ПЕРЕЛІК ДИСЦИПЛІН:
  • Адміністративне право
  • Арбітражний процес
  • Архітектура
  • Астрологія
  • Астрономія
  • Банківська справа
  • Безпека життєдіяльності
  • Біографії
  • Біологія
  • Біологія і хімія
  • Ботаніка та сільське гос-во
  • Бухгалтерський облік і аудит
  • Валютні відносини
  • Ветеринарія
  • Військова кафедра
  • Географія
  • Геодезія
  • Геологія
  • Етика
  • Держава і право
  • Цивільне право і процес
  • Діловодство
  • Гроші та кредит
  • Природничі науки
  • Журналістика
  • Екологія
  • Видавнича справа та поліграфія
  • Інвестиції
  • Іноземна мова
  • Інформатика
  • Інформатика, програмування
  • Історичні особистості
  • Історія
  • Історія техніки
  • Кибернетика
  • Комунікації і зв'язок
  • Комп'ютерні науки
  • Косметологія
  • Короткий зміст творів
  • Криміналістика
  • Кримінологія
  • Криптология
  • Кулінарія
  • Культура і мистецтво
  • Культурологія
  • Російська література
  • Література і російська мова
  • Логіка
  • Логістика
  • Маркетинг
  • Математика
  • Медицина, здоров'я
  • Медичні науки
  • Міжнародне публічне право
  • Міжнародне приватне право
  • Міжнародні відносини
  • Менеджмент
  • Металургія
  • Москвоведение
  • Мовознавство
  • Музика
  • Муніципальне право
  • Податки, оподаткування
  •  
    Бесплатные рефераты
     

     

     

     

     

     

         
     
    Взаємодії білків з РНК - структурний комп'ютерний аналіз
         

     

    Біологія і хімія

    Взаємодії білків з РНК - структурний комп'ютерний аналіз

    Курсова робота

    Виконала студентка 4 курсу, 541 групи Ревтович Світлана

    Самарський Державний Університет

    Самара 2001

    Введення

    1. Огляд літератури

    1.1. Відмінності ДНК-білкових від РНК-білкових взаємодій

    Подвійна спіраль ДНК - це регулярна структура, в якій найбільш істотні відмінності між сусідніми ділянками укладені в послідовності пар основ. В обох жолобка специфічний сайт ДНК для впізнавання білком може бути сформований мережею водневих зв'язків між основами нуклеотидів. Великий жолобок спіралі ДНК доступнішим для контакту, що створює можливість для дискримінації послідовностей в ньому [39]. Заснований на цьому припущенні механізм впізнавання «прямим зчитуванням» був підтверджений для багатьох ДНК-що зв'язують білків. Також було відзначено потенційне значення і «непрямого зчитування». Деякі послідовності ДНК можуть мати зміни в конформації цукрово-фосфатного остову або навіть бути деформовані в незвичайні структури. У такому випадку специфічність зв'язування може визначатися контактами білка з остовом ДНК [40]. Індуковані білком порушення структури ДНК звичними і можуть варіювати за формою від невеликих вигинів, як в сайте Нуклеази EcoRI, до великих вигинів і виведення підстав з Стекінг, як в комплексі з ТАТА-зв'язує білком [24].

    Механізм «Прямого зчитування» припускає, що ДНК-білковими контактами, що визначають специфічність зв'язування, є водневі зв'язки з підставами і гідрофобні контакти з тіміновимі метилом, у той час як енергія неспецифічного зв'язування забезпечується іонними і водневими зв'язками з цукрово-фосфатним остовом. У «непрямому зчитуванні» можуть брати участь і інші види взаємодій, наприклад, в комплексі з ТАТА-зв'язує білком ДНК контактує з гідрофобною білкової поверхнею і ароматичні амінокислоти інтеркаліруются в спіраль ДНК [24].

