Структура і деякі властивості білка остеопонтіна.

Останнім часом все більшу увагу дослідників привертають білки-цитокіни, залучені в процеси остеогенезу і дентогенеза, а також реконструкції дента і кісткової тканини. Вивчаються молекулярні механізми дії даних білків, регуляція експресії їх генів, розподіл у різних типах тканин, вишукуються речовини - інгібітори або, навпаки, активатори їх біологічної активності і т. д.

Причиною такої пильної уваги є не тільки необхідність отримання фундаментальних знань про структурні засади їх біологічної активності, а й роль ростових факторів у розвитку цілого ряду захворювань людини. Адгезивні білки і білки-цитокіни кісткової тканини залучені в патогенез остеопорозу, остеопетроза, розвиток первинних і вторинних остеосарком різного походження, і виправляти механічних пошкоджень кістки і дента, і т.д.

Однією з найбільш розповсюджених патологій кісткової тканини є остеопороз - Важке захворювання, що призводять до демінералізації і деструкції кістки. Тільки у США на сьогоднішній день їм страждають більше 10 млн. чоловік, що зумовлює потреба в ефективному лікарський засіб для терапії остеопорозу і запобігання пов'язаних з ним механічних пошкоджень кістки.

Протягом останніх кількох років був розроблений і успішно випробуваний метод лікування остеопорозу за допомогою помірних доз препаратів паратиреоїдного гормону. Як показали клінічні випробування, гормонотерапія прискорює формування нової кісткової тканини, а також збільшує її щільність. У той же час, проведені на модельних тварин дослідження дозволили встановити, що остеогенез - активують дію паратиреоїдного гормону багато в чому обумовлено активністю остеопонтіна (OP) - одного з адгезивних білків кісткового матриксу, залученого до процесу резорбції кістки через одночасне взаємодія з кістковою поверхнею і остеокластів.

Кісткова тканину і дента тварин і людини містить ряд фосфорилювання сіалопротеінов. До них відносяться: BSP (кістковий сіалопротеін), BAG-75 (кислий кістковий глікопротеїн-75), DMP1 (протеїн матриксу дента-1), DSP (сіалопротеін дента), OP та ін Першим з них був відкритий і вивчений фрагмент кісткового сіалопротеіна (BSP) (Herring GM, 1972). Пізніше, після введення інгібітора протеїназ в екстракт тканини кістки (Oegema T., et.al., 1975), були описані властивості повнорозмірного білка. Подальше клонування і визначення нуклеотидної послідовності Комплементарна ДНК BSP (Oldbarg A., et al., 1988) дозволило визначити трансляцією на знайдене відкритій рамці зчитування повну амінокислотних послідовність. Використання відпрацьованих при вивченні BSP прийомів роботи з кістковою тканиною дало надалі можливість виділити і охарактеризувати велику кількість кісткових білків, що володіють адгезивними і цітокінетіческімі властивостями. Одним з таких білків і є остеопонтін -- OP.

Остеопонтін людини був вперше виділений і ідентифікований у 1985 р. (Franzen A., et al., 1985) Пізніше була клонована Комплементарна ДНК OP миші та визначено її нуклеотидних послідовність, амінокислотна послідовність білка, а згодом і повна екзонів-інтрони організація гена (Miyazaki Y., et al., 1990). Повнорозмірний ген OP людини клонували, використовуючи як гібрідізаціонних зондів мічені фрагменти Комплементарна ДНК OP миші. Порівняння структурної та функціональної організації двох генів виявило ряд загальних властивостей. Зокрема, обидва гени включають в свій склад сім екзонів, а їх регуляторні області містять ряд схожих консенсусних послідовностей. У той же час, третій Інтрон гена OP людини містить вставку довжиною 1,8 тисяч пар основ. Подальше вивчення регуляції експресії генів OP миші і людини, так само як і шляху сплайсингу їх мРНК у різних лініях клітин і типи тканин дозволить в подальшому визначити функціональне значення особливостей організації генів OP з різних джерел (Hijiya N., et al., 1994).

