Трансгенні рослини як біопродуценти білків медичного призначення

Успіхи в галузі генетичної інженерії рослин відкрили нові можливості для отримання рекомбінантних білків. Для цієї мети широко використовуються клітини бактерій, дріжджів, ссавців і комах. Однак такі системи мають ряд істотних недоліків. У клітинах прокаріотів не відбуваються посттрансля-Ціон модифікація і правильне укладання (Фолдинг) поліпептидних ланцюгів багатьох еукаріотичних білків. Клітини дріжджів, ссавців і комах позбавлені подібних недоліків, але їх використання як біопродуцентов обмежено високою собівартістю виходу рекомбінантних білків (Russel, Clarke, 1999).

За порівнянні з вищезгаданими системами експресії рослини мають ряд особливостей і переваг. Перш за все необхідно відзначити, що в клітинах вищих рослин відбуваються глікозилювання і Фолдинг білків, подібні з таким в клітинах ссавців. Культивування рослин не вимагає доро-гостоящего обладнання, а сільськогосподарські масштаби продукції гарантують доступність реком-бінантного препарату в кількостях, достатніх для клінічних випробувань і широкого терапевтичного використання. На відміну від тварин, рослинні клітини не містять у своєму складі патогенні для людини віруси, а також пріони і, таким чином, можуть бути безпечним джерелом рекомбінантних білків медичного призначення. Хоча вартість виділення і очищення цільового білка з рослин-продуцентів може бути порівнянна з такою для інших систем, напрацювання сирого матеріалу обходиться значно дешевше. У ряді випадків, наприклад, шляхом використання трансгенних рослин в якості "їстівних вакцин" виділення білка в чистому вигляді не потрібно. У додаток до всього перенесення фраг-ментів екзогенної ДНК в рослинний геном і регенерація у рослин відбуваються значно простіше в порівнянні з тваринами (Daniell et al., 2001).

Відомо, що апарат транскрипції і трансляції у рослин є універсальним і може бути АДАП-тірован не тільки для накопичення гомологічних білків, не синтезованих даним видом рослини, але й для синтезу гетерологічних білків як бактеріального, так і тваринного походження. З іншого боку, самі рослини in vivo можуть служити сприятливим середовищем для розвитку різних організмів -- бактерій і вірусів, геном яких може бути модифікований і адаптований для синтезу відповідних гетерологіч-них білків. Аналізуючи дані літератури, необхідно відзначити, що пошук різних систем для експресії чужорідних генів за останні десять років було пов'язане з розвитком трьох основних підходів.

Першим з них був запропонований шлях використання трансгенних рослин, в ядерний геном яких Перене-сени гени, які контролюють синтез відповідних гетерологічних білків (De la Riva, 1998). Отримання таких рослин було засновано на природній здатності грунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens переносити частину своєї власної ДНК у вигляді Т-області мегаплазміди в рослинні клітини. Саме ця частина Ti-плазміди була використана вченими для перенесення генно-інженерних конструкцій, що включають різні цільові гени. У якості цільових можна було використовувати і гени гетерологічних білків медичне призначення. Необхідно зазначити, що використання тільки агробактеріальної переносу в значну ступеня звужувало коло рослин-реципієнтів і обмежувало його, як правило, до дводольних. Тому подальший розвиток ідеї використання рослинного геному для синтезу білків гетерологічних стимули-рова пошук нових способів переносу екзогенної фрагментів ДНК в геном рослин. Були розроблені мето-ди прямої доставки чужорідних генів в рослинний геном, такі, як мікроін'єкції (Neuhaus et al., 1987), електропорація (Fromm et al., 1985) і методи біобаллістікі (Klein et al., 1987). У цьому слу-чай для перенесення використовувалася очищена плазмідна ДНК, в якій містилися генетичні конструк-ції з цільовими генами.

При перенесення в геном рослини чужорідні гени, як правило, стабільно інтегруються і передаються по-Томка в наступних поколіннях згідно із законами Менделя (Horsch et al., 1984; Budar et al., 1986; De-roles, Gardner, 1988; Heberle-Bors et al. , 1988).