    Молекули РНК відрізняються від ДНК кількома особливостями, які впливають на можливості білкового пізнавання. По-перше, в РНК ділянки Уотсон-криковських спіралей часто перериваються випинання, внутрішніми петлями і шпильками. Дослідження часто зустрічаються «четирехнуклеотідних» шпильок і консервативних внутрішніх і шпилькових петель Хвороби, методами ЯМР і рентгеноструктурного аналізу виявили специфічні нерегулярні структури, що містять неканонічні пари і випинання. По-друге, спіралі РНК досить короткі, зазвичай менше пального обороту, і мають А-форму, відмінну від В-форми ДНК. А-форма спіралі має дуже глибокий і вузький великий жолобок, що створює труднощі для стеріческіе взаємодії з білками. Однак прилеглий до нерегулярним ділянок великої жолобок може бути доступний для зв'язування [41].

    Наслідком цих відмінностей є те, що білки виявляються перед значно більшим різноманітністю водневих зв'язків і можливостей Стекінг нуклеотидів у разі РНК, ніж це можливо в стандартній спіралі ДНК. Додатковою і вельми важливою особливістю РНК є можливість «теоретичних» взаємодій, які можуть з'єднувати різні ділянки РНК і створювати складні структури. Класичними прикладами є підключення спіралей тРНК в «L-образну» молекулу, виявлена в інтрони групи I «аденозинових платформа», що відкриває спіраль РНК для Стекінг з іншого спіраллю РНК [12], і структура двох взаємодіючих петлями транскриптів RNA I і RNA II плазміди ColE1, так званий «kissing» комплекс [27]. Той факт, що завдяки вторинним і третинним взаємодій може бути створена унікальна структура РНК, підвищує ймовірність специфічної взаємодії білків тільки з цукрово-фосфатним остовом. Ця ситуація може бути крайнім випадком «непрямого зчитування», коли підстави нуклеотидів забезпечують білкове впізнавання тільки визначенням загальної конформації РНК, а не прямими контактами з білком.

    Таким чином, спотворення регулярної структури нуклеїнової кислоти, як видно, більш важливо для впізнавання РНК, ніж для ДНК. Спіраль ДНК досить стабільна структура, в той час як неспарені нуклеотиди і петлі дестабілізують структуру РНК. Комбінація багатого вибору нерегулярних структур в РНК і можливості деформації її структури дозволяють припустити, що РНК-що зв'язують білки будуть використовувати більш широкий вибір стратегій зв'язування, ніж ДНК-що зв'язують білки, і що механізм пізнавання «непрямим зчитуванням» буде серед них більш широко поширений.

    1.2. Ранні уявлення про РНК-білкових взаємодіях

    1.2.1. РНК-що зв'язують структурні мотиви в білках

    Вивчення властивостей РНК-зв'язуючих білків привело до виявлення в цих білках ряду і консервативних мотивів. Їх відкриття дозволило розпочати класифікацію РНК-зв'язуючих білків, виходячи з їхніх структурних особливостей, а також передбачати РНК-що зв'язують властивості білків [8]. В даний час виділяють наступні основні мотиви:

    РНП (ribonucleoprotein) мотив - найбільш поширений, складається з двох коротких послідовностей РНП1 (октамер) і РНП2, розділених приблизно 30 амінокислотами [17].

    S1 мотив - до складу входить п'ять антипаралельних b-тяжів. Ряд консервативних ароматичних і заряджених амінокислот, розташованих в петлі між тяжами b1 і b2, в середині b2, в кінці b3 і в повороті між b4 і b5 знаходяться поблизу один від одного і, ймовірно, формують РНК-що зв'язує ділянка домену [10].

    Домен холодового шоку - складається з п'яти b-тяжів з РНП-послідовністю, розташованої в одному з тяжів і структурно дуже схожий з S1 мотивом [38].

    КН мотив - містить стабільну baabba структуру. [11] Точна роль мотиву в РНК-зв'язуванні невідома.

    Мотив DSRM - має abbba топологію. Можливий ділянку зв'язування знаходиться в петлі між b-тяжем та С-кінцевий a-спіраллю [9].

    RGG мотив - містить 20-25 амінокислот і зазвичай є у комбінації з РНК-зв'язуючими мотивами інших типів. Він складається з близько розташованих поворотів Arg-Gly-Gly (RGG), розташованих серед інших, часто ароматичних амінокислот [8].

