Реєстрація сигнальних молекул

зміст

НУК - нафтіуксусная кислота
БАП - бензіламінопурін
MS -
LB --тДНК -
Ар - Ампіцилін
Cs - цефотоксін
ВСТУП
Актуальність роботи:
Властивість бактерій виду Agrobacterium tumefaciens викликати у рослинкорончата-галловую хвороба пов'язано з присутністю в їх клітинах великих (95 -
156 МДА) кон'югованих Ti-плазмід (від англ. Tumor-inducing - викликаєпухлина). У процесі ідентифіковані рослин частину генетичногоматеріалу Ti-плазмід - тДНК (від англ. transferred DNA - передана)переміщається в рослинні клітини і інтегрується в хромосоми, залишаючисьчастиною спадкового матеріалу. Гени тДНК експресуються втрансформарованних рослинних клітинах, порушують їх фітогормональноїбаланс і визначають синтез специфічних ------- з'єднань.
Таким чином, агробактерії є природними "генними інженерами",здійснює вражаючий по філогенетичної дальності перенесеннягенетичної інформації. На основі агробактерій сконструйовані ефективнівекторні системи для генетичної інженерії рослин.
Агробактіріальная трансформація відбувається в результаті складного процесувзаємодії між бактеріальними та рослинними клітинами. У цьомупроцесі однією з вирішальних стадій є рецепція агробактерій особливихсигнальних молекул, присутніх у ексудатах пошкоджених тканинрослин. Сигнальні молекули індукують експресію генів області vir
(агробактеріальної Ti-плазміди), які контролюють вирізування тДНК та її перенесенняв клітини рослин. Агробактерільная трансформація спостерігається у широкогокола голонасінних і дводольних рослин, проте, вона відзначена лише удосить незначної кількості однодольних рослин. Однією з причинобмежень агробактеріальної трансформації однодольних вважаєтьсяприсутність у їхніх клітинах сигнальних молекул, які індукують процесинг іперенесення тДНК.
Мета роботи:
В даний час є суперечливі дані щодо наявності такихсигнальних молекул у однодольних рослин. У зв'язку з цим, метою даноїроботи був аналіз ряски на присутність у них сигнальних молекул,індукують процесинг тДНК.
1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. Використання Ti-плазмід агробактерій в генетичної інженеріїрослин
1.1.1. Коротка характеристика Agrobacterium tumefaciens

