Клонування

Термін "клон" походить від грецького слова "klon", що означає --гілочка, втеча, держак, і має відношення, перш за все до вегетативногорозмноження. Клонування рослин живцями, нирками чи бульбами всільському господарстві, зокрема в садівництві, відомо вже більше 4-х тис.років. При вегетативного розмноження і під час клонування гени не розподіляютьсяпо нащадкам, як у випадку статевого розмноження, а зберігаються у повномускладі протягом багатьох поколінь.

Однак у тварин є перешкода. У міру зростання їх клітин, вони в ходіклітинної спеціалізації - диференціювання - втрачають здатністьреалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі

Втім, виявляється, є ящірки-стрибуни, які споконвікурозмножуються саме клонуванням, тому що у них в роду є тільки самки.

Хоча це не зовсім клонування, це називається партогенез. Цязустрічається в природі (перш за все у безхребетних) форма одностатевогорозмноження припускає розвиток яйцеклітин без запліднення.
Експерименти з штучного провокування партеногенезу почалися ще вНаприкінці XIX століття (роботи російського зоолога Тихомирова). Надалі вчені,застосовуючи різні фізико-хімічні подразники, такі як розчинисильних кислот, тертя, нагрівання, зуміли отримати партеногенез у багатьохтварин, у тому числі ссавців

Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана впочатку 50-х років в дослідах на амфібії. Досліди з ними показали, що серійніпересадки ядер і культивування клітин in vitro в якійсь мірізбільшує цю здатність.

Вже на початку 90-х була вирішена і проблема клонування ембріональнихклітин ссавців. Реконструйовані яйцеклітини великих домашніхтварин, корів або овець спочатку культивують НЕ in vitro, a in vivo - уперев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (перший) реципієнта. Потім їхзвідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (друга)реципієнта - корови чи вівці відповідно, де їх розвиток відбувається донародження дитинча.

Стаття Уілмут зі співавторами, що з'явилася на початку 1997 року, сталасенсаційної саме тому, що вперше клонального тварина (вівця на прізвисько
Доллі) з'явилися в результаті використання донорського ядра клітинимолочної залози дорослої вівці. У цього першого успішного експерименту єістотний недолік - дуже низький коефіцієнт виходу живих особин
(0,36%). Однак він доводить можливість повноцінного клонування, (абоотримання копії дорослої людини). Залишається лише вирішити технічні таетичні питання.

Найцікавіше, що методологія клонування, використана
Уілмут, була підготовлена в СРСР ще в 1987-му році, але в Академії наукна це прореагували мляво - не до того, мабуть ...

Перші досліди на амфібія

Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана впочатку 50-х років в дослідах на амфібії. Американські дослідники Бріггс і
Кінг мікрохірургічних розробили метод пересадки ядер ембріональнихклітин за допомогою тонкої скляної піпетки в позбавлені ядра
(енуклеірованние) яйцеклітини. Вони встановили, що якщо брати ядра з клітинзародка на ранній стадії його розвитку - бластули, то приблизно в 80%випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється нанормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра,просунулася на наступну стадію - гаструла, то лише менш ніж у 20%випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. Ці результатипізніше були підтверджені і в інших роботах.

Великий внесок у цю область вніс англійський біолог Гердон. Він першим вдослідах з південноафриканськими жабами Xenopus laevis (1962) в якості донораядер використав не зародкові клітини, а вже цілком спеціалізувалисяклітини епітелію кишечнику плаваючого пуголовка. Ядра яйцеклітинреципієнтів він не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовимипроменями. У більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися,але приблизно десята частина з них утворювала ембріони. 6,5% з цихембріонів досягали стадії бластули, 2,5% - стадії пуголовка і тільки 1%розвинувся в статевозрілих особин (рис. 1). Однак поява кількохдорослих особин в таких умовах могло бути пов'язано з тим, що серед клітинепітелію кишечника розвивається пуголовка досить тривалий часприсутні первинні статеві клітини, ядра яких могли бути використанідля пересадки. У наступних роботах як сам автор, так і багато іншихдослідники не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.

