Клонування та аналіз генів легких ланцюгів імуноглобулінів стерляді

ЗМІСТ

СПИСОК
СКОРОЧЕНЬ ................................................. ................. ............................ 3

ВСТУП ............. .................................................. ..... .................................................. ....... 4

ПЕРЕГЛЯД
ЛІТЕРАТУРИ ................................................. ................. .................................... 5
БУДОВА
Імуноглобулін ................................................. ........... ....................... 5
Геномної ОРГАНІЗАЦІЯ та Експрес
Генов L-КІЛ ІГ У
ССАВЦІ ................................................. .............. ..... 7
Геномної ОРГАНІЗАЦІЯ та Експрес
Генов L-КІЛ ІГ у нижчих
Хребетний ................................................. ..... 11
ЕВОЛЮЦІЯ Генов L-КІЛ
ІГ ................................................. ......................... ............. 19

МАТЕРІАЛИ І
МЕТОДИ ................................................. ..................... ..................... 24
Електрофорез
ДНК ................................................. ........................ ................................... 24
Виділення ДНК З
Геля ................................................. ....................... ......................... 24
ОТРИМАННЯ РАДІОАКТИВНИХ
ЗОНД ................................................. ..................... 25
ВИДІЛЕННЯ плазмідної
ДНК ................................................. ........................ ............. 26
ОЧИЩЕННЯ плазмідної ДНК метод рівноважної
Центрифугування У градієнт щільності
CsCl ........................................ 26
ТРАНСФОРМАЦІЯ прокаріотів
Клітин ................................................. .. 27
ВИДІЛЕННЯ лейкоцитів з КРОВІ
РИБ ................................................. ................ 28
ВИДІЛЕННЯ Сумарна РНК З
Лейкоцити ................................................. .... 28
ВИДІЛЕННЯ Високомолекулярні ДНК
З Еукаріотичні
Клітин ................................................. ..................... ............... 28
КОНСТРУЮВАННЯ БІБЛІОТЕКИКомплементарна ДНК ................................................. ..................... 29

Полімеразна ланцюгова
РЕАКЦІЯ ................................................. .................... .......... 33
СУБКЛОНІРОВАНІЕ
ДНК ................................................. ........................ .......................... 34
СКРИНІНГУ БІБЛІОТЕКИКомплементарна ДНК ................................................. ....................... ................ 34
ВИЗНАЧЕННЯ нуклеотидну послідовність
ДНК ............................. 35
Саузерн блот
Гібридизація ................................................. ............... ..................... 36

РЕЗУЛЬТАТИ .................... .............................................. .................................................. .38
КОНСТРУЮВАННЯ БІБЛІОТЕКИ Комплементарна ДНК ТА ЇЇ
СКРИНІНГУ ..................................... 38
Визначення первинної
СТРУКТУРИ ................................................. .................. ... 40
ПОРІВНЯЛЬНИЙ АНАЛІЗ ПЕРВИННИЙ
СТРУКТУРИ .............................................. 40
АНАЛІЗ геномної
ОРГАНІЗАЦІЇ ................................................. ................ ............. 41

ОБГОВОРЕННЯ ............................ ...................................... .................................................. 46

ВИСНОВКИ ......................................... ............................. .................................................. ....... 48

СПИСОК
ЛІТЕРАТУРИ ................................................. ................. .............................. 49

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

ІГ імуноглобуліни Пн пар нуклеотидів ТПН тисяч пар нуклеотидів Е.А. одиниця активності

ІПТГ ізопропілтіогалактозід
ТЕМЕД N, N, N, 'N'-тетраметил-етилен-діамін трис трис (гідроксиметил) амінометан дНTФ дезоксіаденозінтріфосфат ддНТФ дідезоксінеклеотідтріфосфат дНТФ дезоксінуклеотідтріфосфат рATФ рібоаденозінтріфосфат

ДТТ дітіотрейтол
Na2ЕДТА етілендіамінтетраацетат натрію

SDS додецилсульфат натрію

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-індол-бета-D-галактозид

ВСТУП

В основі функціонування гуморального імунітету у ссавцівлежить складний комплекс молекулярно-генетичних і фізіологічнихмеханізмів, що забезпечують реорганізацію, мутагенезу і клонального експресіюгенів імуноглобулінів. Виникнення цієї підсистеми імунітету пов'язуютьз появою хрящових риб.

