Білки насіння як маркери у вирішенні проблем генетичних
ресурсів рослин, селекції та насінництва
А. В. Конарев, В. Г. Конарев, Н. К. Губарева, Т. І. Пенева.
Обговорюються
основні напрямки і перспективи використання білкових і ДНК-маркерів в
вирішенні прикладних та теоретичних проблем генетичних ресурсів рослин,
селекції, сортовипробування, насінництва та насіннєвого контролю. Розглянуто конкретні
приклади практичного використання білкових і ДНК-маркерів для вирішення
найважливіших проблем прикладної ботаніки, генетики та селекції.
Світові
генетичні ресурси рослин розглядаються в усьому світі як основний
джерело поліпшення сільськогосподарських культур на найближчі десятиліття.
Створення джерел і донорів селекційно важливих ознак, тобто організація
предселекціонной роботи, в більшості випадків базується на світових
генетичних ресурсах або колекціях культивованих рослин та їх диких
родичів. Розкриття потенціалу генетичних ресурсів за основними біологічним
і селекційним ознаками забезпечує генетичну базу для реалізації
селекційних програм різних напрямків. У цілому ж предселекціонная робота
включає всі етапи роботи з генофондом від збору, підтримки та вивчення до
правових аспектів авторства на донори і джерела цінних ознак. Щоб
служити ефективною базою для поліпшення культур, які зберігаються в центрах
генетичних ресурсів рослин (ГРР) і генних банках генетичну різноманітність
повинно бути не тільки ретельно і всебічно вивчено. Самі колекції повинні
бути раціонально організовані. Строго кажучи, кожен зразок колекції повинен
бути ідентифікований і паспортизовані. Збереження генетичної цілісності зразків
також входить в розряд принципових проблем. Мова йде про збереження не тільки
зразка як такого, але з його цінні властивості, зокрема адаптивними і
ін ознаками.
Під
Всеросійському НДІ рослинництва ім. М. І. Вавілова (ВИР) пізнання генетичного
різноманіття культурних рослин та їх дикорослих родичів традиційно
здійснюється з використанням комплексу методичних підходів на базі тісної
взаємодії кураторів культур і фахівців методичних відділів [1,2].
Принципова перевага такої системи оцінки вихідного матеріалу для
селекції в можливості достатньо глибокого і всебічного вивчення
максимального різноманіття культури. В ефективності пізнання генофонду
вирішальна роль належить методам дослідження.
З
моменту свого заснування ВИР був методологічним і методичним центром в
галузі фундаментальних і прикладних проблем рослинництва. Ця роль випливає
з його структури і основних завдань. Наявність світового генофонду по більшості
провідних культур створює сприятливі умови для розвитку методологій,
підходів і, як наслідок, методів досліджень генофонду - початкового і
селекційного матеріалу. Практично це було реалізовано в розвитку методів
генетики, імунології, фізіології, біохімії, технологічної оцінки стосовно
до проблем вихідного і селекційного матеріалу [1]. Саме за такою логікою
закладалися і розвивалися у вирі молекулярно-біологічні дослідження. У
основу всіх методичних підходів також покладено охоплення всього доступного
генетичного різноманіття культури, включаючи дикорослих родичів [3,4].
що розвиваються
у вирі молекулярно-біологічні дослідження орієнтовані на вирішення
теоретичних і прикладних проблем інтродукції, вивчення, зберігання,
відтворення, ідентифікації і реєстрації та паспортизації генетичних
ресурсів рослин. Особлива увага приділяється розробці ефективних методів для
використання в сортовипробуванні, селекції, насінництві та насіннєвому контролі
(Табл. 1).
Таблиця
1.
Використання
білкових і ДНК-маркерів (молекулярних маркерів - ММ) на різних етапах роботи
з генетичними ресурсами рослин (ГРР) і з селекційним матеріалом
I.
Інтродукція ГРР.
Пошук
з використанням ММ нового різноманіття для залучення до колекції.
Використання ММ для контролю процесу включення в колекцію нового зразка
(для запобігання дублювання).
II.
Структура колекції
З'ясування
з використанням ММ внутрішньовидових зв'язків і міжвидових відносин:
а)
використання поліморфізму білків і ДНК для аналізу внутрішньовидових зв'язків;
б)
аналіз спорідненості видів і геномів з використанням білкових і ДНК-маркерів.
III.