Пізніше Гердон модифікував експеримент. Оскільки більшістьреконструйованих яйцеклітин (з ядром клітини кишкового епітелію) гинутьдо завершення стадії гаструли, він спробував витягнути з них ядра на стадіїбластули і знову пересадити їх у нові енуклеірованние яйцеклітини (такапроцедура називається "серійної пересадкою", на відміну від "первинноїпересадки "). Число зародків з нормальним розвитком після цьогозбільшувалася, і вони розвивалися до більш пізніх стадій в порівнянні ззародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер.

Потім Гердон разом з Ласки (1970) стали культивувати in vitro (позаорганізму в живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослихтварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер. Приблизно
25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули.
При серійних пересадках вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка.
Таким чином, було показано, що клітини трьох різних тканин дорослогохребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвиток,по крайней мере, до стадії пуголовка.

У свою чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантаціїядра неделящіхся і повністю диференційованих клітин крові - еритроцитівжаби Rana pipiens. Після серійної пересадки таких ядер 10%реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка.
Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок (більше 100 клітиннихциклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка НЕрозвивалися.

Таким чином, у багатьох роботах показано, що у разі амфібійдонорами ядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку.
Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хочаправильніше називати їх клонуванням ембріонів амфібій, тому що в цьомувипадку ми розмножуємо безстатевим шляхом не дорослих тварин, а зародків.

Диференціація клітин у ході розвитку хребетних супроводжуєтьсяінактивацією непрацюючих генів. Тому клітини втрачають тотіпотентность,диференціювання стає незворотною. Зрештою, в одних клітинвідбувається повне репресування геному, в інших - у тій чи іншій мірідеградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Однак порядз диференційованими Кочетков культивовані in vitro клітинні популяціїмістять малодиференційовані стовбурові клітини, які і можуть бутивикористані як донори ядер для клонування ссавців.

Досліди з амфібіями показали, що ядра різних типів клітин одного ітого ж організму генетично ідентичні і в процесі клітинноїдиференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвитокреконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадки ядер ікультивування клітин in vitro в якійсь мірі збільшує цюздатність.

Невдачі експериментів з мишами

Успішні досліди з амфібіями змусили учених задуматися про клонуванняембріонів ссавців, зокрема мишей. МакКіннел в одній зі своїхробіт зазначав, що всі необхідні для цього методи вже існують, інезрозуміло, чому миша до цих пір не клонована. На його думку, першимиоб'єктами повинні були стати саме дрібні тварини, такі як миша абокролик. Однак пророкування

МакКіннелла не збулося, хоча наприкінці 70-х років досліди на мишахдійсно почалися і протікали дуже драматично. До того часу,зауважу, дуже грунтовно були вивчені біологія і генетика ранніх етапіврозвитку ссавців, і, зокрема, миші як модельного об'єкта.

Робота методично виявилася досить важким, насамперед тому, щообсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж уамфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані. Експериментаторинавчилися мікрохірургічних видаляти пронуклеус з зигот (заплідненихяйцеклітин) миші і пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів.
Проте всі отримані різними способами зародки мишей розвивалися лише достадії бластоцисти.

У 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Ілменсі про те, щовони отримали сім дорослих самок мишей, п'ять з яких мали тількиматеринський, а два - батьківський геном. Це, нібито, залежало від того, якийпронуклеус був залишений в яйці - жіночий або чоловічий, він і визначаврозвиток особи за типом гіногенеза або андрогенеза. Їх успіх був пов'язаний, алеопису авторів, з тим, що, видаляючи один пронуклеус, вони подвоювали числохромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощувалиотримані диплоїдні гомозиготні (з двома однаковими наборами генів)зародки in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самки -реципієнта для подальшого розвитку.

Здавалося, тепер можна буде швидко отримувати ссавців зі 100%-ноїгомозиготності за всіма генами. Це особливо важливо в селекції, тому що дляотримання сільськогосподарських тварин, зокрема, великої рогатоїхудоби, із закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібнідесятки років роботи.