На ранніх етапах еволюції гени ІГ були організовані у виглядіповторюваних кластерів VJC генних сегментів. При подібній організаціїрізноманітність продукуються антитіл грунтувалося, перш за все, накількості тих, що були в геномі кластерів, кожен з яких кодували одинваріант поліпептидних субодиниць ІГ. У ході подальшої еволюції ставсяперехід від кластерної до сегментарної організації, що забезпечуєдодаткове джерело різноманітності за рахунок комбінатівной рекомбінаціїгенних сегментів. Передбачається, що цей перехід також мав важливезначення для регуляції експресії генів і здійснення механізмівклонального відбору антітелопродуцірующіх клітин під час імунної відповіді.

Ця робота є частиною проекту, спрямованого навивчення еволюції механізмів ізотіпіческого виключення генів легких ланцюгів
ІГ у нижчих хребетних. Цілями роботи були вивчення структури йорганізації генів легких ланцюгів ІГ стерляді (Acipenser ruthenus),представника филогенетично древньої групи кістково-хрящових риб.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

БУДОВА Імуноглобулін

Імуноглобуліни виконують в організмі хребетних функцію гуморальнихантитіл та антиген-що зв'язують рецепторів В-лімфоцитів. Особливістю цьогокласу білків є велике розмаїття, що дозволяє їм вступати увзаємодія з фактично будь-якими біологічними макромолекулами.

Типова молекула ІГ складається з двох ідентичних важких (H) і двохідентичних легких (L) поліпептидних ланцюгів. H-і L-ланцюги побудовані здекількох доменів, кожен з яких складається приблизно з 110амінокислотних залишків. У ссавців існує п'ять класів H-ланцюгів:
(, M, (, (, і (. Кожна H-ланцюг побудована з одного N-кінцевого і декількох
(трьох або чотирьох) C-кінцевих доменів. N-кінцеві домени розрізняютьсярізних молекулах і називаються варіабельний (V) доменами. C-кінцеві доменимають однакову структуру у молекул одного класу і називаютьсяконстантними (С) доменами (мал. 1) (Пол, 1987).

Серед L-ланцюгів ссавців розрізняють два типи: лямбда і каппа.
Кожна L-ланцюг складається з одного варіабельності і одного константноїдоменів. В індивідуальній молекулі ІГ присутній тільки один тип L-ланцюги
(Roitt et al., 1993).

Гігантський різноманітність ІГ забезпечується перш за все тим, що V і Cобласті кодуються різними генами (генними сегментами), фізичнорознесеними в зародковій ДНК.
У формуванні варіабельних доменів H-ланцюгів беруть участь три генних сегменти:варіабельний (V), D-сегмент (від англ. diversity-різноманітність) і J-сегмент
(від англ. joining-з'єднує). З-області Н-ланцюгів різних класівкодуються окремими генами (Roitt et al., 1993).

Рис. 1. Схема будови молекули імуноглобуліну.

Типова молекула імуноглобуліну містить дві ідентичні легкі (L)і дві ідентичні важкі (H) ланцюга, пов'язані між собою ковалентнодисульфідними зв'язками. Кожна L-ланцюг складається з одного варіабельний (VL) іодного константної (СL) домену. Н-ланцюг складається з одного VH і декількох
CН доменів.

У формуванні зрілого гена L-ланцюги беруть участь три генних сегменти: V -сегмент і J-сегмент кодують V-домен, C-сегмент кодує константних домен.
На пізніх стадіях розвитку В-лімфоцита генні сегменти, що кодуютьваріабельні домени, об'єднуються в різних поєднаннях, утворюючи матрицюдля експресії L-і H-кіл (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984).

геномної ОРГАНІЗАЦІЯ та експресії генів L-КІЛ ІГ у ссавців

Різні види ссавців мають схожу схему організації таекспресії генів ІГ. Одним з найбільш вивчених у цьому відношенні видівє людина. Лямбда і каппа ланцюга ІГ у людини кодуються генами,розташованими в різних локусах і на різних хромосомах. Каппа локус складаєтьсяз великої кількості V (генних сегментів, зібраних в групи, п'яти J (іЗ одного (сегмента.. Такий тип організації називається сегментарним (мал.
2). Лямбда локус складається з групи V (сегментів, точна кількість якихневідомо, і семи пар J (-C (сегментов. Три з них (JC (4 - JC (6) єпсевдогенамі (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).