За останнє десятиріччя в галузі генетичної інженерії рослиндосягнуті значні успіхи. Були розроблені різноманітні методигенетичної трансформації і, в даний час здійснено експресіячужорідних генів у рослинах багатьох видів. Найбільш важливим для розвиткугенетичної інженерії рослин було відкриття молекулярних основ пухлиннихутворень за допомогою Agrobacterium tumefaciens [7].
Вірулентні штами Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae)характеризуються присутністю в клітинах великої плазміди, так званої Ti -плазміди, вагою понад 150 т.п.н. (див. Додаток) [9].
Агробактерії викликають пухлинний зростання у багатьох дводольних і голонасінних, атак само у деяких однодольних рослин [2,3]. Для інфікування in vivoнеобхідно ушкодження тканин рослини [12].
Після прикріплення до клітинної стінки рослинної клітини агробактеріїпереносять частину Ti-плазміди (так званої тДНК) в ядро, де відбувається їїстабільна інтеграція в хромосому рослини.
Доведено, що функція розпізнавання клітин і прикріплення до них, а так самовирізування, перенесення і, можливо, інтеграція тДНК в рослинний геномкодується двома хромосомними генами - Chva і Chvb [13] і поруч генів vir -області, що знаходяться на Ti-плазміди [14].
Після перенесення в ядро рослинної клітини, тДНК може інтегрувати в геному вигляді однієї або декількох копій [15]. Вбудована тДНК має властивості,характерні для ДНК еукаріотів, що показано в експериментах згіперчутливості до ДНК-азе I (Schafer, 1984). Залежно від типу Ti -плазміди, в тДНК перебуває від семи до тринадцяти генів, відповідальних запухлинний фенотип. Гени 1 і 2 кодують ферменти, які беруть участь у синтезіауксину, індолілуксусной кислоти, в той час, як ген кодує 4ізопентенілтрансферазу, що синтезує цитокініни ізопентеніла денозін 5'-монофосфат [16].
Одночасна транскрипція генів 1,2 і 4 призводить до підвищення рівняфітогормонів всередині трансформованих клітин. Результатом цього єпідвищення мітотичної активності та утворення пухлини. Інші гени тДНКкодують синтез так званих опинилась, з яких найбільш вивчені нопапіні октопін. Опінія являє собою похідне амінокислот і цукрів,які служать джерелом живлення для агробактерій [14]. В цілому,освіта корончата галла є добре охарактеризованийприклад генетичної інженерії рослин в природі.
Мутації в генах вірулентних агробактерій. Наявність Ti-плазмід в клітинахагробактерій є абсолютно необхідною умовою патогенностімікроорганізму. Вилікуваних від Ti-плазмід штами агробактерій авірулентни.
На вірулентність Agrobacterium tumefaciens впливають різнімутації, картіруемие як на пухлинних плазміди, так і на хромосомах.
Ранні етапи взаємодії агробактерій з рослинами, так само якхемотаксис, прикріплення до поверхні рослинної клітини і специфічнезв'язування в центрах інфекції контролюються генами, що мають хромосомнулокалізацію. У хромосомі розташовані деякі гени, що регулюютьекспресію vir-генів Ti-плазмід [19]. Приєднання агробактерій до клітинрослини є одним з перших етапів, що визначають ефективневзаємодія. Цей етап у Agrobacterium tumefaciens контролюють двапов'язаних між собою хромосомних локусу Chva і Chvb, розмірами 1,5 kb і
5kb, відповідно [Дуглас и др, 1985]. Гени цих локусів експресуютьсяконститутивний. У результаті транспозони мутагенезу цих областейотримують авірулентние або дефекнтие по прикріплення агробактерії. Мутаціїв цих локусах сильно знижують або інгібують вірулентність бактерії, але недля всіх господарів. Локус Chvb визначає синтез нейтрального циклічного (-D -ГЛІКАНА, який трансформується в Периплазма клітиниза допомогою продукту гена Chva. Роль нейтрального (-D-ГЛІКАНА в інфекційномупроцесі ще точно не встановлена. Крім циклічного (-D-ГЛІКАНА вприкріплення патогенних агробактерій до рослинних клітин берутьучасть і інші полісахариди, зокрема позаклітинні екзополісахаридів.
Організація vir-генів Ti-плазмід. Вірулентні гени агробактерій на Ti-і
Ri-плазміда кластерізовани в області vir розмітив близько 30-35 kb,проявляємо у цих плазміда значну гомології ДНК. Виявлено такожгомологія vir-генів Ti-плазмід Agrobacterium tumefaciens з tra-генамикон'югітівних плазмід. У ----- Ti-плазміда в області vir локалізованошість різних груп комплементаціі A, B, C, D, E і G, організованих уєдиний регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопіновая Ti-плазміда Arh 5 маєдодатковий локус vir F, розташований праворуч від локусу vir E [Kooykaaset al., 1984]. Мутації в генах і --------- vir A, vir G, vir B і vir Dнадають агробактерій авірулентний фенотип, на відміну від більшостіхромосомних мутацій, що мають коло трансформованих рослин-господарів.
Продукти генів vir-області контролюють процесинг тДНК в бактеріальноїклітці, її перенесення в рослинну клітину та інтеграцію в ядерний геномрослини, причому ці процеси гени vir можуть визначати не тільки в цис, алеі в транс положенні по відношенню до тДНК (тобто перебуваючи в різнихрепліконах). Виходячи з цієї властивості області vir, сконструйовані іуспішно використовуються в практиці зручні бінарні вектори для генетичноїінженерії рослин [Дрейпер з співавт, 1991]. Для процесів "вирізування" тДНКз плазміди (точніше, вивільнення у процесі реплікативного синтезу) та їїпереносу в рослину необхідно фланкування цій галузі особливимикордонами: недосконалими прямими повторюваними послідовностями ДНКрозміром 24 ----, що виявляють значну гомології у всіх вивчених Ti -і Ri-плазмід. Межі тДНК гомологічних області oriT кон'югатівних плазмід.
У цій області сайт-специфічні ендонуклеази виробляють одноланцюжковірозрив, що служить початком реплікації за типом розмотується рулону,що відбувається в процесі транспорту плазміди. Реплікація забезпечуєзбереження плазміди в материнській клітині і поява її копії в дочірній.
Для нормального процесингу тДНК та її перенесення в рослинну клітинуособливо важлива її права кордон, який один може визначати полярністьперенесення тДНК. Видалення правої межі з Ti-плазмід робить агробактеріїповністю авірулентнимі. Заміна її на штучно синтезовану, так самояк і на ліву, відновлює вірулентність мікроорганізму.
На процесинг тДНК в клітинах бактерій впливають мутації в генах vir D, vir C іvir E - Оперон, на транспорт т-комплексу в рослинну клітину - мутаціїв генах vir B і vir D - Оперон.