Однак, на жаль, дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося,хоча багато хто намагався це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способомдиплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишей гинуть натих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетичного (розвиваються знезаплідненої яйцеклітини) ембріони.

Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх вклітку, МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, щовисокий вихід живих мишей вони отримали, коли як донорів ядервикористовували зиготи, але коли донорами були ранні ембріони, тореконструйовані яйцеклітини, як і раніше, розвивалися лише до стадіїбластоцисти.

Метод МакГрата і Солтер став широко використовуватися різнимиекспериментаторами. Так, Манн і ловель-Бадж виділяли пронуклеус з яєць,активованих до партеногенезу, і пересаджували їх енуклеірованние зиготимишей. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо жнавпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць і пересаджували впартеногенетичного активоване та позбавлені ядра яйця, то такі зародкирозвивалися нормально до народження. Сурані зі співавторами встановили, що якщододати жіночий пронуклеус з зиготи миші до гаплоїдном набору хромосомяйцеклітини, то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічогоядра призводить до нормального розвитку. З іншого боку, рекомбінаціїчоловічого та жіночого пронуклеус з різних запліднених яйцеклітин мишейзабезпечує нормальний розвиток, а комбінація двох чоловічих або двохжіночих пронуклеус зупиняє розвиток ембріона.

Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавцівпотрібні два набори хромосом - батьківський і материнський. Тому ні водного з відомих видів ссавців не описаний партеногенез. Томуроботи Хоппе і Ілменсі не вдалося повторити.

Проте ці дослідники ще двічі розбурхували наукове співтовариство. У
1982 вони пересадили ядра клітин партеногенетичного бластоцист мишей венуклеірованние зиготи. Деякі з цих реконструйованих яйцеклітиннормально розвивалися, і нібито були отримані чотири дорослих самки. У світлівищесказаного ці результати досить малоймовірні.

Загибель партеногенетичного (гіногенетіческіх) і андрогенетичнимзародків у ссавців пов'язана з різною активністю в онтогенезіматеринського й батьківського геномів. Механізм, який регулює ціфункціональні відмінності, був названий геномних імпрінтінг і вивчався у рядіробіт, де було показано, що для нормального розвитку ссавцівпотрібна наявність чоловічого геному. Інша стаття Ілменсі і Хоппе мала щебільший резонанс.

Автори повідомили про пересадку ядер клітин внутрішньої клітинної масибластоцисти в енуклеірованние зиготи мишей та одержання трьох дорослих мишей
(двох самок та самця), генетично ідентичних донорської лінії мишей.
Введення ядер-донорів та видалення пронуклеус з зиготи проводили за одинприйом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro достадії бластоцисти і пересаджували в матку самок. З 16-ти пересадженихбластоцист три розвинулися у дорослих тварин. У наступній роботі (1982)ці ж автори використовували як донорів ядер клітини ембріонів щебільш пізніх стадій (7 діб) і ніби-то отримали трьох статевозрілих мишей.
Однак ніхто з працюючих у тому ж напрямку не зміг домогтися подібнихрезультатів, і достовірність даних Ілменсі і Хоппе була знов поставленапід сумнів.

МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітинвнутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitroреконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, яка передуєстадії бластоцисти. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків даєможливість розвиватися тільки до стадії морули. У той же час 19%реконструйованих яйцеклітин, що містять ядра 2-клітинних зародків,змогли досягти стадії морули або бластоцисти.

Ці та багато інших дані показують, що в ембріогенезі у мишейклітинні ядра рано втрачають тотіпотентность, що пов'язано, очевидно, з дужеранньої активацією геному зародка - вже на стадії 2-х клітин. У іншихссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби,активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16 --клітинної стадії. Можливо тому перші значні успіхи вклонування ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а нена мишах. Тим не менш, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю,значно розширили наші уявлення про методологію клонуванняссавців.

Кролики, корови і свині

Американські дослідники Стік і роблю, використовуючи методику МакГрата і
Солтер, отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8клеточних ембріоніводнієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи. Фенотипнароджених повністю відповідав фенотипу донора.

Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися внормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, практично нещо дозволяє розраховувати на отримання таким методом клону генетичноідентичних тварин. Цінність цієї роботи, тим не менше, в тому, що вонапоказала можливість клонування ембріонів кроликів.

Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин,корів або вівці, він іде дещо по-іншому. Їх спочатку культивують НЕ invitro, a in vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (перший)реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в маткуостаточного (друга) реципієнта - корови чи вівці відповідно, деїх розвиток відбувається до народження дитинча. Уіладсін запропонував укладатиреконструйовані яйцеклітини в агарових циліндр, який він потімтрансплантували в перев'язаний яйцепровід вівці. За даними одних авторівреконструйовані зародки краще розвиваються в яйцеклітини, ніж укультуральной середовищі, хоча деякі дослідники отримали непоганірезультати і при культивуванні.

Американці Роблю і його працівники, використовуючи ощадливий спосіб вилученняядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропонований МакГрат і
Солтер, пересаджували в зиготи так звані каріопласти - чоловічий іжіночий пронуклеус разом з навколишнім їх цитоплазмою, а також ядра 2 -, 4 --або 8-клітинних ембріонів корови. Спочатку зиготи центріфугіровалі, щобзвільнити пронуклеус від оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра булидобре видно під мікроскопом, що значно полегшувало їх видалення. Придопомогою маніпулятора і загостреною скляній мікропіпеткі витягували один збластомерів разом з ядром з ранніх зародків і переносили його венуклеірованную зиготу.

Реконструйовані зародки були укладені в агарових циліндр іпересаджені в перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днів культивування їхвимивали, освоєнняБождан від агару і досліджували. Реконструктурірованниезародки в цій роботі розвивалися лише в тих випадках, коли в зиготипересаджували пронуклеус: 17% таких зародків досягли стадії морули абобластоцисти. Два зародка були пересаджені другу реципієнту - в маткукорови, і розвиток їх завершилося народженням живих телят. Якщо якдонорів використовували ядра 2 -, 4 - або 8-клітинних зародків, тореконструйовані яйцеклітини не розвивалися навіть до стадії морули.

Пізніше були і більш успішні роботи. Уіладсін, зокрема, повідомив, щойому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнскойпороди в результаті пересадки в реціпіентние яйцеклітини ядер бластомеріводного 32-клітинного зародка (рис. 3). Автор стверджував, що більшістьядер зберігає тотіпотентность на 32-клітинній стадії, а значна їхчастину навіть на 64-клітинній стадії, забезпечуючи нормальний розвитокреконструйованих яйцеклітин до стадії ранньої бластоцисти в яйцепровід вівці.
Після пересадки в матку корів - остаточних реципієнтів, як вважаєавтор, вони можуть і далі нормально розвиватися.

Бондіолі і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16-64-клітиннізародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в маткусинхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих теля. Сім зних були генетично ідентичні, являючи собою клон, отриманий урезультаті пересадки ядер клітин одного донорського ембріона.

Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худобидосить довго зберігають тотіпотентность і можуть забезпечити повнерозвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичнітруднощі клонування зародків великої рогатої худоби практичновирішені. Але залишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіютьтотіпотентностью, для клонування дорослих тварин.

клонування ембріонів свиней присвячена тільки одна невелика робота.
Мізерність даних, мабуть, і пов'язана з певними труднощами роботи зцим об'єктом.

Клонування овець

Уіладсін ще в 1986 році показав, що і в ембріонів овець на 16 --клітинної стадії розвитку ядра зберігають тотіпотентность.
Реконструйовані яйцеклітини, які містять ядра бластомерів 16-клітиннихзародків, розвивалися нормально до стадії бластоцисти в перев'язаномуяйцепровід вівці (в агарових циліндрі), а після звільнення від агару іпересадки в матку вівці - другий реципієнта - ще 60 днів. В іншому випадкудонорами служили ядра 8-клітинних зародків і були отримані 3 живихягняти, фенотип яких відповідав породу овець - донорів.