Технології створення колекцій
Використання
ММ для ідентифікації та реєстрації ГР найважливіших культур, створення каталогів
формул і баз даних по молекулярною маркерами, для виявлення помилок у визначенні
зразків колекції, для пошуку дублетних зразків, при формуванні стрижневих
колекцій, для контролю стабільності форм при створенні колекцій in vitro.
IV.
Збереження ГРР ex situ
Використання
ММ для контролю за генетичною цілісністю зразків при їх репродукції та
різних способах зберігання.
V.
Охорона авторських прав ВИР на джерела, донори, форми з генетичних колекцій
Ідентифікація та реєстрація з використанням ММ джерел і донорів цінних
ознак, зразків генетичних колекцій.
Використання
ММ у вирішенні спірних питань авторства - участі того чи іншого вихідного
матеріалу у створенні нових форм рослин.
VI.
Використання молекулярних маркерів в селекції Пошук та відбір цінних генотипів
по білкового фенотипу. Контроль за включенням бажаних генотипів в процесі
селекції. Контроль за динамікою популяційного (генотіпного складу).
Визначення
гібридність насіння, пророкування скрещіваемості, пророкування ступеня
гетерозису, інші завдання селекції.
VII.
Використання ММ в сортовипробуванні
Реєстрація
і документація районованих і знятих з районування сортів у вигляді білкових
формул; створення баз даних сортів за білковим формулами. Визначення
походження та оригінальності сорту. Визначення однорідності та стабільності
сорту (генетична цілісність сорти).
VIII.
Використання ММ в насінництві та насіннєвому контролі Перевірка типовості при
відборі кращих рослин у первинному насінництві. З'ясування природи нетипових
рослин.
Контроль
за спонтанним перезапилення або засміченням.
Контроль
за генетичною цілісністю (за генотіпним складом в процесі насінництва,
відсотком гібридність і т.п.).
Молекулярне
маркування засноване на поліморфізм, знайденому в білках та нуклеїнових
кислотах. Перед тим, як маркер може використовуватися для вирішення будь-яких
конкретних завдань, коректність його використання повинна бути аргументована з
генетичних і біохімічних позицій [4-6]. Солідне генетичне обгрунтування
використанню проламіни як генетичних маркерів було дано в роботах
академіка О. О. Созінова та його школи (7-9). Як немає ідеальних молекулярних
маркерів, так і останні не є інструментами, використання яких в
ізоляції від інших підходів, що забезпечать успіх у вирішенні тієї чи іншої проблеми.
В
роботі з ГРР, а також і у вирішенні проблем селекції та насінництва, де
аналізуються та порівнюються багатьох об'єктів, одним з важливих аспектів у
оцінці ефективності ММ і маркерних технік є відтворюваність
результатів і повторюваність дослідів, тобто можливість стандартизації методу. Так
багато ізоферментние системи мають украй небажаної для маркерів
онтогенетичної, тканинної або органної специфічністю, а також мінливістю
в залежності від температури та кислотності середовища, режиму харчування і т.п. Це
сильно знижує значимість ізоферментів як генетичних маркерів, особливо якщо
ставиться завдання розробки стандартних і арбітражних методів [2,4].
Інакше
справи з запасними білками насіння. Принципово важливо, що насіння --
фіксована фаза онтогенезу. Запасні білки насіння залишаються незмінними часто
протягом багатьох років. Відтворюваність результатів і повторюваність дослідів по
електрофорез запасних білків гарні [6,7,10,11]. З використанням запасних
білків насіння як маркерів пов'язані реальні практичні досягнення в
ідентифікації та реєстрації сортів найважливіших сільськогосподарських культур, в
насінництві та насіннєвому контролі, що закріплено в рішеннях такої авторитетної
міжнародної організації як ISTA і ряду інших [12-14].
Використання
ДНК-маркерних технологій привертає дослідника насамперед можливістю
працювати з самим носієм спадкової інформації. Однак для найбільш
простих у виконанні методів (RAPD) характерні погана відтворюваність і
домінантний характер маркера (неможливість розрізнення гомо-і гетерозиготних
генотипів). Більш досконалі методи трудомісткі і дороги у виконанні. Подробнее
про це [2,15,16]. Висновок про недостатню готовність ДНК-маркерних
технологій для широкого використання в сортової ідентифікації і насінному
контролі зроблено спеціальної Робочої Групою ISTA (ISTA NB. No 113, 1997).