    Мотив ARM - складається з 10-20 амінокислот з великою кількістю аргінонов. Зустрічається у вірусних і фагів білках.

    Домени з «цинковими пальцями» - містить послідовності СХ4СХ12НХ3-4Н і відповідне число іонів цинку, пов'язані цистеїну і гістидин [17].

    Інші РНК-що зв'язують мотиви. Існує ряд інших консервативних послідовностей, які не мають гомології з вже перерахованими мотивами. Наприклад, мотив білка-аттенюатора тріптофанового Оперон з B.subtilis. [2].

    1.2.2. Взаємодії білків з тРНК

    Питання про те, як аміноацил-тРНК-синтетази досягають високої специфічності в впізнаванні тРНК, ймовірно, був одним з перших серйозно досліджуваних питань в проблемі РНК-білкових взаємодій. Щоб взаємодіяти з усіма компонентами трансляційного апарату, все тРНК повинні мати досить схожу тривимірну структуру, що значно ускладнює для кожної з 20 синтетаз вибір своїх ізоакцепторних тРНК з пулу тРНК клітини. У зв'язку з цим, можливості до дискримінації досить обмежені і, в основному, зведені до впізнавання нуклеотидів в специфічних позиціях.

    До теперішнього часу визначені елементи впізнавання для 19 з 20 синтетаз. Виявилося, що вони неоднакові для різних синтетаз. Більшість цих ферментів дізнається одну або більше з трьох наступних детермінант:

    по щонайменше, один нуклеотид в Антикодон;

    одну або більше з останніх трьох пар нуклеотидів акцепторній стебла;

    так зване «Дискримінаторні» підставу між акцепторні стеблом і ССА кінцем.

    Крім того, по крайней мере, 8 синтетаз використовують і інші відмітні ознаки.

    Елемент пізнавання може впливати на специфічність аміноацілірованія тРНК, тому що він пізнається «правильної» синтетазою (позитивний елемент) або тому що запобігає взаємодія з «не своєї» синтетазою (негативний елемент). Негативний елемент може маскувати присутність позитивних елементів [32]. Яскравою ілюстрацією цього факту є набори з трьох елементів специфічності близько ССА кінця тРНК для аланіну, гістидину і гліцину. Кожна детермінанта є позитивним елементом для однієї або двох синтетаз і негативним для інших [19].

    Незважаючи на виконання однієї і тієї ж реакції аміноацілірованія, синтетази можуть здійснювати різне зв'язування з субстратом реакції - тРНК, причому елементи впізнавання тРНК не завжди є унікальними, а можуть мати структурний схожість з іншими класами білків.

    1.2.3. Взаємодії білків з матричними РНК

    Механізм мРНК-білкових пізнавання є, мабуть, найменш вивченим питанням у проблемі РНК-білкових взаємодій, через відсутність структур, вирішених з досить високою роздільною здатністю (виняток - комплекс L30-мРНК).

    Однак, спираючись на дані, отримані методом ядерного магнітного резонансу було зроблено припущення, що основну роль у процесі мРНК-білкового пізнавання грають наведені раніше консервативні мотиви. Наприклад, RNP1 і RNP2 (білок U1A), домен холодового шоку і гідрофільний С-кінцевий домен з чергуються кластерами негативно і позитивно заряджених амінокислотних залишків (Y-box-білки).

    1.2.4. Взаємодії білків з рРНК

    Взаємодії білків з рРНК дуже сильно відрізняються від взаємодій білків з ДНК і тРНК. Місця зв'язування білків на ДНК і тРНК характерні наявністю специфічної еволюційно консервативної послідовності нуклеотидів, заміна яких призводить до сильного ослаблення або зникнення взаємодій [1]. Припущення про визначальної ролі послідовності нуклеотидів у РНК-білковому впізнаванні, засноване на дослідженнях комплексів білків-репресор з ДНК та вивченні аміноацил-тРНК-синтетаз, виявляється некоректним стосовно рРНК-білкових комплексам. Оскільки структура ДНК регулярна, саме послідовність підстав, а не конформація кістяка, визначає специфічність зв'язування. Таке ж можна сказати про комплекси аміноацил-тРНК-синтетаз з відповідними тРНК, оскільки просторові структури тРНК однотипні і специфічність пізнавання залежить саме від послідовності основ у певних ділянках молекули тРНК.