1.1.2. Створення векторів на основі Ti-плазмід

На початку вісімдесятих років були зроблені перші спроби перенестичужорідні послідовності ДНК в рослинні клітини або за допомогоютранспозони мутагенезу [Uernals-teens et al., 1980], або шляхом сайт -специфічної міграції генів у тДНК і наступної подвійної рекомбінацією за
Ti-плазміди дикого типу [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981].
Однак, ці ранні експерименти, засновані на подвійний рекомбінації,займали багато часу, були досить складні і трансформації проходили здуже низькою частотою. Необхідно було розробити більш ефективнівектори, щоб полегшити генетичні маніпуляції з бактеріями і дозволитиселекцію і регенерацію трансформатов.
Зараз використовують дві принципово різні системи для введення чужоріднихгенів в рослини за допомогою Ti-плазмід:
---- Векторибінарні вектори.
В основі створення -------- векторів лежить той факт, що гени тДНК НЕ ------- для рослинних клітин, і будь-яка последовтельность ДНК, вбудована міжкордонами тДНК, може інтегрувати в хромосому рослинної клітини інормально там експресувати [Zambryski et al., 1983]. У --------вектори системах тДНК можна замінити, наприклад, на послідовністьpBR322, а чужорідну ДНК, яку передбачається перенести в рослини,потрібно проклоніровать в цьому ж векторі.
Потім шляхом гомологічною рекомбінації ця чужорідна ДНК може бутиперенесена на Ti-плазміди реціпіентного штаму агробактерії (рис. 2). Одниміз перших таких векторів на підставі Ti-плазмід авляется pGV3850
[Zambryski et al., 1983]. У ньому все гени, відповідальні за синтезфітогормонів, були замінені на послідовність pBR322.
ДНК pBR322 забезпечувала гомології для ------- області тДНК pGV3850 з будь-якимивиробляли pBR, що несуть клонований ген.
Гени, що кодують різні маркерні білки для швидкого відбору трансгеннихрослин, були вбудовані в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Було розробленосистема трехродітельного схрещування для перенесення будь-яких похідних pBR322з E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В данийчас сконструйовані і успішно використовуються і інші --- ----------вектори на основі Ti-плазмід [Royers et al., 1988].
Рис. 2.
Схеми -------- (А) і бінарної (Б) векторних систем. vir - областьвірулентності. HOM - області гомології, в межах яких можевідбуватися рекомбінація, що приводить до утворення коінтегратов. LB і RB --ліва і права кордону тДНК. MCS - ----- сайт для клонування. РТМ --маркет трансформації для рослин. RES - маркер стійкості до антибіотикадля бактерій. OriT - початок передачі або bom-сайт для мобілізації векторівпри кон'югації. Col E1 - початок реплікації з плазміди Col E1. RK2 - початокреплікації з плазміди широкого кола господарів RK2.
Система бінарних векторів заснована на тому, що область тДНК і гени virможуть розташований на різних плазміда [Hockemu et al., 1983]. У такихсистемах зазвичай присутні два елементи:
Ti-плазміда-помічник, в якій тДНК польностью делетірована. Ця плазміданесе в своєму складі гени vir, що діють in trans.
Плазміда широкого кола господарів, що має сайти для клонування і маркернігени для селекції рослин, обмежені правої і лівої фланкуючіпослідовностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обидві описані вище системи векторів припускають --------- етапах складанняпотрібних конструкцій у проміжних векторах, наприклад в pAP2034 [Veltena,
Sehell., 1987] або pRT103 [Topter et al., 1983] а потім перенесення з вготовому вигляді в рецепіентние штами агробактерій.