У процесі розвитку В-лімфоцита в кровотворних органах один з Vсегментів з'єднується з одним з J сегментів за допомогою сайтспеціфіческойрекомбінації (Schatz et al., 1992). До цього процесу залучаються спеціальніОлігомерні послідовності: гептил-і нонамери, фланкуючі з 3 'боку V сегмент і з 5 'боку J сегмент (мал. 3) (Aguilera et al., 1987;
Hesse et al., 1989). Відмінною особливістю лямбда і каппа локусівє конфігурація проміжків між гептил-і нонамерамі, званихспейсерами. З V і J генними сегментами лямбда типу асоційовані 23 Пн і 12Пн спейсера відповідно, а з V і J сегментами каппа типу - 12 Пн і 23 Пнспейсера (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).

Рис. 2. Схема будови лямбда і каппа локусів генів L-ланцюгів ІГлюдини.

Лямбда локус містить багато V (сегментів і сім парблизькорозташованих J (-C (. Три з них яляюся псевдогенамі ((). Каппа локусмістить багато V (п'ять J (і один C (генний сегмент (Hieter et al., 1981;
Roitt et al., 1993).

Позначення: - сигнальні олігомери.

Рис. 3. Схема розташування олігонуклеотидних послідовностей,задіяних у сайтспеціфіческой рекомбінації в каппа локусіссавців. Ці послідовності фланкують з 3 'боку VL сегмент із 5 'боку JL сегмент. Під час рекомбінації гептамер і нонамер одного з
VL сегмента об'єднуються з гептамером і нонамером одного з JL сегмента.
Це робить можливим підключення VL і JL сегментів без порушення рамкитрансляції (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989).

Позначення: - сигнальні олігомери.

Послідовність, у якій рекомбінують локуси L-ланцюгів, строгоупорядкована в часі. Показано, що першими перебудовуються локуси каппатипу, причому якщо в одній хромосомі перебудова виявилася нефункціональною,тобто не призвела до появи повноцінного гена, то рекомбінація відбуваєтьсяв каппа локусі на гомологічною хромосомі. У разі повторної абортивноїперебудови аналогічно відбуваються перебудови в лямбда локусах. Якщо вклітці непродуктивно перебудувалися всі чотири локусу, то вона превращатся в
0-клітку і піддається апоптозу. Якщо ж перебудова одного з локусівпривела до утворення функціонального гена, то рекомбінація іншихлокусів блокується. Деталі механізму блокування невідомі, протевстановлено, що необхідною умовою для нього є транскрипціяпродуктивно перебудованого гена. В результаті в кожному індивідуальномулімфоцит синтезується тільки один тип L-ланцюгів, каппа або лямбда, іекспресія гена відбувається тільки на одній з двох гомологічних хромосом.
Ці феномени, що називаються ізотіпіческім і алельних винятками лежать воснові ключового принципу функціонування імунної системи - принципуклонального селекції (Пол, 1987; Strob, 1987).

В організмі ссавців генерується понад десять мільйонівваріантів антитіл, хоча в геномі міститься значно менша кількістьгенних сегментів, які можуть брати участь у формуванні варіабельнихдоменів. У випадку L-ланцюгів, основним джерелом різноманіття єкомбінатівное поєднання V і J сегментів. Додатковим джерелом єзсув рекомбінаційні рамки у місці їх з'єднання. Крім того, V геннісегменти можуть обмінюватися ділянками ДНК з псевдогенамі за допомогою генноїконверсії. Дуже істотний внесок у різноманітність специфічність антитілвносить соматичне мутірованіе варіабельних генних сегментів в сайтах,беруть участь у формуванні антігенсвязивающего центру. Соматичнерізноманітність генерується при вторинному імунній відповіді шляхом включеннягіпермутаціонного механізму в клітинах пам'яті в зародкових центрахлімфатичних вузлів (Tonegawa 1983; Roitt et al., 1993).

геномної ОРГАНІЗАЦІЯ та експресії генів L-КІЛ ІГ у нижчих
Хребетний

Хрящеві риби.

Гуморальний імунну відповідь у вигляді специфічних антитілвиявляється тільки у хребетних. Найбільш примітивними видами, уяких виявлено здатність синтезувати ІГ, є хрящові риби.
Представники трьох основних таксонів (акули, скати і химери) продукуютьантитіла у відповідь на введення широкого спектра антигенів. Однак, на відмінувід ссавців, гетерогенність сироваткових антитіл у хрящових рибвиражена дуже слабо. Крім того, у них не виявлено дозрівання імунноївідповіді - при повторному введенні антигену спектр антитіл не змінюється
(Flajnik, 1996). Результати досліджень останніх років продемонстрували,що організація генів ІГ у хрящових риб також має яскраво вираженіособливості.