У 1989 році Сміт і Уілмут трансплантували ядра клітин 16-клітинногоембріона і ранньої бластоцисти в позбавлені ядра незапліднених яйцеклітиниовець. У першому випадку було отримано два живих ягняти, фенотип якихвідповідав породу овець - донорів ядер. У другому випадку один повністюсформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип такожвідповідав породу - донору. Автори вважали, що в ході диференціюванняембріональних клітин відбувається інактивація деяких важливих для розвиткугенів, в результаті якої ядра бластоцисти вже не можутьрепрограмміроваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальнерозвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, уяк донорів ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони абокультивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра яких маютьтотіпотентностью.

Пізніше, у 1993-1995 роках, група дослідників під керівництвом
Уілмут отримала клон овець - 5 ідентичних тварин, донорами ядер якихбула культура ембріональних клітин. Клітинну культуру одержували наступнимчином: виділяли мікрохірургічних ембріональний диск з 9-денногоовечого ембріона (бластоцисти) і культивували клітини in vitro протягомбагатьох пасажів (принаймні до 25). Спочатку клітинна культуранагадувала культуру недиференційованих ембріональних стовбурових клітин, аленезабаром, після 2-3-х пасажів, клітини ставали ущільненими іморфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин з 9-денногозародка вівці була позначена як TNT4.

Щоб донорське ядро і реціпіентная цитоплазма знаходилися на східнихстадіях клітинного циклу, зупиняли поділ культивованих клітин TNT4на певній стадії (GO) і ядра цих клітин пересаджували венуклеірованние яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II).
Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували вперев'язані яйцепровід овець. Через 6 днів ембріони вимивали з яйцепроводаперший реципієнта і досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, якідосягли стадії морули або бластоцисти і пересаджували їх в матку вівці --остаточного реципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося
5 ягнят (самок) з них 2 загинули незабаром після народження, 3-й у віці 10днів, а 2 залишилися нормально розвивалися і досягли 8-9-місячноговіку. Фенотипом всі ягнята були схожі з породою овець, від якоїотримували вихідну лінію клітин TNT4. Це підтвердив і генетичний аналіз.

Ця робота, особливо в частині культури ембріональних клітин, --значне досягнення в клонування ссавців, хоча вона й не викликаланастільки гучного інтересу, як стаття того ж Уілмут зі співавторами,опублікована на початку 1997 року, де повідомлялося, що в результатівикористання донорського ядра клітини молочної залози вівці було отриманоклонального тварина - вівця на прізвисько Доллі. Остання робота методично підчому повторює попереднє дослідження 1996 року, але в ній вченівикористовували не тільки ембріональні, але ще й фібробластоподібних клітини
(фібробласти - клітини сполучної тканини) плода і клітини молочної залозидорослої вівці. Клітини молочної залози отримували від шестирічної вівці породифін дорcет, що знаходиться на останньому триместрі вагітності. Всі три типиклітинних культур мали однакове число хромосом - 54, як зазвичай в овець.
Ембріональні клітини використовували як донорів ядер на 7-9-м пасажахкультивування, фібробластоподібних клітини плоду - на 4-6-м пасажах іклітини молочної залози - на 3-6-м пасажах. Ділення клітин всіх трьох типівзупиняли на стадії GO і ядра клітин пересаджували в енуклеірованниеооцити (яйцеклітини) на стадії метафази II. Більшість реконструйованихембріонів спочатку культивували в перев'язаному яйцепровід вівці, але деякіі in vitro в хімічно певному середовищі. Коефіцієнт виходу морула абобластоцист при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічівище, ніж при культивуванні в яйцепровід. (Тому, мабуть, немає рядканеобхідності в проміжному реципієнті і можна обійтися культивуваннямin vitro. Однак для повної впевненості в цьому потрібні додатковідані.)

