Іммунохроматографіческій аналіз

У сучасній медичній практиці з кожним роком зростає роль лабораторної діагностики як основного інструменту постановки діагнозу і моніторингу терапії. Одним з бурхливо розвиваються і затребуваних методів лабораторної діагностики є іммунохроматографіческій аналіз.

ІММУНОХРОМАТОГРАФІЧЕСКІЙ АНАЛІЗ (ІХА) - це метод визначення наявності певних концентрацій речовин в біологічних матеріалах (сеча, цільна кров, сироватка або плазма крові, слина, кал і т.д.). Даний вид аналізу здійснюється за допомогою індикаторних смужок, паличок, панелей або тест-касет, які забезпечують швидкість проведення тестування. ІХА - порівняно молодий метод аналізу, він часто позначається в літературі також як метод сухий імунохімії, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, експрес-тест або експрес-аналіз. Ці назви пов'язані з швидкістю проведення цього методу аналізу.

Принцип дії іммунохроматографіческого тесту полягає в тому, що при зануренні тесту в фізіологічну рідину вона починає мігрувати вздовж смужки за принципом тонкошарової хроматографії. Рухомий фазою в даному випадку є фізіологічна рідина. Разом з рідиною рухаються й антитіла з барвником. Якщо в цієї рідини присутній досліджуваний антиген (гормон, інфекційний або онкологічний маркер), то відбувається його зв'язування, як з першого, так і з другим типом антитіл, що є вже імунологічним методом аналізу. При цьому відбувається накопичення антитіл з барвником навколо антитіл, жорстко іммобілізованих в тест-зоні ІХА-смужки, що проявляється у вигляді яскравої темної смуги. Незв'язана антитіла з барвником мігрують далі вздовж смужки і неминуче взаємодіють з вторинними антитілами в контрольній зоні, де і спостерігається другий темна смуга. Взаємодія (і темна смуга) у контрольної зоні повинні виявлятися завжди (якщо аналіз проведено правильно), незалежно від присутності досліджуваного антигену у фізіологічній рідині (см.ріс.1). Результати визначаються візуально або комп'ютерною обробкою відсканованого зображення.

Імунологічний метод аналізу заснований на реакції між антигеном і відповідним йому антитілом. Антиген - це речовина, що чужорідне для організму людини і яке може запустити імунну систему (захисну реакцію). Антитіла - це білки, які виділяються клітинами нашого організму при впровадженні в нього антигену. Метод імунної хроматографії заснований на особливому властивості антитіл зв'язуватися з антигеном специфічними (тобто виборчим) чином. Це означає, що кожне антитіло дізнається і зв'язується тільки з певним антигеном. На цій унікальній особливості антитіл і засновані всі імунологічні методи аналізу в тому числі і ІХА. Причому визначеним «Антигеном» в даному методі аналізу може служити і визначається в біоматеріалу антитіло до інфекційного агента або аутоантитіла, тоді інші використовувані в тесті антитіла будуть антіантітеламі. У ІХА-тестах використовується три типу антитіл.

1. Розчинні моноклональні антитіла до досліджуваного антигену або антитілу, кон'юговані ( "зшиті") з колоїдних золотом - барвником, який можна легко ідентифікувати навіть у найменших концентраціях. Ці антитіла нанесені поблизу ділянки занурення тест-смужки у фізіологічну рідину (сечу, кров).

2. Поліклональні антитіла до досліджуваного антигену або антитілу, жорстко імобілізовані в тест-зоні смужки.

3. Вторинні антитіла до моноклональних антитіл, жорстко імобілізовані в контрольній зоні тест-смужки.

Принцип роботи тестів на наркотики дещо відрізняється від інших тест-систем. Пристрій ІХА-смужки відрізняється тим, що в тест-зоні іммобілізовані штучні антигени, здатні специфічно зв'язуватися з вільними антитілами. Якщо досліджуваний антиген (наркотик) НЕ присутній у фізіологічної рідини, ділянки зв'язування антитіл (епітопи) залишаються вільними, і вони здатні зв'язуватися зі штучними антигенами в тест-зоні, утворюючи темну смугу за рахунок кон'югованого барвника. Відповідно, якщо досліджуваний антиген прісутстствует в рідині, то антитіла, зв'язавшись з ним, вже не можуть взаємодіяти з антигенами в тест-зоні та освіти темної смуги там не відбувається. Але в обох випадках (якщо аналіз проведено правильно) відбувається зв'язування "забарвлених" антитіл з вторинними антитілами в контрольної зоні і освіта там темної смуги. Можливі варіанти при проведення аналізу: одна смуга - позитивний результат, дві смуги -- негативний результат, немає смуг - аналіз проведений неправильно.

