Кафедра клінічної фармакології та антимікробної хіміотерапії Смоленської державної медичної академії

Контактна адреса: Дехніч Андрій Володимирович
214019, Смоленськ, а/с 5, Факс: (0812) [email protected]

УДК 615.33.015.8.07

Виявлення резистентності до метициліну та іншим b-лактамних антибіотиків методом скринінгу

З моменту появи в 70 -- х роках метіціллінорезістентние стафілококи іперш за все метіціллінорезістентние штами Staphylococcus aureus (MRSA)є одними з провідних збудників нозокоміальних інфекцій. Частота
MRSA в структурі стафілококових інфекцій в останні роки різко зрослав усьому світі, наприклад, у США з 2% у 1975 р. до 35% в 1996 р.
Резистентність стафілококів до оксациллину (метициліну) може бутизумовлена трьома основними механізмами: o продукцією додаткового пеніцилінзв'язуючими білка (ПСБ) - ПСБ-2а

(ферменту, який бере участь у синтезі клітинної стінки), кодованого хромосомальним геном mecА - класична, або істинна резистентність до метициліну (оксациллину); o інактивацію внаслідок гіперпродукції бета лактамаз; o модифікацію нормальних ПСБ.

З клінічної точки зору, важливо диференціювати штами з класичної
(mecА-обумовленої) резистентністю від штамів з двома іншимиредковстречающіміся механізмами резистентності, обумовлюють низький абоприкордонний рівень стійкості. Це пов'язано з тим, що при інфекціях,викликаних штамами з mecA-обумовленої резистентністю, терапія бета -лактамними антибіотиками (пеніцилінами, цефалоспоринами, карбапенемов)буде неефективна.
Крім того, ці штами часто бувають резистентні практично до всіх іншихкласів антибіотиків за винятком глікопептидів (ванкоміцин,тейкопланін). Фенотипічні характеристики, які можуть допомогтидиференціювати три перерахованих механізму резистентності, викладені втаблиці.

ТИПИ резистентних до метициліну (оксацилін) У Стафілококи

Штами з класичним типом резистентності можуть у свою чергу бути гомо -або гетерогенними за типом експресії стійкості. При гомогенному типіекспресії практично всі мікробні клітини проявляють резистентність достандартних тестах in vitro, у той час як при гетерогенному типі тількиневелика частина клітин виявляє резистентність фенотипно. Нерідкотільки 1 з 10-100 млн клітин в популяції з наявністю гена mecАекспресують резистентність, що обумовлює отримання прикордоннихрезультатів при визначенні чутливості до оксациллину (МПК - 2-8мг/л). Резистентність, обумовлена гіперпродукцією b-лактамаз і мутацієюнормальних ПСБ, також призводить до отримання прикордонних значень МПК. Однакрезистентність до оксациллину, обумовлена гіперпродукцією b-лактамаз,легко відрізняється від класичної резистентності за її оборотності привикористанні інгібіторів b-лактамаз.
На відміну від штамів з класичною резистентністю гіперпродуценти b -лактамаз і штами з мутаціями нормальних ПСБ зазвичай не мають множинноїрезистентності до інших антибіотиків.
Наявність класичної резистентності найбільш легко визначити методомскринінгу, тому що зростання мікробних клітин з некласичним типамирезистентності звичайно пригнічується.
Для визначення чутливості використовується оксацилін зважаючи на його більшевисокої стабільності при зберіганні в порівнянні з метициліну.

ПРИНЦИП
Для ідентифікації резистентності до оксациллину (метициліну) устафілококів необхідне дотримання наступних умов: o додавання 4% NaCl в агар з оксацилін (pH 7,2-7,4, тому що при більш низькому pH збільшується число помилково негативні результати); o температура інкубації 35oС; o тривалість інкубації 24 год для S. aureus і 48 год - для коагулазоотріцательних стафілококів; o стандартизоване кількість мікроорганізмів.