У хрящових риб виявлені гени трьох типів L-ланцюгів, що локалізуються врізних локусах. У кожному локусі гение сегменти організовані в кластери,мають по одному V, J і C генному сегмента (рис. 4). Таких кластерівміститься кілька десятків або навіть сотень в одному локусі на відстані
12-15 ТПН один від одного (Rast et al., 1994).

Гени першого типу знайдені у разнозубой акули (Heterodontus francisci)
(Shamblott and Litman, 1989) та малого ската (Raja erinacea) (Anderson etal., 1995). У акули кластери мають розмір 3-6 ТПН. V і J, J і C геннісегменти розділені приблизно 0,5 і 4 ТПН відповідно. У ската V і Jсегменти злиті в зародковій ДНК.

Гени другого типу виявлені у плямистої химери (Hydrolagus colliei)
(Maisey, 1984), піщаної акули (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al.,
1992; Hohman et al., 1993), разнозубой акули та малого ската (У всіхвивчених видів у кластерах цього типу V і J генні сегменти з'єднані вжев зародковому геномі. V і C гeнние сегменти розділені 2-3 ТПН.

Рис. 4. Схема будови локусів генів L-ланцюгів ІГ у акули.

Організація генів у акули має кластерний тип. Кожен кластер маєрозмір 3 - 6 ТПН і містить по одному VL, JL і CL генному сегменту.

Виявлено три типи генів L-ланцюгів ІГ. Локуси генів першу і третютипів мають схожу організацію. У цьому випадку VL і JL, JL і CL сегментирозділені приблизно 0,5 і 4 ТПН відповідно (А) (Rast et al., 1994).

У локусі генів другого типу VL і JL сегменти з'єднані вже взародковому геномі (Б).

Третій тип генів L-ланцюгів знайдений в акули-няньки (Gynglimostomacirratum) (Greenberg et al., 1993) і разнозубой акули (Rast et al., 1994).
У кластерах цього типу V і J, J і C генні сегменти розділені, як і вкластерах першого типу, приблизно 0,5 і 4 ТПН відповідно. V і J геннісегменти фланкують сайтами специфічної рекомбінації з спейсерами 12 і
23 пн, що відповідає конфігурації спейсерів в локусах каппа типуссавців. За первинної структурі гени третього типу теж найбільшблизькі до генів капа типу вищих хребетних (гомологія по амінокислотноїпослідовності становить близько 60 %).

Гени цих трьох типів мають між собою низький ступінь гомології: 40 -
50% у нуклеотидної послідовності З сегментів і 50-60% упослідовності V сегментів (Hohman et al., 1993).

Отримані дані показують, що у хрящових риб є дужевелика кількість генних сегментів. Однак специфіка організації геніввиключає комбінатівное поєднання сегментів. Все розмаїття антитіл ухрящових риб формується тільки за рахунок експресії великої кількостікластерів.

Дані про нуклеотидних послідовностях з різних локусів виявилинизьку гетерогенність генів (85-95%), що вказує на відсутністьсоматичного мутагенезу (Rast et al., 1994).

костисті риби.

Аналіз сироваткових антитіл печерного сомика (Ictalurus punctatus)показав наявність трьох типів L-ланцюгів з різними молекулярними масами: 26,
24 і 22 кДа. Два види антитіл миші, 3F12 і 1G7, захоплюють більше 90% відзагальної кількості імуноглобулінів у реакції іммунопреціпітаціі. При цьому
3F12 антитіла зв'язуються з молекулами, що містять L-ланцюги масою 24 і 22кДа, а 1G3 антитіла з іншого субпопуляцій, що містить L-ланцюги масою 26кДа. На основі цих даних L-ланцюги поділяють на два класи, звані F і G
(Lobb et al., 1984).

геномної організація локусу L-ланцюгів G типу має кластерний тип (рис.
5). У кожному кластері міститься по одному J і C сегменту і два V сегм.
Варіабельні генні сегменти розташовані завжди в протилежнійтранскрипційної полярності до J і C сегментами. У ряді геномних клонів один
V сегмент розташовувався з 3 'сторони від C генного сегмента. Розмір кластерадорівнює приблизно 3 ТПН, відстань між кластерами близько 6 ТПН (Ghaffari and
Lobb, 1993; Bengten, 1994).