Практично до аналогічних висновків, але тільки у зв'язку з рішенням широкого кола
проблем генетичних ресурсів рослин (особливо практичних проблем генних
банків) прийшли учасники робочої наради, організованого Міжнародним
Інститутом генетичних ресурсів рослин (IPGRI) [16].
В
працях цієї наради [17], а також у технічному бюлетені IPGRI [18], багатьох
інших роботах зарубіжних дослідників останніх років справедливо відзначається,
що різні ДНК-маркерні системи (в першу чергу, найбільш доступні такі
як RFLP, RAPD, AFLP) досить широко і ефективно використовуються для з'ясування
ступеня споріднення (або генетичних зв'язків) на внутрішньовидових і міжвидових
рівнях. Не дивлячись, як було сказано вище, на досить песимістичну
оцінку перспектив і можливостей ДНК-маркерних систем для вирішення більшості
прикладних проблем генетичних ресурсів рослин, повністю ігноруються
реальні досягнення і практичне широке і багаторічне використання в цих
цілях поліморфізму запасних білків (табл. 2) [2-15,19]. Так, наприклад, всі
проблеми ідентифікації і реєстрації сортів (та генетичних ресурсів рослин в
цілому), практичні проблеми раціональної організації колекцій планується
вирішувати виключно з використанням ДНК-маркерів [16-18]. При цьому не
наводиться жодної розробленої системи ідентифікації та реєстрації
генетичних ресурсів культури або групи культур, жодного прикладу реального
практичного використання ДНК-маркерних систем в сортовипробуванні або насіннєвому
контролі. Створюється враження, що прихильники виключно для використання
ДНК-маркерів у вирішенні проблем генетичних ресурсів рослин, насінництва та
насіннєвого контролю з якоїсь причини зовсім не знайомі з великим об'ємом
інформації (світовою літературою), що стосується практичного використання білків
в якості маркерів, не мали справу з реальним генетичним різноманітністю виду
або культури, а також з практичними проблемами ідентифікації сортів,
насінництва і насіннєвого контролю.
Таблиця
2.
Результати
діяльності ВИР ім. Н. І. Вавілова з вивчення та реєстрації генетичних
ресурсів рослин з використанням білків насіння як маркерів
Назва роду
Число вивчених н
зареєстрованих:
Видано:
Видів
Сортів н дикорослих популяції
Каталогів білкових формул
Метод, вказівки
Пшениця
20
4300
12
4
Ячмінь
17
255
1
3
риючись
7
180
1
Овес Тритикале
19
1
215 500
1
3
Етнлопс
25
2080
4
Кукурудза
1
410
2
1
РНС
17
1776
Сорю
28
155
Пиреі
40
120
Елнмус
33
68
Житняк
4
25
Колосники
8
17
Овсяниця
50
26
1
Плевел
9
168
1
Їжака Мятлик Інші злакові
3 30 131
173 120 1260
1
Квасоля Інші бобові Картопля
88 118 44
102 510 300
1
Буряк
13
300
2
Капуста
Лук Амарант
20 27 5
209
18
105
1
Соняшник Льон
30 6
700 40
2
2
Гречка
4
150
Плодові Ягідні Цитрусові
33 21 13
333 160
47
Куфня
26
36
Хохоба
1
50
Цитрусові
13
47
Поширеною
методичною помилкою, що зустрічається в роботах зарубіжних і вітчизняних
дослідників є змішання понять ідентифікація і диференціація або
розрізнення сортів, генотипів і т.п. Дослідники, що пропонують нові методи
ідентифікації сортів, зразків, гібридів тощо, часто взагалі не вдадуться в
подробиці вимог, що пред'являються до такого роду методів у державних
чи інших структурах, які мають справу з ідентифікацією та реєстрацією сортів,
насіннєвим контролем. Ідентифікувати сорт (генотип, гібрид, лінію, клон) в тому
числі значить гарантовано дізнатися його з використанням даного методу в будь-який
ситуації. Для цього треба мати каталоги та бази даних, що охоплюють
генетичне різноманіття культури або в цілому виду (див. нижче). Надійний метод
запису спектрів ДНК і білків (номенклатура компонентів спектру ММ) --
принциповий елемент будь-якої стандартної системи ідентифікації та реєстрації
сортів за ММ [3,4,7-13]. Тільки в цьому випадку можливий обмін даними між
контролюючими лабораторіями незалежно від їх приналежності (генні банки,
комерційні і державні контрольно-насіннєві лабораторії і т.п.) [14].