1.1.3. Процесинг тДНК в бактеріальної клітціта її перенесення в клітини рослин
Форми процессірованной тДНК. При культивуванні Agrobacterium tumefaciensз механічно пошкодженими частинами рослин, регенеруючі протопластівабо в присутності --------- з клітин бактерій можна виділити різнімолекулярні форми процессірованной тДНК - одноланцюжкові лінійні,двуцепочечние лінійні і двуцепочечние кільцеві, які можутьпретендувати на роль посередника в перенесення генетичного матеріалу врослинну клітину [-------, 1980]. Причому кільцева форма, що утворюєтьсяза рахунок гомологічною рекомбінації між правою і лівою кордоном тДНК зосвітою однієї гібридної кордону, зустрічається в дуже малихкількостях. При її освіті не відбувається реплікативного синтезу ДНК, втой час як у разі утворення двох інших форм, можливе проходженняреплікації тДНК на бактерію в процесі її транспотра в рослини (допояви одноланцюжкові форм може приводити переривання, інгібуванняпереривчастого синтезу запізнюється ланцюга). Реплікація покликана забезпечитизбереження тДНК у вихідній Ti-плазміди, якщо тільки не допуститиможливість існування фізичного вирізування матеріалу тДНК з Ti -плазмід за рахунок утворення дволанцюжкові розривів у межах.
Зникнення тДНК з Ti-плазмід є головним недоліком відійшла надругий план подібної "ексцезіонной моделі". Тим не менше, освітадвуцепочечних розривів усередині кордонів і поява детектіруемих кількостейлінійної двуцепочечной форми тДНК при культивуванні бактеріальних клітину присутності ---------- дослідники спостерігали вже через 30 хвилин післядодавання цього індуктора в середу. Так само в умовах індукції vir-генів ---
------ В клітинах агробактерій виявляється лінійна одноланцюжкові формапроцессірованной тДНК [Stachel et al., 1986].
Поява цього інтермедіатів виявляється через вісім годин післядодати індуктора, і його кількість накопичується протягомнаступних 40 годин більше, ніж у два рази, а потім йде на спад,показуючи, що процес лімітований.
Яка з форм транслоціруется через бактеріальну мембрану в бактеріальнуклітку до цих пір залишається не з'ясованим через труднощі визначеннявідносної кількості кожної з форм і виявлення динаміки їхперетворення. Можливо, процесинг і транспорт тДНК НЕ роз'єднані в часіі йдуть сполученої подібно кон'югаціонному перенесення плазмід, що відбувається вмісці контакту мембран кон'югуються клітин [Clark and Warren, 1979]. Тодівсі виявляються інтермедіатів можуть бути аберрантнимі формами перерваногона якомусь етапі неподільного процесу (або неправильно завершеного). Уразі індукованої експресії vir-генів ------- відсутній головнийелемент взаємодії - контакт бактеріальної клітини і рослинноїклітини, і, тому, все виявляються в цьому випадку форми можутьпретендувати на роль посередника лише з певними припущеннями.
Достовірно відомо, що в рослинну клітину потрапляє лише один ланцюгтДНК і конвертуючи?? ся в двуцепочечную вже в рослинній клітині.
Обговорюється, що у разі проходження в клітці Agrobacterium tumefaciens ---
----- Полуконсерватівной реплікації тДНК другий ланцюг може в процесіперенесення гідролізувати, вивільняючи енергію для транспорту переносимоїланцюга.

1.1.4. Розробка система трансформацій рослин здопомогою Agrobacterium tumefaciens

Більшість первинних експеріметнов з генетичної трансформаціїрослин було зроблено за допомогою зараження поранених рослиннихклітин за допомогою агробактерій з немодифікованими Ti-плазміди. Длязбереження стерильності часто інфікували експлантати in vitro замістьцілих рослин. Бактерії потім видаляли, додавали в середу цефотоксін абокарбеніцилін. Трансформантів відбирали на безгормональной середовищі.
Надалі в міру створення обеззброєних векторів і нових селективнихмаркерів, був розроблений більш ефективний метод, що дає велике числотрансформантів: кокультівірованіе агробактерій з рослиннимипротопластів або з експлантантамі листя. Було показано, щококультівірованіе протопластів з агробактерій, або з бактеріальними -----< br>---, Призводить до утворення пухлини [Marton et al., 1979, Wullems et al.,
1981]. Потім подібний підхід був успішно застосований для трансформаціїрослинних клітин агробактерій, що несуть у складі тДНК химерніселективні маркери [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].
Цей метод був надалі поліпшений використанням так званих фідернихкультур [Fraley et al., 1983]. Проте, всі перераховані методи придатнітільки для трансформації рослин, які можна легко регенерувати зпротопластів (наприклад, тютюн і петунія). Цю проблему мрожно легкоподолати кокультівіруя агробактерії з листовими дисками замістьпротопластів [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986].
Стерильні листові диски --------- з агробактерій, що несуть у складіобеззброєного вектора будь-якої селективний маркер стійкості доантибіотика. Потім шматочки листя культивують два дні на фідерних чашкахз середовищем для утворення пагонів. Після цього їх переносять на середовище зцефотоксіном для знищення бактерій і з яким-небудь антибіотиком
(наприклад, з ---------) для відбору трансформантів. Регенеровані пагонидають коріння, після чого рослини переносять в грунт для проведення подальшихекспериментів.
Оскільки метод трансформації листових дисків є ідеальнимпоєднання високої частоти трансформації з легкою та швидкою ------- ірегенерацією трансформантів, цей підхід почали використовувати в багатьохлабораторіях світу. Крім того були запропоновані деякі модифікації методу.
Для підвищення частоти трансформації листових дисків Arabiodopsis булозапропоновано обробляти агробактерії --------- [Sheikholeskam a. Week S,
1987], який є індуктором генів vir [Stachel et al., 1985]. Однакметод трансформації листових дисків застосовується для трансформації тільки тихвидів рослин, які можуть регенерувати втечі з недиференційованихклітин у місці поранення.
Поряд з методом трансформації листових дисків широко використовуютьсякон'юговані агробактерії з стебловими сегментами [An et al., 1986],клітинами суспензованого культури [Scott a. Draper, 1987], мікрокаллусамі
[Pollock et al, 1985] і проростають насінням [Feldmam a. Markis, 1987].
Метод трансформації насіння агробактерій був вперше застосований дляарабідопсис і заслуговує на особливу увагу, тому що не вимагає роботи зкультурою тканини.