Вихід морула або бластоцист в серії дослідів з культурою клітин молочноїзалози був приблизно втричі менше, ніж у двох інших серіях, коли вяк донорів ядер використовували культуру фібробластів плоду абоембріональних клітин. Число живих ягнят у порівнянні з числом пересаджених вматку остаточного реципієнта морула або бластоцист було також у два разинижче. У серії дослідів з клітинами молочної залози з 277 реконструйованихяйцеклітин був отриманий тільки один живий ягня, що говорить про дуженизької результативності такого роду експериментів (0,36%). Аналізгенетичних маркерів всіх семи народилися в трьох серіях експериментівживих дитинчат показав, що клітини молочної залози були донорами ядер дляодного, фібробласти плоду - для двох і ембріональні клітини - чотирьохягнят. Вівця на прізвисько Доллі розвинулася з реконструйованої яйцеклітини,донором ядра якої була культивовані клітини молочної залози вівці породифін дорсет і фенотипно не відрізняється від овець цієї породи, але сильновідрізняється від вівці-реципієнта (рис. 4). Аналіз генетичних маркерівпідтвердив цей результат.

Успіх авторів цієї роботи, перш за все, пов'язаний з використаннямтривалих клітинних культур, тому що після багатьох пасажів в культуріклітин могли бути відібрані малодиференційовані стовбурові клітини,які, ймовірно, і були використані як донори ядер. Велике значеннятакож мав той факт, що автори, з огляду на результати своїх попередніхробіт, синхронізували стадії клітинного циклу яйцеклітин і реципієнтівклітин донорів.

Але повернемося до клонування людини. Існує кілька способівобійти етичні проблеми - вирощувати окремі органи з клітинреципієнта або використовувати тварин. Але це лише "косметичний"метод. Реальний крок до безсмертя - штучна зміна ДНК. У червні 2000року і сталося те, чого так довго чекали і чого деякі так боялися.
З'явилося повідомлення, що вченим з уже відомої своєю вівцею Доллішотландської фірми PPL Therapeutics (комерційного відділення Розлін
Інституту в Единбурзі) вдалося отримати успішні клони овечок зі зміненою
ДНК. Шотландські вчені змогли здійснити клонування, при якомугенетичний матеріал клону був "підправлений" з кращу сторону. Однаксаме цього, генетичного втручання і бояться багато супротивникиклонування.

Хоча існує і вже узаконений шлях обходу заборони на клонуваннялюдини, яка називається "терапевтичне" клонування людськихістот. Мова йде про створення ранніх ембріонів - свого роду банкудонорських тканин для конкретних індивідуумів. Саме використовуючи його,американська компанія Advanced Cell Technology Inc. (ACT, місто Вустер,штат Массачусетс) оголосила в листопаді 2001 року про успішне клонуваннялюдського ембріона.

Цікаво відзначити, що ця компанія в жовтні отрималаурядовий грант 1.8 млн. $ на проведення досліджень в областібіотехнології. Порадувала і реакція конкурентів: "Я дуже рада, що ми несамотні. Ми отримуємо ембріони кожен день ", - заявила директор Clonaid
Бріджит Боселье (Brigitte Boisselier).

Для експерименту вчені використовували в цілому 17 жіночихяйцеклітин: видаливши з них ядра, вони впровадили на їх місце ядра,запозичені з клітин шкіри дорослої людини. У трьох яйцеклітинахпочався нормальний процес зростання і ділення. Коли ембріони складалися з 6-тиклітин кожен, вчені перервали їх подальший розвиток з тим, щобвикористовувати отримані клітини для подальших досліджень.

Слід зазначити, що стовбурові клітини, які, власне, і єпредметом інтересу вчених, що займаються дослідженнями в областітерапевтичного клонування, можна виділити тільки з ембріона, у своємурозвитку досягла стадії бластоцисти (близько сотні клітин). Однакфахівці ACT заявляють, що створені ними, в іншому експерименті, мавпячі зародки розвинулися до стадії бластоцисти. З ембріонів буливиділені стовбурові клітини, які в ході їх спеціалізації вдалосяперетворити на нейрони. Повідомляється, що ці нейрони опинилися в станівиробляти допамін і серотонін - два найважливіших гормону, яківиробляються мозком.

В інтерв'ю CNN президент компанії ACT доктор Майкл Вест сказав, що йогокомпанія не зацікавлена в клонування людей, і що вона не створювалаембріон людини для репродуктивних цілей "Ми лише хочемо допомогти хворимлюдям, які потребують допомоги, і в цьому полягає робота всього нашого центру ".