Основними перевагами використання іммунохроматографіческіх тест смужок є:

1) Простота і зручність - дозволяє отримати результат (аналіз і первинне уявлення про причини захворювання) без обладнання та спеціальних навичок

2) Надійність -- достовірність тестів досягає 92-99,8%, при цьому кожен тест має вбудований внутрішній контроль

3) Економічність - мінімальні витрати на придбання тесту і економія часу на проведення обстеження. У роздробі вартість одного ІФА-дослідження в 5-10 разів дорожче ІХА та отримання результату мінімум на наступний день

4) Анонімність - Що особливо важливо при виявленні захворювань, що передаються статевим шляхом, інших інфекційних захворювань, а також виявлення фактів вживання наркотичних речовин

5) Незалежність - не вимагає попередньої медичної консультації і рецепта лікаря

Будучи ефективним засобом діагностування, експрес-тести дозволяють візуально в протягом декількох хвилин визначити і оцінити зміст антигенів, антитіл, гормонів та інших діагностично важливих речовин в організмі людини. Експрес-тести відрізняються високим ступенем чутливості і точності, виявляючи більше 100 видів захворювань, що включають такі поширені хвороби як туберкульоз, сифіліс, гонорею, хламідіоз, різні види вірусних гепатитів, та інші, а також всю гаму застосовуваних наркотичних речовин при високої достовірності визначення. Важливою перевагою даного виду тестів є їх застосування в діагностиці in vitro, що не вимагає безпосереднього присутності обстежуваного пацієнта.

Однак іммунохроматографіческіе тест-смужки не позбавлені недоліків. Стосується це надійності, чутливості і економічності тестів. Надійність і чутливість залежить, по-перше, від якості використовуваних в тесті моноклональних антитіл і, по-друге, від концентрації антигену у біоматеріалу. Якість моноклональних антитіл залежить від способів їх отримання, очистки та фіксації на носії. Концентрація антигену - від стадії захворювання та кількості біоматеріалу. Кількість біоматеріалу особливо важливо при використанні цільної крові. При цьому істотну роль грає гематокрит, тобто співвідношення плазми і формених елементів. При високому гематокрит знижується кількість плазми з антигеном, мігруючою уздовж смужки. Температура, від якої залежить швидкість взаємодія антитіла з антигеном, важлива тільки для часу постановки тесту. Зрозуміло, що використовувати смужки при температурі нижче точки замерзання води, складовою основну частину біоматеріалу, не має сенсу.

Викликає великі сумніви економічність використання експрес-тестів у бюджетних медичних організаціях, які займаються масової диспансеризацією населення і яким як раз-то зручні і необхідні комплексні стрип-системи з тест-смужок для скринінгового виявлення різних захворювань. Обумовлено це низькою вартістю аналізу за бюджетними розцінками. При цьому собівартість тест-смужки в деяких випадках в 10 разів перевершує оплату аналізу.

Список літератури.

1) Wennig R, Moeller MR, Haguenoer JM et al. (1998) Development and evaluation of immunochromatographic rapid tests for screening of cannabinoids, cocaine, and opiates in urine// J. Anal. Toxicol. - V.22 - P.148-155

2) Coons, S.J. A look at the purchase and use of home pregnancy-test kits. Am.Pharm. NS29 :46-48, 1989.

3) Bastian, LA, Nanda, K., Hasselblad, V., and Simel, D.L. Diagnostic efficiency of home pregnancy test kits. A meta-analysis. Arch.Fam.Med. 7:465-469, 1998.

4) Latman, N.S. and Bruot, B.C. Evaluation of home pregnancy test kits. Biomed.Instrum.Technol. 23:144-149, 1989.

5) Hicks, J.M. and Iosefsohn, M. Reliability of home pregnancy-test kits in the hands of laypersons [letter] [published erratum appears in N Engl J Med 1989 Jul 20; 321 (3): 193] [see comments]. N.Engl.J.Med. 320:320-321, 1989.