Під
ВННІР ім. Н. І. Вавілова ще на початку 70-х років В. Г. Конарева, І. П. Гаврилюк і
Н. К. Губарева було розроблена номенклатура компонентів електрофоретичної
спектрів гліадин [3-6]. Принципова відмінність запропонованої номенклатури
полягає в тому, що вона базується на результатах докладного вивчення
внутрішньовидової мінливості маркерного білка у світовій колекції. Надалі
ця ідея була реалізована для запасних білків насіння більшості найважливіших
культур (Табл.2). Використовуючи еталонний спектр, складений для культури можна
записати спектр будь-якого сорту, біотипів, зразка у вигляді так званих білкових
формул [4,14]. У першу чергу це було здійснено для великої кількості пологів
злаків, що включають найважливіші зернові та кормові культури (табл. 2). Був
складений єдиний еталонний спектр пролили-нов злаків триб пшеніцевих (Triticeae
Dum.), Овсов (Aveneae Dum.), Тімофеевкових (Phleeae Dum.) І мятлікові (Роеае
R. Br.). Цей спектр був заснований на вивченні спектрів пролили-нов десятків
тисяч окремих насіння (генотипів), що включають всі можливі позиції цього
білка. Крім того, для кожної культури був складений робочий еталонний спектр
проламіни [4,19].
Поліморфізм
запасних білків насіння бобових - глобулінів був використаний в сортовий
ідентифікації зернових бобових культур - гороху, сої, вики, люпину, кормових
бобів, а також кормових бобових трав (конюшина, люцерна, буркун). У бобових як і
у низки інших дводольних рослин для цілей ідентифікації було залучено 7S
(віціліноподобние) і 11S (легуміно-подібні) глобуліни [4,19]. В даний
час у ВНІІР ім. Н. І. Вавілова сортовий ідентифікація за спектрами запасних
білків (глобулінів) здійснюється у багатьох інших дводольних рослин, в
Зокрема соняшнику, буряка, капусти, салатних рослин, ріпаку, гірчиці,
гречки та багатьох інших (табл. 2) [4,19]. Так за результатами порівняльного
аналізу 150 представників різних видів капустяних (Brassica L.) був
складений еталонний спектр круціферіна (глобуліну) для представників даного
роду, що включає важливі кормові, овочеві та техніч?? Електричні культури. За таким
спектру записуються формули круціферіна видів, сортів, ліній, гібридів
представників цього роду [20].
Аналогічним
чином був складений сумарний (еталонний) спектр геліантініна (глобуліну
соняшника). Спектр складається з усіх можливих позицій поліпептидів цього
білка, виявлених до теперішнього часу при аналізі внутрішньовидової мінливості
[4,19], що дозволяє ідентифікувати і реєструвати всі внутрішньовидової
різноманітність соняшнику, включаючи сорти, лінії, гібриди [21]. Класифікації
електрофоретичної спектрів гліадин були розроблені також фахівцями
Франції, Канади та ряду інших країн [10-12]. Генетична номенклатура спектрів
і компонентів проламіни пшениці і ячменю була запропонована і успішно розвинена в
роботах А. А. Созінова та його учнів [7-9].
Під
ВНІІР ім. Н. І. Вавілова генофонд сортів і дикорослих зразків документується
у вигляді білкових формул. Отримана інформація зберігається у вигляді каталогів
формул (табл. 2) і комп'ютерних баз даних формул. Для надійної ідентифікації та
реєстрації сортового генофонду провідних зернових культур та їх дикорослих
родичів в більшості випадків досить електрофорезу запасних білків.
Іноді доводиться використовувати інші типи білків, наприклад глютеніну або
інгібітори протеолітичних ферментів [4, 6, 19].
Принциповою
є проблема відповідності понять статусу сорту в загальноприйнятому сенсі і з
використанням молекулярних маркерів. Для коректного підходу до питання
попередньо проводяться спеціальні дослідження на великому обсязі сортів і
на внутрішньовидової різноманітності диких родичів. Найбільш складно справа йде з
перекрестноопиляющіміся культурами, оскільки кожен сорт або зразок
являє собою складну суміш різних генотипів, яким відповідають
різні типи спектру білка або ДНК. Така сортова або дикоросла популяція
може бути ідентифікована та зареєстрована за наявності певних типів
спектру і частоті їх зустрічальності [4,19]. Після сформування баз даних
(комп'ютерних або каталожних) відкриваються реальні можливості використання
білкових або ДНК-маркерів для вирішення низки практичних питань колекцій,
наприклад, деяких проблем інтродукції або поповнення колекції (табл.1). На
підставі порівняльного аналізу інформації закладеної в каталоги або в бази
даних у вигляді білкових формул, а також інформації, отриманої при аналізі знову
що надійшов насіннєвого матеріалу, може бути зроблено попередній висновок про
ступеня оригінальності останнього (з метою запобігання дублюванню
зразків). Багаторічний досвід ВИР показує, що така інформація, як правило,
в подальшому підтверджується так званими традиційними методами [2].