Визначення лікувального клонування людини

Рейтинг клієнта і дозвіл терапевтичного клонування людини грунтувалосяна морально-етичному відмінності між "репродуктивним" і "терапевтичним"клонуванням. Репродуктивне клонування - це відтворення всьоголюдського організму цілком. Лікувальне ж (медичне, терапевтичне)клонування за визначенням припиняє копіювання людських клонів наембріональної стадії і не допускає імплантації і нормальної вагітності.
При терапевтичному клонування ембріон руйнують на ранній стадіїрозвитку - на стадії бластоціта, і отримують з нього культуру стовбуровихклітин. Для отримання цієї клітинної маси, що при нормальнійвагітності дає початок плоду, ембріон неминуче слід зруйнувати.
Стовбурові клітини людського ембріона називають плюріпотентнимі стовбуровимиклітинами (ПСК), оскільки вони можуть давати початок різноманітним типамклітин. У листопаді 1998 року доктор Томсон (Thomson) в Вісконсінськомууніверситеті отримав культуру стовбурових клітин людського ембріона ззародків, наданих клініками зі штучного запліднення впробірці - in vitro. Ці клітини були плюріпотентни, тобто володіливеликими можливостями, і необмежено ділилися в лабораторних умовах.
При імплантації під шкіру миші вони давали початок клітинам вистилки кишечника,хряща, кістки, м'язів і епітелію нервової системи.

Відкриття здатності стовбурових клітин ембріона давати початок іншимтипів клітин породило віру в їх цілющі властивості, за допомогою яких можнаперемогти чи не будь-яку хворобу і уникнути старіння. Було висловленодумку, що найвищий терапевтичний потенціал ембріональних стовбуровихклітин в оновленні тканин може бути реалізований за їх виділення звласних клітин пацієнта. Щоб отримати "на замовлення" такі індивідуальноспецифічні PSK, потрібно застосувати метод перенесення ядра соматичноїклітини (Пяськи) - цей же метод був використаний під час клонування вівці Доллідля створення ембріона, що ідеально підходить пацієнтові. Мета ембріонального,або терапевтичного, клонування полягає в отриманні стовбурових клітинлюдського ембріона, ідентичних власних клітин пацієнта, що зчасом можна буде використовувати для лікування хвороб. Поки ж про стовбуровіклітинах ембріона відомо лише те, що з них можна одержувати клітини різнихтипів, які здатні тривалий час існувати в лабораторнійкультурі. Здібності ж керувати диференціюванням і проліферацією покизалишаються на рівні гіпотез.

Ембріон - щось більше, ніж людська тканина?

Дві крайні точки зору на обмежене клонування відображають два морально -етичні позиції по відношенню до ембріону людини. Ембріолог Уїнстон
(Winston) стверджує: "Ніхто не збирається, та й не може клонуватилюдські ембріони ... Все, що нам потрібно, - отримати тканинуембріонального походження і виділити з неї ділянки клітин, за допомогоюяких можна буде лікувати хворих людей ". Проте професор Скерісбрік
(Jack Scarisbrick) говорить інше: "Це - клонування. Ви створюєте точнукопію людини. І від цього нової людини відриваєте шматок, а потімвбиваєте його ". Чому двоє високоосвічених вчених висловлюють прямопротилежні думки про одну й ту ж методикою? Перша думка відображаєбіологічний підхід. Відповідно до нього, ембріон, який не пройшов імплантаціюі внутрішньоутробний розвиток, не має ніяких інтересів, які суспільствомає захищати. Такий ембріон - не більше ніж збіговисько клітин, керованихне мозок, а генетичним кодом. Протилежний підхід розглядаєембріон як живу людину, яку слід сприймати як повноціннуособистість з першої миті його існування. "Питання не в тому, чи схожийрозвивається людський зародок на дорослої людини, а в тому,чи відповідає його розвиток людської природи на даній конкретнійстадії "(5). Суспільство має захищати людський ембріон в силу йогогенетичної унікальності та здатності вирости в особистість. Ось чомуексперименти над ембріонами - нічим не виправдане вбивство.