OP - секреторний сіалопротеін, про-пептид якого утворюється 314 амінокислотними залишками (а. о.), з яких на частку лідируючій послідовності припадає 16 а. о. OP виявився дещо менш кислим, ніж BSP, але його амінокислотна послідовність, як було встановлено (Hijiya N., et al., 1994) включає кілька блоків з залишків дикарбонових амінокислот, причому один загальною довжиною дев'ять залишків (див. малюнок). Білок O-глікозильованого (Franzen A., et al., 1985) і містить ряд фосфорілірованний залишків серину (Heinegard D., et al., 1989). Порівняння амінокислотної послідовності OP з первинними структурами інших кісткових білків не дозволило виявити протяжних ділянок значною гомології. У той же час, амінокислотна послідовність OP містить у своєму складі консенсусний RGD-ділянку. Дана структура відповідає в ряді білків - BSP (Oldbarg A., et al., 1988) та ін, за взаємодію з розташованими на поверхні клітин рецепторами сімейства інтегринів, і вперше була встановлена у відповідальному за зв'язування клітин домені білка фібронектину (Ruoslahti E. et al., 1987). Цікаво також відзначити, що, як було виявлено в процесі виділення, OP здатний досить міцно зв'язуватися з гідроксиапатиту (Franzen A., et al., 1985). Це може пояснюватися його функціями в мінералізованою кісткової тканини.

Слід підкреслити, що хоча за минулі роки ряд білків кісткового матриксу було виділено і охарактеризовано, в даний час є всього лише припущення про можливу функціональної ролі деяких з них. Жоден з цих білків не є унікальним з точки зору локалізації в кісткової тканини. Всі вони також присутні і в інших типах тканин, при цьому OP дещо обмежений у локалізації в порівнянні з іншими білків. Так, рівень мРНК OP, високий в кісткової тканини, також істотний і в нирках. Цей білок, як було показано, часто входить до складу ниркових каменів і, дуже ймовірно, впливає на їх формування (Nemir M., et al., 1989). Було, зокрема, показано присутність OP в кальцій-фосфатних ниркових каменях. Крім того, виявлено зв'язок між низьким вмістом цього білка в урині пацієнтів і формуванням каменів оксалатних природи (Nishio S., et al., 2000). Значний рівень накопичення OP був знайдений в плаценті і тканинах головного мозку (Nomura S., et al., 1988). Ген OP експресується також у багатьох клітинних лініях, де виявляє різні типи експресії. Конститутивна експресія OP знайдена в клітинах з кісткової тканини, нирок плаценти, нервових клітинах, макрофагах (Patarca R., et al., 1989). У той же час індуцібельний тип спостерігався в T-лімфоцитах, клітинах епідермісу. Посилення експресії відбувається під впливом різних агентів: 1,25 дигідроксивітамін D3, основного фактора росту фібробластів (bFGF), фактора некрозу пухлини (TNF), інтерлейкіну-1 (IL-1), ліпополісахаридів, g-інтерферону (g-IFN) (Hijiya N., et al., 1994). Крім цього, експресія гена OP відбувається при неопластичної стані клітини (Sendger D., et al., 1988; Nemoto H., et al., 2001). Таким чином, регуляція експресії гена OP знаходиться під комплексною системою контролю, що може відрізнятися у клітин різних типів.

Зокрема, з метою вивчення ролі OP в процесах формування кістки, було проведено початкового дослідження впливу на рівень накопичення OP мРНК в остеобластів з Остеосаркома (лінія ROS 17/2.8) різних факторів, що впливають на регуляцію росту і відновлення кістки. Було знайдено, що 1,25-дигідроксивітамін-D3 в кілька разів підвищує як рівень накопичення мРНК, так і секрецію зрілого білка з клітин. Ці дані показують, що синтез OP позитивно регулюється вітаміном D3, тобто фактором, що індукують мобілізацію кальцію з кістки. На думку авторів монографії (Heingard D., et. Al., 1990), це, швидше за все, пов'язано з індукцією активності остеокластів. Цікаво, що за літературними даними ген іншого кісткового сіалопротеіна - BSP, схильний негативної регуляції на вітамін D3, але позитивно регулюється глюкокортикоїдами (Oldberg A., et al., 1989).