МІКРООРГАНІЗМІВ
Чиста культура Staphylococcus spp., Інкубувати протягом 18-24 год накров'яному агарі.

МАТЕРІАЛИ

1. Агар Мюллера-Хінтон з додаванням 4% NaCl (4 г на 100 мл середовища) і 6 мг/л оксациліну (0,6 мг на 100 мл середовища). Агар Мюллера-Хінтон зберігається при температурі 2-8oС, готується згідно прописи на етикетці, 4% NaCl додається до автоклавування.

2. Субстанція оксациліну з відомою активністю попередньо розчиняється в стерильної дистильованої воді (розрахунок концентрації оксациліну проводять з урахуванням його активності) і додається в охолоджений на водяній бані до 48-50oС агар Мюллера-Хінтон.

Приготовлений агар розливається по чашках з товщиною шару 3-4 мм (на чашку діаметром 100 мм - 25 мл). Готові чашки з середовищем зберігаються в пластикових пакетах при температурі 4-8oС не більше 5 діб.

3. Для контролю зростання необхідно також приготувати чашки з агаром, що містить 4% NaCl, але без антибіотика.

4. Кров'яний агар з чистою культурою стафілокока, інкубувати протягом 18 -24 год

5. Стерильний фізіологічний розчин.

6. Стандарт каламутності 0,5 по Мак-Фарланду.

7. Стерильні тампони або мікропіпетка (10 мкл).

8. Термостат з температурою інкубування 35oС.

КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ

Дослідження проводять при обов'язковому контролі росту досліджуваних культур наагарі Мюллера-Хінтон з 4% NaCl без оксациліну (культуру наносять так само,як на агар з оксацилін).
Контрольні штами:
S.aureus ATCC 38591 - резистентний;
S.aureus ATCC 29213 - чутливий.

ПОСТАНОВКА ТЕСТУ

Приготування інокулюму. Бактеріальну суспензія стафілокока готують здекількох колоній з однаковою морфологією з стерильного фізіологічномурозчині (3 мл) і доводять до каламутності 0,5 по Мак-Фарланду (1,5 · 108 КУО/мл).

Інокуляція. Метод I (мікропіпеткой):

1. приготувати розведення 1:100 стандартного інокулюму 0,5 по Мак-

Фарланду для отримання бактеріальної суспензії, що містить 1,5 · 106 КОЕ/мл

(наприклад, додати 0,1 мл стандартної суспензії до 9,9 мл стерильного фізіологічного розчину);

2. за допомогою мікропіпеткі нанести краплю (10 мкл) розведеною стандартної суспензії на поверхню агару з оксаціл Ліном.

Метод II (за допомогою тампона):

1. занурити стерильний ватний тампон в пробірку з стандартизованої суспензією (0,5 по Мак-Фарланду), потім віджати надлишок вологи об стінку пробірки;

2. торкнутися тампоном поверхні агару з оксацилін.

інкубації. Штами S.aureus інкубують при температурі 35oС протягомповних 24 год, а коагулазу (-) стафілококів - протягом 48 ч.
Примітка. Середа АГВ не може бути рекомендована для постановки тесту взв'язку з високою частотою псевдопозитивних результатів.

ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТУ

Інтерпретація: o поява видимого зростання більше 1 колонії на місці нанесення культури означає стійкість даного штаму до оксациллину (метициліну); o при відсутності зростання на місці нанесення культури досліджуваний штам враховується як чутливий до метициліну (оксациллину). o при сумнівних результатах, а також для штамів, виділених у хворих з клінічно неефективною терапією і у хворих з серйозними інфекціями, необхідно провести розгорнуте дослідження з визначенням МПК до оксациллину і гена mecA.

Представлення результату:

o S.aureus або коагулазу (-) стафілокок (S.epidermidis), чутливий до метициліну (оксациллину); o S.aureus або коагулазу (-) стафілокок (S.epidermidis), резистентний до метициліну (MRSA або MRSE ).