Для
оцінки ступеня генетичних відмінностей між зразками, наприклад, зразками
різного географічного походження, або культурними і дикими формами широко
використовуються ДНК-та білкові маркери. Під ВНІІР ім. Н. І. Вавілова ми використовували
ПДРФ-маркери (RFLP) у вивченні генетичної диференціації ячменю. Однак, для
аналізу великих колекцій метод ПДРФ досить трудомісткий. Тут зручніше
використовувати більш простий і досить чутливий RAPD-аналіз. Такі
роботи, зокрема, були проведені Виром спільно з Національним Інститутом
Сільськогосподарських Досліджень (Японія) на зразках дикого і культурного
ячменем з колекції ВИР, а також на ряді інших колекцій [22]. Метою роботи
була оцінка взаємин між різними формами культурного та дикого
ячмінь за поліморфізму фрагментів ДНК, ампліфикувати в полімеразної ланцюгової
реакції з довільними праймерами (RAPD). Отримані результати дозволили
розділити вивчені сорти та місцеві популяції на три основні групи, які,
очевидно, відображають основні тенденції в еволюції і географічному
поширення культурного ячменю. Виявлено відповідність виділилися груп
і кластерів культурного ячменю світовим центрам різноманітності культурних рослин
(генцентрам), виявленим М. І. Вавілов, а також сучасної
еколого-географічес-кой класифікації ячменю [22].
Аналогічний
експериментальний підхід був застосований для з'ясування структури колекцій
гексаплоїдної пшениць. Методом RAPD-аналізу вивчена ступінь споріднення між
зразками гексаплоїдної пшениць різних еколого-географічних груп (більше 400
зразків з колекції ВИР). Дослідження проводилися також у тому числі і в
зв'язку з можливістю маркування генотипів з високим рівнем зимостійкості, а
також у зв'язку з відпрацюванням технології створення стрижневих колекцій. Результати
координатного та кластерного аналізу цих даних продемонстрували, що всі
вивчені зразки гексаплоїдної пшениць є єдиним генний пул,
який ділиться на чотири великі групи. Виявлена поділ знаходиться в повному
Відповідно до еколого-географічної класифікацією запропонованою М. І. Вавілов
[23]. Вдалося ідентифікувати праймери, що дозволяють виділяти групи зразків з
цінними адаптивними властивостями (наприклад, холодостійкість). Це свідчить
про перспективність даного підходу до аналізу світової колекції як вихідного
матеріалу для селекції з найважливіших ознаками. Подібні дослідження з
використанням ДНК-маркерів проведені нещодавно співробітниками ВИР на колекціях
вівса, проса, вікі, рису. Використанню білкових маркерів для вирішення питань
внутрішньовидових зв'язків присвячена велика кількість публікацій, в тому числі співробітників
ВИР [4,7,10,11,19,24].
Аналіз
міжвидового (междугеномного) спорідненості має значення не тільки для вирішення
питань філогенії і систематики, але, головним чином, для селекції,
що базується на методах віддаленій гібридизації. Молекулярно-біологічні методи
(ДНК-гібридизація, імму-нохіміческіе методи, електрофорез білків) були на
першому етапі застосовані для аналізу спорідненості видів і геномів, ревізії схем
філогенії і походження геномів, створених на базі класичних, в тому числі
цитогенетичних методів. У вирі застосування ефективних імму-нохіміческіх
підходів і методів для геномного аналізу пшениць і егілопсов призвело в 70-і роки
до принципово нового вирішення питання походження першого геномів м'якою і
твердої пшениць [4,19,25], що дозволило відділу пшениць ВИР створити нову систему
роду Triticum L. [26]. Два роки по тому наші дані про походження першого
геному м'якої і твердої пшениць від диплоїдного виду близького до сучасної
однозернянку T.urartu Thum. були підтверджені британськими цитогенетики [27] та
лише 14 років по тому в 1988 році і американськими генетиками і молекулярними
біологами з використанням ДНК-геномних маркерів [28]. Аналіз міжвидового і
геномного спорідненості був здійснений у вирі з використанням геномноспеціфічних
білкових маркерів у багатьох культурних рослин та їх диких родичів [4,6,19].