З огляду на те, що білок має у своєму складі консенсусне RGD-послідовність, а також має здатність зв'язуватися з гідроксиапатиту, можна було припустити, що OP залучений до зв'язування остеокластів на мінералізованою поверхні кістки (Graig A., et al., 1989). Дійсно, пізніше було показано зв'язування остеокластів з OP, нанесеним на поверхню зі скла та пластику (Oldbarg A., et al., 1986). У ряді наступних експериментів було також виявлено, що зв'язування ізольованих остеокластів з OP може інгібувати синтетичним пептидом RGD, але не контрольним RGE, а також моноклональними антитілами до фрагмента амінокислотної послідовності OP, яка містить RGD-консенсусний сайт (Bautista D., et al., 1994). Функціональна роль RGD-структури була додатково підтверджена створенням шляхом сайт-спрямованого мутагенезу форм OP людини з амінокислотними замінами (Xuan J., et al., 1994). Отримані дані спонукали деяких дослідників спробувати визначити тип і суб'едінічний склад залученого у взаємодію з OP інтегринів остеокластів. Проведені дослідження показали, що тільки антитіла до avb3-інтегринів інгібувати зв'язування клітин з OP. Ці дані показують, що зв'язування ізольованих остеокластів з OP, мабуть, опосередковується avb3-інтегринів (Bautista D., et al., 1994). Даний тип інтегринів є рецептором вітронектіна і, як було раніше продемонстровано, локалізується на мембрані ізольованих остеокластів-подібних гігантських клітинах людини. Можливо, що мікрооточення на поверхні остеокластів може індукувати специфічну конформацію avb3-інтегринів, яка дозволяє йому зв'язуватися тільки з OP, тобто специфічність клітинного зв'язування може бути Високовибірково (Cheng S., et al., 2001).

Цікаво, що в області проксимальної OP за RGD-послідовністю знаходиться сайт розщеплення тромбіном.

Як показали проведені за останні кілька років дослідження, що відбувається in vivo розщеплення OP тромбіном має істотне фізіологічне значення (O'Regan A, Berman J. 2000; Denhardt D., et al., 2001; Yokasaki Y, Sheppard D., 2000; Asou Y., et al., 2001).

Зокрема, отримані дані дозволили переконливо продемонструвати, що на відміну від нативного OP, його N-термінальний фрагмент, який містить RGD-домен, підтримує адгезію ліній клітин меланоми. Це передбачає, що деякі адгезивні властивості OP контролюється через розщеплення тромбіном. Було також виявлено, що OP містить приховані сайти зв'язування, які можуть взаємодіяти з відмінними від avb3 типами рецепторів. Згодом були ідентифіковані нові рецептори інтегрінового ряду (avb1, avb5, a4b1, a5b1, a8b1, a9b1) (Smith LL, et al., 1996; Bayless KJ, Davis GE., 2001) та інших видів (CD44v6, CD44v7) (Wittig, BM, et al., 2000; Lin, YH et al. 2000), що відповідають за взаємодії OP з поверхнею різних типів клітин.

