 і 700 мг/л ванадати відповідно. Результати і їх обговорення

Клітини Ps. diminuta, ізольовані з проби придонного осаду промислового водойми, скидних води якого містять як відходи металургійного виробництва ванадій в концентрації 100-700 мг/л, добре ростуть як без ванадати, так і в його присутності; при цьому максимальна кількість клітин бактерій досягає 2x107 кл/мл середовища через 12-16 діб культивування (рис. 1). Ванадати в концентрації 700 мг/л знижує накопичення біомаси Ps. diminuta на 30-40%. У подальших дослідах ванадати додавали в концентрації 100 мг/л, оскільки не роблячи помітного впливу на ріст бактерій, ванадати в цій концентрації значно стимулював виділення з клітин низькомолекулярних білків.

Застосування методу діалізного (змішано-роздільного) культивування фототрофних мікроорганізмів -- ціанобактерій або мікроводоростей з гетеротрофних бактеріями роду Pseudomonas (Гусєв та ін, 1988) дозволило виявити ряд закономірностей зростання двох різних культур, розділених напівпроникною мембраною. При культивуванні фототрофних компонента в присутності ванадати клітини активно виділяють в середу вуглеводи і гліколат. Ці з'єднання використовуються для росту гетеротрофних компонентом в якості субстратів окислення. При цьому бактерії ефективно поглинають ванадати, істотно знижуючи його концентрацію в середовищі (Саваніна та ін, 1994; Гусєв та ін, 1997).

Рис. 2. Зміст ванадати в клітинах (1) і в середовищі (2) в залежності від віку культури Ps. diminuta.

Дійсно, як показують наші досліди зміст ванадати в клітинах Ps. diminuta, протягом першого 2 доби культивування швидко збільшується від 0 до 5-6 мкг/млн клітин, а потім знижується приблизно в 10 разів (рис. 2, крива 1). Інша картина спостерігається щодо концентрації ванадати в культуральной рідини. За перші дві доби культивування Ps. diminuta зміст ванадати в середовищі падає від 100 до 10-12 мг/л, а потім починає поступово збільшуватися у міру розвитку культури, причому в середу повертається до 60% ванадати (рис. 2, крива 2). Як видно, накопичення іонів ванадію в клітинах корелює c його вмістом в культуральной рідини: збільшення концентрації ванадати в клітинах супроводжується її зниженням у середовищі культивування і навпаки.

Таке значне збільшення концентрації ванадати в середовищі в міру виходу кривої зростання на стаціонарний рівень може бути обумовлено тим, що ванадати виділяється з нативних і зруйнованих клітин разом з компонентами що зв'язують метал. Такими компонентами перш за все є низькомолекулярні багаті SH-групами білки; можуть бути й інші тіоловою з'єднання, до яких відносяться глутатіон, цистеин, тіоглікольовая кислота, дітіоетанол, дітіопропанол і т.д.

Відомо, що специфічну стійкість фототрофних мікроорганізмів до дії ТМ забезпечує наявність у клітинах SH-вмісних білків з мовляв. м. до 10 кДа, що зв'язують велику частину поглинених клітинами ТМ (Obata et al., 1994). Зміст низькомолекулярних білків і корелює з ним вміст SH-груп у клітинах ціанобактерій зростає під дією ванадати (Лебедєва та ін, 1993). Виділений з клітин Anacystis nidulans білок був ідентифікований як МТ II класу, що зв'язує ванадій (Саваніна та ін, 1995). Відомо, що МТ більшості прокаріотів як правило складаються з однієї поліпептидного ланцюга з мовляв. м. до 7-10 кДа і високим вмістом цистеїну (в середньому до 30%) (Kagi, 1993). Клітини Ps. fluorescens виділяють в середу зв'язують іони Zn поліпептиди з мовляв. м. 1-3,5 кДа. (Appana, Whitmore, 1995). Оскільки клітини Ps. diminuta виділені з ванадійсодержащего промислового водойми і за даними рис. 1 стійкі до дії ванадати, становить інтерес визначення вмісту низькомолекулярних білків і SH-груп в культуральной рідини Ps. diminuta в динаміці розвитку культури.

Рис. 3. Залежність вмісту низькомолекулярних білків (1, 2) і SH-груп (3, 4) о середовищі від віку культури Ps. diminuta. 1, 3 - контроль; 2, 4 - у присутності 100 мг/л ванадати.