Для аналізу міжвидових (межгеномних) відносин, вирішення питань філогенії в
Вирі використовуються також RAPD-і RFLP-маркери [29,30].
Для
нормального існування колекцій, а також для підвищення ефективності їх
використання в селекційному процесі та дослідницькій роботі важливу роль
відіграє дотримання певних норм і принципів формування таких колекцій.
Так
при пошуку помилок у визначенні зразків колекції у ряді випадків дуже корисні
можуть бути білкові або ДНК-маркери. Характерним є приклад роботи з
колекцією виду T.persicum Vav., проведеної ще в 70-і роки. Представники
цього тетраплоідного види пшениці морфологічно дуже важко відрізняються від так
званої «персікоідной» форми гексаплоїдної пшениці. Після вивчення білків
насіння колекції T.persicum методом електрофорезу з'ясувалося, що з 116
зразків 38 виявилися гексаплоідамі типу «персікоідес» [2]. Звичайно, можна було
вивчити всю колекцію каріологіческім методом, але це досить трудомісткий
процес.
диплоїдні
пшениці T.urartu і T.boeoticum відрізнити по морфології в змозі тільки вузькі
фахівці. За допомогою електрофоретичної і, особливо, серологічних маркерів
зробити це не становить труднощів [4,19]. До опублікування наших робіт у 1974
році [25], багато закордонних генетики та трітікологі взагалі не визнавали пшеницю
Урарту за самостійний вид. Збереження ГРР ex situ. Завдання ex situ
консервації є підтримання зразків без зміни їх генетичної конституції
[17]. Необхідно звести до мінімуму можливість змін, що відбуваються з
зразками допомогою мутацій, селекції, випадкового дрейфу або засмічення. Це
одна з найважливіших умов повноцінного функціонування генних банків будь-яких
організмів. Контроль за генетичною цілісністю - справжністю, чистотою
що зберігається (і періодично пересівати) матеріалу - найважливіше завдання генного
банку. Проблема ідентифікації у світових колекціях дублетів і так званих
дуже схожих зразків гостро постала у генних банках, особливо з великими
колекціями. У вирішенні всіх цих завдань молекулярні технології виявилися дуже
корисними [2,4, 17,19, 31-33]. Так у вирі накопичений великий досвід по
використанню спектрів запасних білків насіння для аналізу динаміки популяцій
перекрестноопиляющіхся культур (і генотипічну складу самозапильні) в
процесі репродукції зразків. У колекції ВИР зберігається велике число
зразків старих російських місцевих сортів м'якої озимої пшениці та інших місцевих
сортів і форм. Було показано, що старі сорти, сорти народної селекції мають
більш високий рівень популяційного поліморфізму в порівнянні з сучасними
сортами, що робить їх цінним джерелом генетичного різноманіття для
поліпшення сучасних сортів [4,19,34,35]. Завдання генних банків і центрів
генетичних ресурсів рослин не тільки зібрати, зареєструвати і вивчити
ці зразки, а й зберегти все багатство генетичної мінливості цих
унікальних форм.
Спеціальні
дослідження були проведені у вирі на 6 зразках стародавніх м'яких пшениць --
Банатках. Протягом трьох років (1988-89, 89-90,90-91) зразки висівали на
Кубанської ОС ВИР. Контроль за складом генотипів здійснювався за спектрами
гліадин. Було показано, що у зразка до-4816 протягом трьох років концентрація
домінуючого генотипу «а» знизилася з 78% до 52%, а генотипу «в» підвищилася з
6 до 33%. У зразка до-10230 концентрація домінуючого генотипу «а» знизилася з
84% до 57%, а генотипу «б» підвищилася з 7% до 31%. Таким чином, через три
року репродукції генотіпний складу зразків дещо змінився [35,36].
Генетичні
колекції - особливо цінний матеріал, збереження якого пов'язана з багатьма
методичними труднощами. Білкові маркери використовуються у вирі для контролю за
стабільністю генотипів рослин, що представляють генетичні лінії, для ідентифікації
чужорідних транслокації, мутацій, зміни числа і складу хромосом. Так
порівняльний аналіз спектрів гліадин соротов-оригіналів м'якої пшениці з
транслокації та заміщення пшеничного хромосоми на житнє (1B/1R) та їх
репродукцій показав, що що у ряду репродукованого зразків зустрічаються
генотипи з відсутністю гліадінових маркерів короткого плеча хромосоми 1RS жита.