метициліну (оксацилін) резистентні стафілококи повинні розцінюватисяяк резистентні до всіх b-лактамами - пеніцилінів, цефалоспоринів,карбапенемов, комбінаціям пеніцилінів з інгібіторами b-лактамаз. Крімтого, серед метіціллінорезістентних стафілококів дуже часто спостерігаєтьсяасоційована резистентність до інших антибіотиків - аміноглікозидів,макролідів, хінолонів, тетрациклінів.

ОБМЕЖЕННЯ МЕТОДУ

1. Скринінг на агарі з оксацилін призначений для фенотипова визначення штамів, що мають ген mecA. Однак штами з іншими типами резистентності іноді можуть давати хибнопозитивний результат.

2. Метод скринінгу для виявлення резистентності до оксациллину

(метициліну) менш надійний у коагулазу (-) стафілококів, ніж у

S.aureus.
Примітка. Оксацилін у порівнянні з метициліну менш стабільний до діїстафілококових b-лактамаз, що може призвести до отримання більшої кількостіпсевдопозитивних результатів, ніж при використанні метициліну. У той жечас метіцилін у порівнянні з оксацилін значно менш стабільний призберіганні, що й обмежує його застосування.

ВАНКОМІЦІНОРЕЗІСТЕНТНИЙ Staphylococcus aureus

Про можливість появи ванкоміцінорезістентних штамів S.aureus стализамислюватися близько 10 років тому після спільнота ний про появу резистентностідо ванкоміцин у ентерококів.

Перше повідомлення про виділення метіціллінорезістентного S.aureus зі зниженоючутливістю до ванкоміцин (МПК 8 мг/л) з клінічного матеріалуз'явилося в 1996 р.

Незважаючи на значення МПК до ванкоміцин, відповідне діапазону помірноюрезистентності, цей штам був зареєстрований як VRSA
(ванкоміцінорезістентний S.aureus) через клінічної неефективностіванкоміцину. У цього штаму не було знайдено жодного з раніше відомихмеханізмів резистентності до ванкоміцин; відзначено тільки збільшення товщиниклітинної стінки і концентрації пеніцилін-зв'язуючих білків 2 і 2а.

Далі один за одним пішли повідомлення про виділення з клінічногоматеріалу штамів S.aureus з МПК до ванкоміцин 8 мг/л, позначених як
VISA (S.aureus зі зниженою чутливістю до ванкоміцин).

В результаті поглибленого дослідження ванкоміцінорезістентності у MRSA прискринінгу більш як 2000 штамів з різних стаціонарів було виявлено від
1 до 25% (!) Штамів з гетерогенної (індуцібельной) резистентністю дованкоміцин, експресуються її з частотою близько 1 клітини на 1 млн. Такіштами можуть бути предше ственнікамі VRSA.

Фахівці поки не прийшли до згоди, який термін використовувати: VRSA або
VISA. Це пов'язано з тим, що, незважаючи на значення МПК, що відповідаютьдіапазону помірної резистентності, в наявності клінічна неефективністьванкоміцину при терапії VRSA-і VISA-інфекцій.

Багато фахівців пропонують свої методи скринінгуванкоміцінорезістентності у стафілококів. Однак загальноприйняті стандартище не розроблені.

Таким чином, надзвичайно важливою є розробка методів лабораторноїдіагностики і моніторингу ванкоміцінорезістентності, особливо у пацієнтів,одержують або одержували ванкоміцин/тейкопланін, і при неефективностіцієї терапії.

Слід розробити методики контролю за VRSA-інфекціями. Дляпопередження розповсюдження VRSA необхідно ізолювати хворих іносіїв S.aureus. Крім того, застосування антибіотиків повиннопередбачати зниження числа необгрунтованих призначень ванкоміцину.

У Росії поки не описано жодного штаму S.aureus зі зниженоючутливістю до ванкоміцин. Найімовірніше це пов'язано з рідкіснимвикористанням ванкоміцину в клінічній практиці.