1.1.5. Проблема збереження чужорідних генів, перенесених у рослину

чужорідні ДНК, перенесені в рослинні клітини за допомогою різнихметодів, звичайно вбудовуються в ядерний геном і успадковуються відповідно дозаконами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Областіінгераціі, по видимому, розподілені випадковим чином по геному.
Вбудовування генів з певних сайтів було раніше описано в системахтваринних клітин [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] і нещодавно подібнийпідхід був успішно застосований для трансформації рослин [Paszkowski et al.,
1988].
У більшості випадків послідовності чужорідної ДНК вбудовуються в одинлокус або в одній копії, або у вигляді кластеру тандемних вставок, що булопоказано за допомогою гібридизації in situ [Mouras et al., 1986]. Однак,часто спостерігаються множинні вставки в два або більше ділянок на різниххромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a.
Marus, 1987]. У зв'язку з цим у багатьох випадку була отриманаконтрансформація фізично несцепленних генів, сегрегація деякихпроходила в поколінні F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].
Чужеродине гени зазвичай передаються потомству з високим ступенем стабільностіпри мейозі [Muller et al., 1987]. Однак, іноді спостерігали випадкову втратутрансформованого фенотипу після мейозу [Potrykus et al., 1989].
Возмножно, це відбувалося через активації чужорідного гена (наприклад, приметилюванні ДНК). Інтеграція чужорідної ДНК у внеядерние геноми,наприклад, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так само відбувається занеменделевскому типом успадкування - по материнській лінії.
Використовуючи метод гібридизації по Саузерн [Southern, 1975] для аналізутрансформантів та їх потомства, багато дослідників показали, що частоспостерігається вбудовування укорочених, тандемних або перебудованих копійчужорідних генів, особливо після прямого переносу ДНК у протопластів [Krenset al., 1985]. Поява тандемів, часто від 5 до 20 копій, можна пояснитипоруч рекомбінації перед інтеграцією в геном [Szernilofsky et al., 1986;
Wirtz et al., 1987]. Освіта інвертований повторів є основнимтипом перебудов чужорідної ДНК при застосуванні векторів, що містять тДНК ---
- Ti-плазміди [Jorgensen et al., 1987].
Отже, при проведенні дослідів з питань трансформації рослин, необхідно прийматидо уваги той факт, що чужорідна ДНК може піддаватися різниммодифікаціям перед вбудовуванням в геном господаря. Однак, і після інтеграціїможуть відбуватися різні її перебудови, зазвичай під час мейозу
[Czernilofsky et al., 1986]. У таких випадках тільки перехресне запиленняретельно відібраних трансформантів з найбільш бажаним генотипом іфенотипом дає потомство з передбачуваними прізанакамі.

1.1.6. Аналіз експресії чужорідних генів у трансформованих рослинах

Для якісного і кількісного аналізу експресії чужорідних генів урослинах використовують безліч методів, включаючи Нозері-аналіз РНК [Nagy etal., 1988] і Вестер-аналіз продуктів трансдукції [Burnette, 1981]. Крімтого, вивчають фенотипічні ознаки такі як, стійкість доантибіотиків і гербіцидів. Для аналізу експресії таких репортерних генів,як cat, npt II, гени октопін-і -------- розроблені чутливі методи
[Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].
Такого роду аналіз може мати велике значення, оскільки можнакомбінувати кодують послідовності репортерних генів з відповіднимирегуляторними послідовностями рослинних генів, або створюватиподвійні гени, експресуються з одного й того ж промотора. Активністьгена і промотора можна таким чином визначити або за допомогоюферментативного аналізу, або гібридизацією рослинної РНК з зондами,комплементарними репортерному гену.
Перераховані вище різноманітні методики можна успішно застосовувати дляаналізу експресії чужорідних генів в трансгенних рослинах, зокрема,генів стійкості до гербіцидів, комах, опромінення, антибіотиків та ін