У 1994 році Національний інститут здоров'я США заснував комісію зпитання про людський ембріоні з метою примирення цих двохпротилежних точок зору. Був розроблений компромісний підхід, згідно зякому ембріон - не особистість, але, будучи формою людського життя,володіє моральною цінністю. Критерій цього проміжного статусу --визначення людського життя і особистості через володіння трьомазумовленими діяльністю мозку здібностями: свідомістю, здатністюмислити і здатність відчувати. Був зроблений висновок, що людська особистістьвиявляється тільки на 14-й день розвитку. В основу цього висновку лягли трибіологічних факту. По-перше, первинна смужка - попередникцентральної нервової системи розвивається на 14-й день (6). По-друге, наранніх стадіях розвитку ембріона його індивідуальність розмита. До сьомого -десятого дня розвитку можливі два явища: формування близнюків імозаїцизм. Формування близнюків - здатність ембріона розділятися іутворювати кілька генетично ідентичних особин. У разі мозаїцизмдва різних зародка зливаються воєдино, утворюючи один організм з двомарізними геномами. І,нарешті, приблизно на 14-й день (інодіраніше, на 7-й-10-й день) відбувається імплантація в стінку матки; до 60%ембріонів при природному запліднення не імплантуються в тілі матері.
Висновок: якщо в природі більшість зародків у віці менше 14 днівгинуть природним шляхом, то експерименти над ембріонами допустимі додосягнення 14 днів без імплантації.

Стійкість компромісної точки зору.

Багатьох переконує твердження, що життя людини набуває унікальну,тільки їй притаманну цінність лише тоді, коли людина стає особистістю.
Є ще одна подібна точка зору, яка розглядає людський ембріон зпозицій росту і розвитку: моральна цінність внутрішньоутробного життязростає з перебігом вагітності, і на пізніх стадіях її (або до моментународження) досягає загальнолюдського рівня. Однак принципово важливорозглянути передумови, на яких засновані "моральна межа" 14-го днявагітності і заборона на імплантацію ембріона. Перша передумова:особистісністю повинна визначатися нашим сприйняттям людини як такої.
Друга передумова: складові особистості - свідомість, здатність мислити іздатність відчувати. Третя передумова: первинна смужка є точна мірасвідомості, здатності мислити і здатності відчувати.

Очевидно, що, згідно з біологічними даними, свідомість,здатність мислити і здатність відчувати розвиваються на більш пізніхстадіях. У недавній статті в "Журналі Американської медичної асоціації"
(JAMA) Ланца (Lanza) та ін доводять, що це - чітка і реальна межа,оскільки як тільки формується первинна вісь тіла, набуває конкретність
"індивідуальність", що є ключовим поняттям для визначення особистості.
Інші ж учені визнають, що кордон 14-го дня вибрана довільно,оскільки "біологічно" ясно, що раніше цього часу життя існуватине може. Спеціаліст з етики з Прінстонського університету Пітер Сінгер
(Peter Singer) припускає, що "новонароджена дитина не здатна ні досамосвідомості, ні до усвідомлення власного існування в часі - віннабуває ці якості багато пізніше. Це - не особистість. Його життязаслуговує захисту не більше, ніж життя плода "." У нашій книзі "Чи повинендитина жити? "моя колега Хельга Кузьо (Helga Kuhse) і я висловлюємоприпущення: лише у віці 28 днів про немовля можна сказати, щовін має таке ж право на життя, як будь-яка людина. І, звичайно ж, лишенабагато пізніше дитина набуває почуття власного існування підчасу ... ". Якщо довести хід думки прихильників" особистісного підходу "дологічного завершення, виходить, що інваліди, розумово відсталі люди,маленькі діти і люди похилого віку - неповноцінні члени суспільства.

"імплантаційний підхід", на перший погляд, здається обгрунтованим. Упевних ситуаціях переривання вагітності - в інтересах суспільства; аджестрашно подумати, що можна дати життя ембріонам, що виникли в ходіекспериментів, мутантним і клонованою. Не можна допустити, щоб такідіти з'являлися на світ. Взагалі, до