6) Torlesse, H., Wurie, I.M., and Hodges, M. The use of immunochromatography test cards in the diagnosis of hepatitis B surface antigen among pregnant women in West Africa. Br.J.Biomed.Sci. 54:256-259, 1997.

7) Sato, K., Ichiyama, S., Iinuma, Y., Nada, T., Shimokata, K., and Nakashima, N. Evaluation of immunochromatographic assay systems for rapid detection of hepatitis B surface antigen and antibody, Dainascreen HBsAg and Dainascreen Ausab. J.Clin.Microbiol. 34:1420-1422, 1996.

8) Lein, M., Jung, K., Schnorr, D., Henke, W., Brux, B., and Loening, S.A. Rapid screening of PSA: evaluation of an immunochemical membrane strip test [letter]. Clin.Chem. 41:1545-1547, 1995.

9) Anderson, JC, Cheng, E., Roeske, M., Marchildon, P., Peacock, J., and Shaw, R.D. Detection of serum antibodies to Helicobacter pylori by an immunochromatographic method. Am.J.Gastroenterol. 92:1135-1139, 1997.

10) Schrier, WH, Schoengold, RJ, Baker, JT, Norell, JL, Jaseph, CL, Okin, Y., Doe, JY, and Chandler, H. Development of FlexSure HP - an immunochromatographic method to detect antibodies against Helicobacter pylori. Clin.Chem. 44:293-298, 1998.

11) Cognein, P., Costa, A., and Giacosa, A. Serodiagnosis of Helicobacter pylori: evaluation of a rapid, miniaturized immunochromatographic test. Eur.J.Cancer.Prev. 3:457-463, 1994.

12) Shirin, H., Bruck, R., Kenet, G., Krepel, Z., Wardi, Y., Reif, S., Zaidel, L., Geva, D., Avni, Y., and Halpern, Z. Evaluation of a new immunochromatographic test for Helicobacter pylori IgG antibodies in elderly symptomatic patients [see comments]. J. Gastroenterol. 34:7-10, 1999.

13) Kagen, L. J. 1973 Myoglobin: Biochemical, physiological and clinical aspects. New York and London Colombian University Press.

14) Drexel, H. et al. 1983 Myoglobinaemia in the early diagnosis of acute myocradial infarction. A m. Heart J. 105: 642-651.

15) McComb, J. M. et al. 1983 Myoglobin in the very early phase of acute myocardial infaretion. Ann Clin. Biochem, 22:152-155.

16) Grenardier, E., Keidar, S., Kahana, L., Alpan, G., Marmur, A., Palant, A. 1983 The roles of serum myoclobin, total CPK, and CK-MB isoenzyme in the acute phase of myocardial infarction. Am. Heart J. 105:408-416.

17) Ellis A. K., Saran, B.R. 1989 Kinetics of myoolobin release and prediction of myocardial myoglobin depletion after coronary artery reperfusion. Circulation 80: 676-682.

18) McComb, J.M. et al. 1984 Myoglobin and creatine kinase in acute myocardial infarction. Br. Heart J. 51:189-194.

19) Struyf, F., Lemmens, A., Valadas, E., Verhaegen, J., and Van Ranst, M. Usefulness of immunochromatographic detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis as an adjunct to auramine staining for rapid diagnosis of tuberculosis in a low-prevalence setting. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18:740-742, 1999.

20) Abe, C., Hirano, K., and Tomiyama, T. Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti-MPB64 monoclonal antibodies. J.Clin.Microbiol. 37:3693-3697, 1999.

21) Edmund C. Tramont. Traponema pallidum (Syphilis). In Mandell, Douglas and Bennett's Principles and Practice of infectious Diseases. G.L. Mandell, J.E. Bennett, P. Dolin, eds. Churchill Livingston New York, 1995.

22) Steven J. Norris and Sandra A larsen, Traponema and Other Host-Associated Spirochemetes in Manual of Clinical Microbiology. P. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yoken, eds, ASM Press, Washington D.C. 1995.

23) Larsen, S.A., E.F. Hunter, & S.J. Draus (ed.) 1990. A Manual of Tests for Syphilis, 8th ed. American Public Health Association, Washington D.C.