1.2. Використання методу генетичноїінженерії для трансформації однодольних рослин
1.2.1. Короткі характеристики ряски
Сімейство Ряскова, Lemnaceae включає 6 родів і 30 видів, що зустрічаються навсіх континентах. Найбільш широко вони поширені в Північній і Південній
Америці, Африці, Австралії. Представники родини Ряскова єнайменшими у світі квітковими рослинами, віночки яких рідкоперевищують 1 см. У результаті гідрофільній еволюції вони досягли крайньоїступеня редукції всіх своїх органів, тому і по простоті будовизаймають перше місце серед квіткових.
Ряскова - водні, свободноплавающіе, здебільшого багаторічнітрав'янисті рослини. За своєю природою Ряскова є неотеніческіміформами відбулися від предків сучасної водоплавної роду Пістія зсімейства ароїдних. Ряскова служать кормом для диких і домашніх качок, а такж інших водоплавних та болотних птахів, для риб, особливо коропа, іондатри. У сільському господарстві їх використовують у свіжому і сушеному вигляді якцінний білковий корм для свиней та свійської птиці. Застосовуються Ряскова ідля очищення води, тому що витягують з неї і запасають у своїх листах азот,фосфор, калій, а так само поглощіют вуглекислий газ і збагачують водукиснем. Вживаються і людиною.
За останні 50 років Ряскова розглядаються, як надзвичайно ціннийекспериментальний об'єкт для морфогенетичних, фізіологічних ібіохімічних досліджень завдяки невибагливості до середовища, малимрозмірами, швидкому росту, що дозволяє використовувати всього одингенетичний клон протягом усього експерименту.

1.3. Сигнальні молекули, їх здатність індукувати процесинг тДНК

експресію генів vir-області індукують специфічні сигнальні молекулиза допомогою позитивної регулювання системи до складу якої входять гени virAі virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].
Активаторами транскрипції vir-генів є низькомолекулярнімоноцікліческіе фенольні сполуки, що синтезуються в механічнопошкоджених тканинах рослин [Stuchel, 1985]. Прикладами таких з'єднаньє ----------- і досить широке коло похідних -------Біосинтетичними шляху метаболітів захисної природи або попередниківлігніну.
Сигнальні молекули були вперше виявлені в ексудатах коренів і листядводольних рослин Nicotiano tabacum, вони були ідентифіковані як -----і -------. Ці сполуки синтезували метаболічно активні пошкодженітканини рослин. В даний час встановлена сигнальна індукуютьактивність у великої групи ------- з'єднань рослинної природи.
Механічне пошкодження тканин рослин призводить до посилення синтезу такихсигнальних з'єднань. Відомо, що ------------ і корична кислоти,проявляють сигнальну активність, мають так само антимікробнимивластивостями і є проміжними метаболітами на шляху синтезу -------.< br>---------- Розпізнаються специфічними рецепторами агробактерій,які є трансмембранним хеморецептргимі білками з різною ------- дотаким молекул [Leroux, 1987]. Для оптимальної індукції експресії генівvir потрібна присутність в ексцудатах рослин різних вуглеводів:глюкози, глюкуроновою кислоти, галактози, галактуроновой кислоти,Арабіноза, маннози, фукози, целлобіози і ксилози, що представляють компонентиклітинної стінки рослин. Такі вуглеводи зв'язуються з періплазматіческімдоменом рецептора у вигляді попередньо обробленого комплексу з білком -продуктом хромосомного вірулентного гена Chv E, причому кінцевий результатіндукції процесингу тДНК залежить від синергічної активності сигнальнихз'єднань і цукрів ексцудатов рослин.
Структурна формула:

Позитивна регуляторна система vir A - vir G, яка контролює експресіюгенів vir -----, працює таким чином. Експрессіруемий конститутивнийген vir A виконує функцію рецепції сигнальних молекул рослин ітрансмісії цього сигналу в бактеріальну клітку. Цей мембраннийхеморецептори після прийняття зовнішнього сигналу активує продукт гена vir G,який у свою чергу виступає в качетве позитивного регуляторавласній транскрипції і транскрипції інших генів vir -----.< br>Механізми активації наступні.
Білок vir A, двічі пронизливий мембрану бактерії, при появісигнальних молекул автофосфоріліруется --------- на своєму С-кінці, переходячив активну форму. (У відсутності індукції С-термінальний домен білки vir Aвзаємодіють з W-термінальним доменом, пригнічуючи кіназную активність).
Активоване білок vir A у свою чергу --------- внутрішній клітиннийбілок - трансдуктор сигналу vir a по залишку аспарагіну - 52 [Jin et al.,
1990]. Фосфорілірованний білок vir G зв'язується з промоторами іншихгенів регулон і зі своїм власним, виступаючи яктранскрипційного активатора. Індукція vir генів оборотна, і каскадреакцій може бути перерваний, що дуже важливо для патогена: у випадку, якщогосподар хворий і нежиттєздатний організм, перенесення тДНК в його клітини нездійснюється [Hess et al., 1991].
Крім позитивної регуляторної системи vir A - vir G, локалізованої на Ti -плазміди, у регуляції експресії vir-генів беруть участь такожхромосомні гени. Про це свідчить виявлення спонтанногохромосомного мутанта ros, у якого гени vir C і vir D - Оперонекспресуються у відсутність сигнальних молекул рослин.
3. Матеріали та методи
2.1. Матеріали
2.1.1. Обладнання

екскаватори, термоміксер 5436, центрифуга "Еппіндорф", прилад длягоризонтального електрофорезу, джерело живлення 2197, термостат ТС-80 Мг.

2.1.2. Бактеріальні штами та плазміди

Як об'єкти дослідження використовували двох-, тримісячнеоднодольних рослин ряски крихітної (Lemna perpusilla).
Рослини вирощували в теплиці в вегетаційних судинах при температурі
18-250 С і 12 годинному світловому періоді. Відносну вологість повітря втеплиці підтримували в межах 65-70%. Для аналізу брали стерильні тканинилистя. Стерилізацію проводили гіпохлорид натрію протягом 5-10 хвилин, апотім матеріал 3 рази промивали стерильною водою і використовували векспериментах по індукції vir-генів Ti-плазмід. Для порівняння були взятідводольні рослини тютюну червоного і льону довгунця.

2.1.4. Середовища мікробіологічні для культивування рослин

У роботі використовували середовища:
Для мікроорганізмів - LB (Лурія-Бертані)
NaCl
Дріжджовий екстракт
Бантотріптон | 10 мг/л
5 г/л
5 г/л | | рН 7,5
Температура 240 З
Довжина світлового дня 16 годин
На чашку Петрі:
LBштам | 10 мл
1 мл | | Для культивування рослин - середа MS (Мурасіге-Нудьгуючи) наведенав таблиці.

2.1.5. Інші розчини

фосфатний буфер
ТЕ буфер (10 мМТріс-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЕДТА)
Саркозілат Na
Пронази - 1,5 мг/мл
Фенол
Хлороформ
Агарозние гелі
Фітогормони:
БАП (6-бензіламінопурін) розчиняли в розчині 0,1 - NaOH
HУК (2-нафтілуксусная кислота) розчиняли в етанолі і розводили водою до 10мг/мл. Стерилізація через фільтр через фільтри В 485.
Ацетосірінгон розчиняли в 70% спирті (етанолу) в концентрації 10 мг/мл.
Додавали в середу MS до кінцевої концентрації 100 мМ.

2.1.6. Ферменти, що використовуються в генній інженерії

Гідроліз ДНК проводили рестрикційних ендонуклеаза:
Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.

2.1.7. Антибіотики

Ампіцилін 50, Н2О 50. Для селекції бактерій з певними плазміди.

Методи
2.2.1. Інкубація Agrobacterium tumefaciens з ексудату тканин рослин

нічну культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), вирощену на ротаційнихшейкері (20 циклів/хв) при 290 С в рідкому середовищі LB, збиралицентрифугуванням і суспензованого в середовищі МС - 0,1 М фосфатному буфері (рН
5,5) до кислотності А600 - 0,05.
Після 5 годин росту в бактеріальну культуру додавали поросяти, ягнятистерильні тканини рослин (листя, стебла) у кількості 2 г на 10 мл середовищаі продовжували інкубацію протягом 48 годин.
У качетве позитивного контролю використовували агробактеріальної культуру здодаванням як індуктора 100 мкМ ацетосірінгона. В якостінегативного контролю використовували агробактеріальної клітини, вирощеніна середовищі без ацетосірінгона і ексцудатов рослин.
Ефективність індукції процесингу тДНК церез 48 годин інкубаціїагробактерій з тканинами рослин. Титр життєздатних бактерій післяінкубації з ексцудатамі рослин перевіряли шляхом їх висіву в різнихрозведеннях на чашки Петрі з агарізованной середовищем LB. Кожен варіант дослідівпроводили в трьох повторно.