Ці та інші приклади вказують на необхідність контролю чистоти і
цілісності колекцій в процесі їх репродукції.
Будь-який
охоронець (власник) генетичних ресурсів зацікавлений забезпечити як
охорону своїх авторських прав на вихідний матеріал, джерела і донори, так і
офіційне визнання участі цього генетичного матеріалу у створенні тих чи
інших сортів у своїй країні і за кордоном. ММ роблять тут реальну допомогу,
забезпечуючи незалежну інформацію про походження та ступеня споріднення
генетичного матеріалу порівнюваних зразків. У вирі накопичений великий досвід
використання білкових маркерів у вирішенні спірних питань авторства сортів, їх
оригінальності, автентичності, чистоти, природи вихідного матеріалу і т.д., коли
використання набору традиційних методів, в тому числі і грунт контролю, не
давало бажаного результату [4,19]. Ефективність такої роботи багато в чому забезпечується
наявністю в ВИР каталогів білкових формул і баз даних цих формул з інформацією
про сотні сортів, в тому числі давно знятих з районування, а також про багато
зразках різного походження, що зберігаються в колекції (табл. 2). Важливо
підкреслити, що навіть не будучи тестом, який може бути офіційно визнаний
як єдиний аргумент, молекулярний метод забезпечує попередню,
незалежну та оперативну інформацію.
Використання
молекулярних маркерів в селекції. Білкові маркери протягом останніх
десятиліть використовуються в селекційних програмах для вирішення багатьох питань
(табл. 1). Цьому присвячена велика кількість вітчизняних і зарубіжних публікацій
[6,7]. У вирі проламіновие спектри, зокрема, використовуються для відбору
певних генотипів (за відповідними типами спектра) при селекції
різних культур. Так в ході селекції сорти озимої пшениці «Тюменська рання»
за допомогою спектрів гліадин формувався «бажаний» генотіпний склад
створюваного сорту (НІІСХ Північного Зауралля).
Вельми
наочним є приклад зв'язку між білкової формулою генотипів у сортів
озимої м'якої пшениці і стійкістю цих генотипів (сортів, що мають дані
генотипи) до низьких температур. Одним з основних властивостей, яким повинна
володіти озима м'яка пшениця є зимостійкість. З характеристик,
обумовлюють зимостійкість, найбільш вивчена морозостійкість. Остання
контролюється багатьма генами, локалізованими в різних хромосомах. Це,
природно, утруднює дослідження ознаки зимостійкості, його маркування та
відповідну селекцію. За даними А. А. Созінова і співробітників [7] сорти озимої
пшениці, у складі спектрів гліадин яких присутні певні блоки
компонентів, мають підвищену зимостійкістю. Відповідно до біохімічної номенклатурі
компонентів гліадин, розробленої у вирі це відповідає компонентів: г2щ78
(блок Gld 1A1), г1щ67 (блок Gld 1A2), г13щ5819 10 (блок Gld 1D5), 62467в1 (блок
Gld 6A3) і 657в245 (блок Gld 6D2). Дослідження були проведені на великій кількості
сортів озимої м'якої пшениці (близько 300) різних екологічних груп (груп
селекції) [36]. Морозостійкість рослин визначалася методом прямого
проморожування в посівних ящиках. Діфференціірующімі температурами були-15С і
-18С. Дійсно, більшість сортів з високою і підвищеної морозостійкістю
характеризується зазначеними вище блоками (групами) компонентів гліадин. Так на
великій кількості сортів показано, що наявність генотипу з компонентами 62467 і щБ ^
10 надає сорту підвищену морозостійкість (табл. 4) [36]. Справа, однак,
ускладнюється в ході аналізу генотип-ного складу сортів. Як правило, не вдається
забезпечити 100% концентрацію видатних генотипів за однією ознакою і
селекціонери змушені «розбавляти» сорт іншими генотипами, що забезпечують
інші характеристики, але, що володіють меншою зимостійкістю. Особливо добре
це помітно під час аналізу родоводів деяких наших вітчизняних сортів озимої
м'якої пшениці. У родоводу озимих м'яких пшениць одеської селекції на першому
етапі присутній морозостійкий сорт Гостіанум 237 (група морозостійкості 1).