    рРНК, на відміну від ДНК і тРНК, містить багато нерегулярних ділянок, і Рибосомна білки можуть впізнавати специфічні конформації, утворені сахарофосфатним остовом таких ділянок. Місця зв'язування рибосомна білків на рРНК можна розділити на дві групи [18]. До перших відносяться дволанцюжкові спіралі довжиною до 40 нт, містять випетліванія (loops) або опуклості (bulges), які або спотворюють структуру спіралей нормальної А-форми, утворюючи унікальні конформації, упізнаваний білком, або ж самі формують місця зв'язування. Друга група містить домени рРНК, що мають складну просторову структуру, взаємне розташування сегментів якої стабілізується рибосомна білками.

    Для пошуку передбачуваних місць РНК-білкового зв'язування в молекулах рибосомна білків використовують дві концепції:

    Наявність кластерів еволюційно консервативних позитивно заряджених або ароматичних амінокислотних залишків у структурах білків може служити вказівкою на функціональну важливість даної області молекули при взаємодії з рРНК;

    Здатність рибосомна білків до специфічних перехресним взаємодією з рРНК з еволюційно віддалених організмів дозволяє використовувати порівняння структур гомологічних білків для локалізації можливих місць зв'язування рРНК і говорити про консерватизм просторової структури РНК-білкового інтерфейсу [31].

    Додатково використовують модифікації білка генно-інженерними або біохімічними методами, які полягають в заміні або хімічної модифікації амінокислотних залишків або ж у видаленні частини поліпептидного ланцюга з подальшою перевіркою константи зв'язування.

    1.3. Сучасні методи дослідження РНК-білкових взаємодій

    1.3.1. Біохімічні методи

    До біохімічних методів належать визначення констант зв'язування на фільтрах, рухливість в гелі та центрифугування в градієнті сахарози.

    1.3.1.1. Зв'язування на фільтрах

    Є стандартно використовується методикою для визначення РНК-білкових взаємодій і оцінки константи зв'язування. Принцип даного методу заснований на здатності нітроцелюлозних фільтрів утримувати білки, а також пов'язані РНК, поки незв'язані РНК проходять через фільтр. Незважаючи на свою концептуальну простоту, метод все ж не є достатньо надійним і не підходить для вивчення деяких РНК-білкових комплексів: він добре працює для порівняно невеликих молекул РНК, великі ж молекули РНК-білкових комплексів часто не утримуються.

    Методика полягає в тому, що еквімолярних кількості радіоактивної РНК змішуються з білком в різної концентрації і фільтруються через нітроцелюлозні фільтри. У ідеалі при високій концентрації білка має утримуватися до 100% РНК, в Насправді ж цей відсоток значно менше. Крім того, білкові фракції також можуть не утримуватися фільтром. Наприклад, при аналізі взаємодії білка L18 з 5S рРНК було виявлено, що ефективність зв'язування комплексу 5SрРНК-L18 становила 35% при утриманні 65% білка L18, і <5% для вільної 5S рРНК. Проте, точність вимірювання не залежить безпосередньо від ефективності затримування.

    На оцінку ефективності зв'язування впливають багато параметрів, і вони повинні бути оптимізовані для кожного конкретного випадку:

    Буфер: Підвищення концентрації солей зменшує ефективність зв'язування. Для більшості комплексів концентрація іонів одновалентних повинна становити близько 150 mM, щоб гарантувати специфічність зв'язуватися.

    Температура: Низька температура збільшує ефективність зв'язування.

    Швидкість подачі буфера і умови промивки: швидкість подачі буфера повинна бути постійною (однієї і тієї ж) у кожному експерименті. Неспецифічне утримання незв'язаного РНК на фільтрі можна зменшувати інтенсивної промиванням, але найчастіше це веде і до зниження специфічної сорбції в цілому. Тому для деяких комплексів застосовується промивка невеликим обсягом, у той час як для інших комплексів найкращі результати виходять при промиванні великими обсягами.