Хоча гени L-ланцюгів сомика мають низьку гомології з генами іншиххребетних (40-50% по нуклеотидної послідовності), їх можна віднести докаппа типу вищих хребетних, так як схожість з первинної структурі злямбда типом нижче. Крім того, конфігурація спейсерів має характер каппатипу: 12 пн спейсер асоційований з V, 23 пн спейсер з J сегментом (Ghaffariand Lobb, 1993).

У райдужної форелі (Oncorhynchus mykiss), представника іншогосімейства костистих риб, також виявлено два типи L ланцюгів (Daggfeldt etal., 1993). Один з них (L1) високогомологічен G типу сомика за структурою Vі C областей та відповідний локус має подібну організацію.

Мабуть, у цих видів об'єднання V і J сегментів відбуваєтьсятільки за рахунок інверсій з відновленням єдиної полярності транскрипції.
Різноманітність варіабельних доменів утворюється в результаті комбінатівногопоєднання V і J сегментів у межах одного кластеру. Не виключається, що вперебудови можуть залучатися і сусідні кластери.

Цікавою особливістю костистих риб є дуже високапропорція мРНК, що представляє так звані стерильні транскрипти
(Ghaffari and Lobb, 1993). Ці транскрипти включають в себе тільки С -сегменти і фланкуючі їх 5'і 3'-нетрансліруемие ділянки. Кількістьстерильних транскриптів у сомика і форелі в 5 разів перевищує кількістьповних VJC-транскриптів.

Рис. 5. Геномної організація локусу генів L-ланцюгів ІГ у печерногосомика.

Генні сегменти організовані в кластери. Кожен кластер містить два
VL і по одному JL і CL сегменту і має розмір близько 5 ТПН. Відстаньміж JL і CL близько 1000 Пн, VL сегменти віддалені від 5 'кінця JL сегмента на
3 ТПН. VL сегменти завжди розташовані в протилежній транскрипційноїполярності по відношенню JL і CL сегментами (Ghaffari and Lobb, 1993).

Амфібії.

У шпорцевой жаби (Xenopus laevis) виявлено три сімейства генів L -ланцюгів ІГ, що кодують три різних ізотипи: L1 (ро), L2 (сигма) і L3 (мал.
6).

Всі три локусу мають сегментарний характер організації. L1 локусмістить множинні VL1 сегменти, розділені в геномі 2.1 - 3.6 ТПН,п'ять JL1 сегментів, три з яких ідентичні, і один CL1 генний сегмент
(Stewart et al., 1993). JL1 і VL1 сегменти фланкують канонічними гептил-і нонамернимі сигнальними послідовностями, розділеними 12 Пн у VL1 і
23 Пн у JL1 сегментів (Sakano et al., 1980).

Локус генів другого типу розділяється на два сімейства, (1 і (2,які в геномі розташовуються окремо. Геном жаби міститьмножинні V (1 і кілька V (2 гених сегментів, одну пару J (1-C (1 і пару
J (2-C (2 (Schwager et al., 1991). Розташування генів цього типу одинщодо одного точно не визначено.

Нещодавно був виявлений третій тип генів L-ланцюгів у жаби. У геноміжаби міститься шість сімейств V сегментів цього типу. Загальна кількість
VL3 елементів складає щонайменше 30 копій. Кожен VL3 елемент можерекомбінувати з однією з двох пар JCL3 генних сегментів (Haire et al.,
1996).

Гени трьох типів значно різняться: гомологія на амінокислотноїрівні становить приблизно 30% (Zezza et al., 1991). У той же час,ряд ознак дозволяє співвіднести гени L1 і L3 типу з каппа і лямбда типамиссавців.

Родина генів першого типу можна віднести до каппа типу з кількохпричин (Zezza et al., 1992): а) висока гомологія первинної структури
(більше 50%); б) істотна подібність геномної організації локусу (багато
VL1 і один CL1 генний сегмент); в) кофігурація спейсерів між гептил-інонамеримі відповідає каппа типу; г) JL1 і CL1 генні сегменти розділеніприблизно 3.5 ТПН, що приблизно дорівнює відстані між JL (і CL (елементами людини (Sakano et al., 1979; Hieter et al., 1982) ізначно більше ніж відстань між JL (і CL (ссавців (Blomberget al., 1982; Udey, 1987).