З'ясовано, що якщо після подальших схрещувань отримані сорту за
проламіновим спектрами були близькі до Гостіанум 237 (зокрема, за наявністю і
частоті генотипів з компонентами 62467 і компонентами 8х9 10 в
щ-зоні), вони також мали гарну морозостійкість. Таким чином, спектри
гліадин можна використовувати для визначення потенційної морозостійкості
сортів озимої м'якої пшніци в межах певних груп селекції. При цьому
необхідно знати білкову формулу генотипу (генотипів) морозостійкого сорту,
який з'явився джерелом даної ознаки в ході селекції. Це дозволить вести
контроль за включенням його генетичного матеріалу в знову створювані сорти.
В
даному випадку здавалося б мова йде про використання простий маркерне системи
для маркування полігенно ознаки (морозостійкість). Але фактично
маркується не ознака, а те що називається інтегральним станом геному.
Маркується генотип разом з його адаптивним генним комплексом. Тому
згаданий специфічний спектр не є в строгому сенсі маркером
морозостійкості (хоча не можна заперечувати і адаптивного характеру поліморфізму
проламіни). Трактувати такого роду дані треба дуже обережно і стосовно
до конкретних маркерами і обставин.
В
Вирі за останні 20 років проведено широкомасштабні дослідження генофонду
культурної та дикоростучої жита по поліморфізмусекаліна. Поряд з ідентифікацією
і паспортизацією світового генофонду значну увагу було приділено проблемам
селекції. Фактично розроблені підходи до селекції жита, що супроводжується
молекулярними маркерами [2,19,33].
Прикладом
використання поліморфізму проламіни для супроводу селекційного процесу
є історія створення сорту жита Ільмень. Використання в селекції
короткостебельних сортів донора короткостебельності ЕМ 1 для схрещування з
високорослими звичайними сортами звичайно завершується виділенням і відбором
короткостебельних рослин. Цей процес призводить до зменшення рівня
популяційного поліморфізму, що виражається у відповідних характеристиках
молекулярного поліморфізму [33]. Практичним наслідком є зниження
продуктивності, рівня адаптивності (знижується стійкість до несприятливих
факторів), погіршуються інші господарські ознаки. Причини негативних даних
явищ були пояснені на основі даних молекулярного аналізу популяційного
поліморфізму сімейства сортів Малюк. На цьому етапі селекції не вдалося
досягти оптимального рівня генетичного поліморфізму, що відбилося на
адаптивних властивостях популяції, а також на продуктивності сорту.
Оптимальний
рівень поліморфізму був досягнутий фактично менш жорстким відбором після
повторного схрещування з Вятка-2 (за даними молекулярного поліморфізму
збагачення популяції проходило за рахунок рідкісних генотипів). В міру зростання
внутріпопуляціонно-го різноманіття збільшувалася і продуктивність у подальших
варіантів сорту - Малюк 77-79 рр. і особливо далі у сортів Росіянка і Ільмень.
Таким
чином показано, що аналізуючи приховану генетичну мінливість можна не
тільки контролювати склад популяцій у ході штучного відбору,
насінництва, впливу середовища і т.д., але і грунтуючись на основних положеннях
популяційної генетики розкривати причини тих чи інших явищ, ставити діагноз,
вказувати способи вирішення і передбачати практично важливі селекційні
наслідки для різних культур.
Білкові
маркери з успіхом використовуються для визначення гібридність насіння (сортів)
злакових трав [2,19,24], буряка [37], різних видів капусти і гірчиці [20,38],
соняшнику [2,19,21], кукурудзи [2,19,39] та багатьох інших культур, а також
для прогнозування ефекту гетерозису сорго за продуктивністю [40,41].
Використання
білкових маркерів в сортовипробуванні. З кінця 70-х років білкові маркери поряд
з польовими і лабораторними методами використовуються в системі Державної
комісії з сортовипробування сільськогосподарських культур при міністерстві
сільського господарства СРСР для встановлення оригінальності, однорідності та
константності сортів пшениці, ячменю та вівса [31,42]. Слід зазначити, що
одночасно з методикою електрофорезу білків у поліакриламідному гелі,
розробленої у вирі, для ідентифікації сортів пшениць застосовувалася методика
електрофорезу в крохмальної гелі, запропонована А. А. Созіновим і його учнями
[7,8,42]. Формули проламіни, записи