2.2.2. Виділення тотальної ДНК Agrobacterium tumefaciens

ДНК виділяли по модифікованому методу Draper з соавт.Через 48 годинспільного культивування агробактерій з тканинами рослин з пробіроквидаляли рослинну тканину, бактерії збирали, центруфугіровалі при 9000 g.
Осад, отриманий з 10 мл інкубаційного середовища ціалізуватися протягом 45 хвпри 370 С в 500 мкл буфера ТЕ (10 мМ трісHCl (pH 8,0), 1 мМ ЕДТА),що містить 1% сарколізата Na і 1,5 мг/мл пронази. Лизати двічіекстрагувати фенолом і двічі хлороформом. ДНК облягали спиртом ірозчиняли в ТЕ-буфері.

2.2.3. Блод-гібридизація тДНК по Саузерн

З метою додаткової перевірки наявності індукції процесингу і присутностів пробах pBR322 татальную ДНК агробактерій в кількості 5 мкг наносили влунки 0,8% агарозного гелю і проводили електрофорез при 25-100 В протягом
2 годин в буфері, утримуючи?? ем: 40 мМ трис-ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЕДТА і 5мкг/мл бромистого етидій. В якості маркерів молекулярної вагивикористовували ДНК фага (, гідролізувати рестріктазной ендонуклеази Hind
III. Блод-гібридизацію проводили на ----- фільтрах. Як зондаіспользвать ДНК плазміди pBR322, мічену 32 - за допомогою ДНК-полімеразноїсистеми.

2.2.4. Трансформація клітин Esherichia coli

Штами E. сoli HB101 вирощували в рідкому середовищі LB при 370 С до концентрації
5 * 107 клітин/мл (А600 = 0,45). Для кількісного вивчення процесингутДНК використовували комплементарні клітини бесплазмідного штаму E. сoli
HB101, які трансформували тотальної ДНК агробактерій, яка булавиділена (М-2), що зазнали різну переробку. Трансформантів кожноговаріанту висівали на три чашки Петрі з агарізірованной середовищем LB,містить Ампіцилін (50 мкг/мл). Кількість колоній підраховували. Уконтрольних експериментах клітини трансформували плазміди pBR322, іінший контроль не піддавалась трансформації і колоній виявлено небуло.

3. результати

Для виявлення процесингу агробактеріальної тДНК, індукованогоексудату аналізованих рослин, в роботі застосовували метод "порятункуплазміди ", запропонований Koukolikova-Nikola з співавт. Цей метод заснований навикористанні модифікованої Ti-плазміди pGV385 [11], що містить міжправої та лівої межами значно делетірованной вихідної тДНКбактеріальної плазміди вектор pBR322. Таким чином, індукуванняпроцесингу тДНК у модифікованому Ti-плазміди pGV3850 можна простежуватипо вирізанню з неї низькомолекулярного фрагмента ДНК, до складу якоговходить плазміда pBR322. Цей процес можна тестувати різними методами.
Один з них - це трансформація клітин E. сoli тотальної агробактеріальної
ДНК і відбір трансформантів з селективним маркерні ознаками плазмідиpBR322 - стійкою до антибіотиків. Іншим методом може бути блод -гібридизація - аналіз тДНК за допомогою плазміди pBR322 якгібрідізаціонного зонда. Обидва цих методи були використані в ційроботі. Порівняли ефективність індукції процесингу ексудату різнихрослин проведено по відношенню до активності 100 мкМ ацетосірінгона.
Відомо, що це токсіфенольное з'єднання, що виділяється деякимидводольними рослинами, належить до сигнальних молекул, які індукуютьвирізування і перенесення агробактеріальної тДНК.
Результати трансформації клітин E. сoli НВ101 тДНК підданих впливуексудатів листя різних рослин представлені в таблиці.
Таблиця 3.1.
Фактори індукції | Кількість трансформованих E. Coli | | L. perpusilla
(ряска)
L. perpusilla (ряска)
Ацетосірінгон (контроль)
Льон довгунець
Nicotiana tabacum (тютюн)
Без ацетосірінгона і трансформації | 25 колоній
30 колоній
35 колоній
40 колоній
30 колоній
- | |
Ексудати листя ряски індукувати вирізування тДНК, що єдоказом присутності в їх складі сигнальних з'єднань,специфічних для індукції транскрипції генів vir агробактеріальної Ti -плазміди.
Прямий блод-гібрідізаціонний аналіз тДНК агробактерій св