Рис. 6. Геномної організація локусу першого і третього типів генів L -ланцюгів ІГ у шпорцевой жаби.

Локус сімейства L1 містить множинні VL1 сегменти, п'ять JL1і рівний обсяг трис-сольового буфера (TBS) (0,14 М NaCl, 5 мМ KCl,
25 мМ трис-HCl, рН 7,4). Суміш наносили при кімнатній температурі на рівнийобсяг середовища для виділення лейкоцитів, що містить 24 частини 9% фікола і 10частин 34% верографина. Після центрифугування при 400 g протягом 30 хввідбирали шар лейкоцитів і розводили у великому об'ємі буфера TBS. Післяповторного центрифугування при 300 g протягом 40 хв для лізисузалишкових еритроцитів клітини суспендованих в розчині, що містить 9обсягів 0,83% розчину NH4Cl і 1 обсяг 2,06% розчину трис-HCl, рН 7,62, доконцентрації 108 кл/мл і додавали 5 обсягів середовища. Після осадження клітинпри 300 g протягом 10 хв процедуру очищення повторили (Фрімель, 1987).

ВИДІЛЕННЯ Сумарна РНК З Лейкоцити

Осад лейкоцитів після виділення і очищення суспендованих в 10обсягах (1 мл) розчину 1, що містить 4 М гуанідинів тіоціанат, 25 мМ цитратнатрію, рН 7,0, 0,5% Саркозі та 0,1 М 2-меркаптоетанол, при кімнатнійтемпературі. Потім додавали 0,1 мл 2 М розчину NaAc, рН 4,0, 1 мл фенолу,
0,2 мл хлороформу і примушували. Потім центріфугіровалі при 10000 g впротягом 20 хв при 4оС, відбирали водну фазу, додавали до неї рівний об'ємізопропанол і облягали РНК центрифугуванням при 15000 g протягом 15 хвпри 4оС (Chomczynski and Sacchi, 1987).

ВИДІЛЕННЯ Високомолекулярні ДНК З еукаріотів,

1 г печінки стерляді, замороженої у рідкому азоті, розтирали в тонкийпорошок і гомогенізувати в 15 мл розчину, який містить 0,5 М Na2ЕДТА, рН
8,0, 0,5% Саркозі, 100 мкг/мл протеїнази К і нагрітого до 65оС. Потімінкубувати при 50оС протягом 3 годин при легкому погойдуванні. Потім,уникаючи різких струшування, екстрагувати ДНК рівним об'ємом фенолу трирази, щоразу розділяючи фракції центрифугуванням при 4000 g та кімнатноготемпературі. Фенол попередньо очищали перегонкою і насичували буфером,містить 1 М трис-HCl, один раз і два рази буфером, що містить 0,1 М трис-
HCl і 0,1% 2-меркаптоетанол. Діаліз ДНК проводили при 10оС протягом 12годин проти 4 л буфера, що має склад:
50 мМ трис-HCl, рН 8,0,
10 мМ Na2ЕДТА,
10 мМ NaCl.

Потім обробляли пробу РНКази, вільної від ДНКази, при 37оС впротягом 1 години в концентрації 100 мкг/мл. Після цього екстрагувати ДНКрівним об'ємом суміші фенол-хлороформ (1:1) два рази і проводили діаліз при
10оС протягом 36 годин проти 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ
Na2ЕДТА, рН 7,5), змінюючи буфер через кожні 12 годин (Маніатіс та ін, 1984).

КОНСТРУЮВАННЯ БІБЛІОТЕКИ Комплементарна ДНК

Виділення полі (A) + РНК.

Для інгібування РНКази всі розчини, що не містять трис,обробляли 0,1% діетілпірокарбонатом 12 годин при 37оС і автоклавування.
Посуд прожарюють при 250оС протягом 4 годин. Полі (A) + РНК виділяли зсумарної РНК лейкоцитів стерляді методом хроматографії на оліго (dT) --целюлозі. Для цього РНК розчиняли у воді, прогрівали при 65оС протягом 5хв, додавали рівний об'єм 2-кратного буферу для нанесення РНК (40 мМ трис-
HCl, рН 7,6, 1 М NaCl, 2 мМ Na2ЕДТА, 0,2% SDS) і тричі пропускали черезколонку з оліго (dT)-целюлозу. Потім промивали колонку 5-10 обсягамибуферу для нанесення і 4 обсягами цього ж буфера, що містить 0,1 М NaCl.
Ост