Як видно з рис. 3 в середовищі культивування Ps. diminuta спостерігається накопичення низькомолекулярних білків, вміст яких до 12 діб становить близько 50 мкг/мл (крива 1). У присутності ванадати кількість білка до цього періоду часу зростає до 450 мкг/мл (крива 2). Це узгоджується з раніше отриманими даними про стимуляції синтезу МТ у ціанобактерій (Лебедєва та ін, 1993; Саваніна та ін, 1995) і в клітинах тваринних організмів (Gachot et al., 1994).

Подібним чином ванадати стимулює накопичення SH-груп низькомолекулярних білків і, можливо, інших тіолсодержащіх сполук у середовищі культивування Ps. diminuta (рис. 3, криві 3 і 4); залежності вмісту SH-груп в середовищі від віку культури мають колоколообразний характер з максимумом, що припадають на 8-9 добу. Здається невідповідність характерів накопичення SH-груп і білка в середовищі (наявність спаду в змісті SH-груп, тоді як по білку такого спаду немає), може бути обумовлено окисленням SH-груп киснем, яке має значно посилюватися при значеннях pH вище 7, як це показано раніше для цистеїну (Barsky et al., 1984). Дійсно, згідно з нашими даними pH культури Ps. diminuta з віком збільшується від 7 до 8,5; у присутності ванадати величини pH на 0,3-0,5 одиниці вище, ніж у контролі.

Рис. 4. Зміни величини Eh середовища в динаміці розвитку культури Ps. diminuta. 1 - контроль; 2 - у присутності 100 мг/л ванадати.

колоколообразний залежність накопичення SH-груп в середовищі від віку культури Ps. diminuta супроводжується подібною залежністю зниження Eh середовища. У міру розвитку культури величина Eh зменшується і досягає мінімуму (180-200 мВ) до 6-8 діб, а потім знову зростає (рис. 4, крива 1). У присутності ванадати мінімальне значення Eh досягає 80 - 90 мВ (крива 2). Настільки низькі значення Eh в аеробних умовах можуть бути обумовлені тільки наявністю в середовищі значних кількостей тіолсодержащіх з'єднань, стандартний редокс-потенціал яких в анаеробних умовах істотно нижче 0 мВ. Так, наприклад, 1,4-дітіотреітол, ефективно відновлює SH-групи ферментів і кофакторів, має стандартний потенціал -330 мВ при pH7; подібними окислювально-відновлювальні властивості володіють тіоглікольовая кислота, 2-меркаптоетанол, дімеркаптопропанол та ін (Досон та ін, 1991).

На відміну від тіол такі сполуки, як органічні кислоти, мають стандартні редокс-потенціали в інтервалі від 50 до 250 мВ. Згідно з нашими даними (рис. 5) для досягнення величини Eh близько 200 мВ зміст аскорбату в середовищі в аеробних умовах має становити кілька мМ (крива 2), а в разі гліколата його концентрація при Eh близько 300 мВ досягає 200-400 мМ (крива 3).

Рис. 5. Залежність величини Eh від концентрації SH-груп цистеїну, інкубіруемого в 20 мМ буфері морфолінопропансульфонате (pH 7,0).

На рис. 5 також показано залежність величини Eh буферного розчину від концентрації SH-груп цистеїну (крива 1). Видно, що величин Eh близько 200 і 100 мВ відповідають концентрації SH-груп близько 20 і 120 мкм. Ці значення узгоджуються з величинами Eh (рис. 4) і концентраціями SH-груп (рис. 3) в культуральной рідини Ps. diminuta.