Хоча ідея впровадження екзогенної ДНК в рослинний геном для напрацювання відповідних продуктів в рослині представляється досить перспективною, цей підхід не позбавлений і деяких недоліків. Серед них необ-хідно відзначити низький рівень експресії перенесених генів, навіть для дуже сильних промоторів. Зміст сироваткового альбуміну людини в трансгенних тканинах тютюну склало 0,02% від сумарного білка (Sijmons et al., 1990). Ще менші значення були отримані для еритропоетину (0,003%) і b-інтерферону (0,001%) (Edelbaum, 1992; Kusnadi et al., 1997). Однією з причин цього, мабуть, є збільшення швидкості деградації мРНК чужорідно-го гена, коли її рівень досягає порогового значення. Цей механізм, можливо, служить одним зі способів захисту рослини від РНК-вірусів (Matzke et al., 1994; Matzke M., Matzke A., 1995; Vaucheret, 2001). Другою причиною низького рівня продукції є протеоліз чужорідних білків у цитоплазмі рости-котельної клітини. Введення в поліпептидних ланцюг цільового білка сигнальних послідовностей, направляю-щих його накопичення в ендоплазматичної мережі або секрецію в апопласт, де частота протеолізу значно нижче, дозволяє досягти підвищення продуктивності трансгенних рослин в 100 разів (Giddings et al., 2000; Menassa et al. , 2001). Експресія цільових білків у запасний тканини насіння, де рівень біодеградації нижче, ніж у обводнених тканинах (листя, плоди), сприяє підвищенню продуктивності на 2-3 порядки. Так, що містить жаніе химерного енкефалінів людини в насінні трансгенної A. thaliana склало 2,9 % Від сумарного білка. Цього вдалося досягти введенням в поліпептидних ланцюг енкефалінів сигнальної послідовності глю-Теліна (запасного білка рису), направляє його транспортування до компартменти накопичення запасних білків. Химерний ген перебував під контролем промотора гена глютеліна, який направляв його тканеспеціфічную транскрипцію в клітинах запасний тканини насіння (Vandekerckhove et al., 1989).

Інтеграція чужорідних генів у ядерний геном рослини пов'язана і з низкою проблем біобезпеки використання генетично модифікованих організмів. При одержанні трансгенних рослин в сель-скохозяйственних масштабах існує небезпека витоку трансгени у навколишнє середовище (вихід з-під контролю) у результаті перезапилення з близькородинними дикорослими видами. Для підвищення рів-ня біобезпеки поруч дослідників було запропоновано використовувати для трансгенеза стерильні по чоловічій лінії рослини (Menassa et al. , 2001).

Інший проблемою, що виникає при інтеграції гетерологічних генів у ядерний геном рослин, є-ється ймовірність "замолканія" трансгенів у подальших поколіннях (сайленсінг). Імовірність сайлен-Сінга різко зростає при вбудовуванні безлічі копій чужорідного гена на геном рослини (Finnegan, McElroy, 1994; Matzke et al. , 1994; Matzke М., Matzke А., 1995). Тому при створення трансгенних рослин-біопродуцентов рекомбінантних білків серед трансформантів відбирають рослини, що містять тільки одну вмонтовувані чужорідного гена.

В зв'язку з перерахованими вище проблемами, що виникають при інтеграції трансгенів у ядерний ге-ном, дуже привабливим представляється спосіб перенесення екзогенної ДНК в геном хлоропластів. Хлоропласти - органели рослинної клітини, які містять зелений пігмент хлорофіл, а також ряд інших пігментів, які беруть участь у поглинанні світлової енергії та здійсненні фотохімічних реак-цій. За формою і розмірами хлоропласти вищих рослин досить однорідні. Певна варіабельність спостерігається у ставленні їх числа у розрахунку на одну клітину, яка варіює від декількох десятків до сотень-ни і більше. Кожен окремий хлоропласт оточений подвійною мембраною і має складну внутрішню структу-ру. В одній рослинній клітці в середньому міститься від 5 до 10 тис. копій хлоропластной ДНК, за рахунок чого рівень експресії чужорідних білків досягає значень, які можна порівняти з рівнем експресії у E. coli (до 40% від сумарного білка клітини) (Staub et al., 2000; De Cosa et al., 2001). Однак у літературі зустрічаються лише поодинокі роботи з одержання рослин з генетично модифікованими хлоропла-стами. Це пов'язано з надзвичайною складністю методів їх трансформації і подальшого відбору.

Третій шлях використання рослин для накопичення білків гетерологічного походження заснований на природній здатності рослинних вірусів проникати в клітини рослин і колонізувати рослинні тка-ні (Mushegian, Shepherd, 1995). На цій основі виникає реальна можливість модифікації вірусного гено-ма і адаптації його не тільки як вектора для доставки в рослини відповідних генетичних конст-рукцій, але і в якості матриць для транзіентной експресії генів, що кодують синтез білків, що представляють комерційний інтерес. Для зараження рослинних тканин використовуються рекомбінантні (+) РНК-віруси рослин, що несуть у складі свого геному транскрипт чужорідного гена (Mushegian, Shepherd, 1995). Швидкість мультиплікації вірусної РНК в рослинах надзвичайно висока, за рахунок чого досягається висока ко-пійность транскриптів чужорідних генів в цитоплазмі заражених клітин. Тому продуктивність вірусної системи експресії в середньому на 2 порядки вище в порівнянні зі стабільною трансформацією рослин (Giddings et al. , 2000).

В даний час широко використовуються два види вірусів для продукції чужорідних білків в рослинах: ви-рус тютюнової мозаїки (ВТМ) та вірус мозаїки коров'ячого гороху (ВМКГ). Вектор на основі РНК ВТМ використовувався для отримання інгібітора реплікації ВІЛ