Список літератури:  Herring G.M. The organic matrix of bone.// The Biochemistry and      Physiology of bone., 1972., G.H. Bourne, Ed. V. 1., P. 127 - 189.,      Academic Press., New York.  Oegema T., Hascall V., Dziewiatkowski. Isolation and      characterization of proteoglycans from the Swarm rat chondrosarcoma.//      J.Biol.Chem., 1975., V.250., P. 6151 - 6159.  Oldbarg A., Franzen A., Heinegard D. The Primary Structure of a      Cell-binding Bone Sialoprotein.// J. Biol. Chem., 1988., V. 263., P. 19430      - 19432.  Franzen A., Heinegard D. Isolation and characterisation of two      sialoproteins present only in bone calcified matrix.// Biochem. J., 1985.,      V. 232., P. 715 - 724.  Miyazaki Y., Setoguchi M., Yoshida S., Higuchi Y., Akizuki S.,      Yamamoto S.// J. Biol. Chem., 1990., V. 265., P.14432 - 14438.  Hijiya N. , Setoguchi M., Higuchi Y., Akizuki S., Yamamoto S.      Cloning and characterization of the human osteopontine gene and its      promoter.// Biochem. J., 1994., V. 303., P. 255 - 262.  Heinegard D., Hultenby K., Oldberg A., Reinolt F., Wendel M.      Macromolecules in bone matrix.// Connect. Tissue Res., 1989., V.21., P. 3      -14.  Ruoslahti E., Pierschabacher M. New perspectives in cell adhesion:      RGD and integrins.// Science, 1987., V.238., P. 491 - 497.  Nemir M., DeVouge W., Mukherjee B. Normal rat kidney cells secrete      both phosphorylated and nonphosphorylated forms of osteopontin showing      different physiological properties.// J. Biol. Chem., 1989., V. 164.,      P.18202 - 18208.  Nishio S, Hatanaka M, Takeda H, Aoki K, Iseda T, Iwata H, Yokoyama      M. Calcium phosphate crystal-associated proteins: alpha2-HS-glycoprotein,      prothrombin F1, and osteopontin.// Mol. Urol., 2000, V.4., P. 383 - 390.  Nomura S., Wills A., Edwards D., Hearth J., Hogan B. Developmental      expression of 2ar (osteopontin) and SPARC (osteonectin) RNA as revealed by      in situ hybridization.// J. Cell Biol., 1988., V. 106., P. 441 - 450.  Patarca R., Freeman G., Singh R., Wei F., Durfee T., Blattner F.,      regner D., Kozak C., Mock B., Morse H., Jerells T., Cantor H. Structural      and functional studies of the early T-lymphocyte activation 1 (Eta-1)      gene.// J. Exp. Med., 1989., V. 170., P. 145 - 161.  Sendger D., Perruzzi C., Gracey C., Papadopoulos A., Tenen D.      Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation. Close      homhlogy with plasma proteins cleaved during blood coagulation.// Cancer      Res. 1988., V.48., P. 5770 - 5774.  Nemoto H, Rittling SR, Yoshitake H, Furuya K, Amagasa T, Tsuji K,      Nifuji A, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin deficiency reduces experimental      tumor cell metastasis to bone and soft tissues.// J. Bone Miner Res.,      2001., V.16 P. 652 - 659.  Heingard D., Jirskog-Hed A., Oldberg A., Reinholt F., Weindel M.      Bone macromolecules.// Calcium Regulation and Bone Metabolism. Basic and      Clinical Asprct., DVCohn, FHGloriex & TJMartin, Eds., 1990., V.      10., P. 181 - 187, Excerpta Medica., Elsevier., Amsterdam.  Oldberg A., Jirskog-Hed B., Axelsson S., Heinegard D. Regulation      of bone sialoprotein (BSP) mRNA by steroid hormones.// J. Cell Biol.,      1989., V. 109., P. 3183 - 3186.  Graig A., Smith J., Denhardt D. Osteopontin, a      transformation-associated cell adhesion phosphoprotein, is induced by      12-O-tetradecanolphorbol-13-acetat in mouse epidermis.// J. Biol. Chem.,      1989., V. 164., P. 9682 - 9689.  Oldbarg A., Franzen A., Heinegard D. Cloning and sequence analysis      of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp      cell-binding sequence.// PNAS USA, 1986., V. 83. P. 8819 - 8823.  Bautista D, Xuan J., Hota C., Chambers A., Harris J. Inhibition of      Arg-Gly-asp (RGD)-mediated Cell Adhesion to osteopontin by a Monoclonal      antibogy against Osteopontin.// J. Biol. Chem., 1994., V. 269., P. 23280 --      23285.  Xuan J., Hota C., Chambers A. Recombinant GCT-human Osteopontin      Fusion Protein Is functional in RGD-Depended Cell Adhesion.// J. Cellular      Biochemistry, 1994., V.54., P. 247 - 255.  Cheng S., Lai C., Blystone S., Avioli L. Bone mineralization and      osteoblast differentiation are negatively modulated by integrin avb3.// J.      Bone Miner Res., 2001., V. 16., P. 277 - 288.  O'Regan A, Berman J. Osteopontin: a key cytokine in cell-mediated      and granulomatous inflammation.// Int. J. Exp. Pathol., 2000, V. 81., P.      373 - 390.  Denhardt D., Giachelli C., Rittling R. Role of osteopontin in      cellular signaling and toxicant injury./Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.,      2001, V.41, P.723 - 749.  Yokasaki Y, Sheppard D. Mapping of the cryptic integrin-binding      site in osteopontin suggests a new mechanism by which thrombin can      regulate inflammation and tissue repair.// Trends Cardiovasc. Med., 2000.,      V.10. P.155 - 159.  Asou Y, Rittling SR, Yoshitake H, Tsuji K, Shinomiya K, Nifuji A,      Denhardt DT, Noda M. Osteopontin facilitates angiogenesis, accumulation of      osteoclasts, and resorption in ectopic bone.// Endocrinology 2001., V.      142., P. 1325 - 32.