Таким чином, отримана кореляції між вмістом ванадати в клітинах і культуральної рідини Ps. diminuta, накопиченням низькомолекулярних білків і SH-груп і змінами Eh середовища культивування бактерій дозволяють вважати, що іони ванадію, поглинені клітинами Ps. diminuta стимулюють утворення тіонеінподобних білків, зв'язуються з ними за участю SH-груп та виділяються з клітин разом з білками, продуктами їх деградації або з іншими тіоловою сполуками. Список літератури  Верьовкін      І.В., Точілкін О.І., Попова Н.А. 1977. Сучасні методи в біохімії, М.  Горленко      В.М., Дубініна Г.А., Кузнецов С.І. 1977. Екологія водних мікроорганізмів,      М.  Гусєв      М.В., Вольберг М.М., Лебедєва А.Ф., Савельєв І.Б. 1988. Використання      методу діалізного культивування для підбору симбіотичних      альгобактеріальних пар// Біол. науки, № 1, 103-106.  Гусєв      М.В., Лебедєва А.Ф., Саваніна Я.В., Барський Е.Л. 1997. Стійкість      культур ціанобактерії Anacystis nidulans і мікроводорості Dunaliella      maritima до токсичного дії ванадію: вплив фосфату, заліза і      цистеїну// Вестн. МГУ. Сер. Біологія, № 3, 12-17.  Досон Р.,      Елліот Д., Елліот У., Джонс К. 1991. Довідник біохіміка, М.  Лебедєва      А.Ф., Саваніна Я.В., Савельєв І.Б. 1993. Распрeделеніе ванадію в клітинах      ціанобактерій Anacystis nidulans і Nostoc muscorum:      взаємозв'язок з SH-містять низькомолекулярними білками// Вестн. МГУ. Сер.      Біологія, № 4, 58-61.  Саваніна      Я.В., Лебедєва А.Ф., Савельєв І.Б. 1994. Змішано-роздільне      культивування ціанобактерій Anacystis nidulans і Nostoc      muscorum і бактерій роду Pseudomonas у присутності ванадію// Вестн.      МГУ. Сер. Біологія, № 2, 29-34.  Саваніна      Я.В., Адані А.Г., Лебедєва А.Ф., Савельєв І.Б., Гусєв М.В. 1995.      Освіта ванадій-тіонеіна клітинами Anacystis nidulans при      високих концентраціях металу// Вестн. МГУ. Сер. Біологія, № 1, 38-46.  Саваніна      Я.В., Пахомкіна Б.С., Лебедєва А.Ф., Дольникова Г.А. 1998.      Змішано-роздільне культивування ціанобактерій Anacystis nidulans,      Anabaena variabilis і Nostoc muscorum з бактеріями,      виділеними з ванадійсодержащего промислового водойми. Тез. докл. на V      Міжнародної конференції "Нові інформаційні технології в медицині      та екології "Гурзуф.  Торчинське      Ю.М. 1977. Сірка в білках, М.  Ang S.G.,      Wong V.W. 1992. Chromatographic analysis of low-molecularmass      copper-binding ligands from the crab-spesies Scylla serrata and Portunus      pelagicus// J. Chromatogr., 599, № 1-2, 21-24.  Appana      V.D., Whitmore L. 1995. Biotransformation of zinc by Pseudomonas fluorescens// Microbios.,      82, № 332, 149-155.  Barsky      E.L., Samuilov V.D. 1979. Blue and red shifts of bacteriochlorophyll      absorption band around 880 nm in Rhodospirillum rubrum// Biochim.      Biophys. Acta, 548, 448-457.  Barsky      E.L., Kamilova F.D., Samuillov V.D. 1985. Do cyanobacteria contain a      membrane bound cysteine oxidase?// Z. Naturforsch, 40 c, 176-178.  Gachot B.,      Tauc M., Wanstoc F., Morat L., Poujeol Ph. 1994. Zinc transport and      metallothionein induction in primary cultures of rabbit kidney proximal      cells// Biochem. Biophys. Acta, 1191, № 2, 291-298.  Kagi      J.N.R. 1993. Purification and primary structure of snail metallothionein.      Similarity of the N-terminal sequence with histones H4 and H2A// Eur.      J. Biochem., 216, № 3, 739-746.  Lowry O.,      Rosenbourg R., Farr A., Randal R. 1951. Protein measurement with Folin      phenol reagent// J. Biol. Chem., 193, 265-275.  Nagase H.,      Inthorn D., Miuamoto K. 1994. Use of photosynthetical organisms in      biological purification// Jap. J. Toxicol. and Environ. Health, 40, № 6,      479-485.  Obata H.,      Inoue N., Imai K., Umebauashi M. 1994. Cadmium tolerance of calli induced      from roots of plants with differences in cadmium tolerance// Soil. Sci. and      Plant. Nutr., 40, № 3, 351-354.  Popper      H.H., Woldrich A., Grigar E. 1991. Comparison of chromate and vanadate      toxicity and its relationship to oxigen radical formation// Zentralb. Hyg.      und Umweltmed, 194, № 4, 373-379.  Reddy      G.N., Prasad M.N.V. 1990. Heavy metal binding proteine. Polypeptide:      occurence, structure, synthesis and function// Environ. Exp. Bot. 30, N 3.      251-264 Rehder D. 1991. Bioorganisme Chemie des Vanadiums// Angev. Chem.,      103, № 2, 152-172.