    ренатурації РНК: добре відомо, що різні препарати РНК дають різну ефективність зв'язування. Ретельна ренатурації зменшує варіабельність між цими препаратами [23].

    1.3.1.2. Рухливість в гелі

    Оцінка рухливості в гелі заснована на різниці в рухливості між вільними РНК та РНК-білковими комплексами при їх міграції в нативної поліакриламідному гелі. Зростаючий розмір комплексу, а також невеликий позитивний заряд пов'язаних з білками нуклеїнових кислот викликає розходження в їх рухливості.

    Метод дозволяє безпосередньо оцінити стехіометрії РНК-білкового комплексу. Якщо зв'язується більш ніж один білок, то видно додаткові зрушення (supershifts) в мобільності РНК. При додати антитіл, цю особливість можна використовувати для ідентифікації білків в комплексі, коли для утворення комплексу використовуються невідомі препарати білка.

    Основна проблема виконання даної методики - це вибір умов, що забезпечують специфічне РНК-білкове зв'язування. Головне при цьому - витримати високу концентрацію солей (300-500 mM NaCI або KC1), але при цьому треба враховувати, що висока концентрація солі має тенденцію збільшувати і відсоток дисоціації комплексу при електрофорезі. Таким чином, концентрація солей повинна бути оптимізована в залежності від конкретного експерименту. Велика кількість експериментів за визначенням рухливості в гелі РНК-білкових комплексах вивчаються в 50 mM трис-гліцінових буферах, а, наприклад, специфічні комплекси Escherchia coli вимагають по принаймні додаткового додати 150 mM Na і 5 mM Mg.

    Якщо комплекс чутливий до підвищення сольовий концентрації, неспецифічне зв'язування може бути зменшено додаванням носія РНК [23].

    1.3.1.3. Центрифугування в сахарозних градієнті

    Центрифугування в градієнті сахарози є найбільш простим, але в той же час менш чутливим методом аналізу РНК-білкових комплексів, основною перевагою ? е іонних умов, ніж, наприклад, при використанні електрофоретичної методів. При застосуванні можливо формування спеціальних градієнтів, таких як ізокінетіческій градієнт для визначення коефіцієнтів седиментації.

    Найбільш поширеним типом градієнта є лінійний градієнт сахарози. Оскільки рібонуклеопротеіновие комплекси більш щільні в порівнянні з максимально можливої щільністю сахарози (1.3 г/мл), вони завжди утворюють осад в нижній зоні. Так що вибір градієнта для поділу визначається залежністю від кількості обложеної частини: 5-20% (w/w) градієнт зазвичай вибирається для поділу малих нуклеопротеїнів, 10-30% (w/w) градієнт - для розділення сплайсосом, рибосомна субодиниць і Моносу, оскільки 20-47% (w/w) градієнт -- для об'єктів полісомних розмірів [23].

    1.3.2. Фізичні методи

    Засновані на вирішенні просторових структур РНК-білкових комплексів з атомарним роздільною здатністю. До цих методів відносять метод ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і метод рентгеноструктурного аналізу.

    Метод ЯМР дозволяє бачити структуру макромолекули в розчині без обмежень на взаємне розташування атомів, що накладаються кристалічної упаковкою. У Нині з-за складності і величини РНК-білкових комплексів сфера його застосування сильно обмежена.

    Найбільш ефективним і універсальним методом визначення тривимірної структури РНК-білкових комплексів з атомною роздільною здатністю є рентгеноструктурний аналіз. Метод заснований на властивості біологічних макромолекул утворювати монокристали, що представляють собою безліч ідентичних молекул, упорядкованих певним чином. З кристалів можливе отримання рентгенівської дифракційної картини, з подальшим аналізом отриманих даних і побудові на їх основі карти електронної щільності. Потім отримують просторову модель структури, яка після ряду уточнень мінімізується по хімічній і кінетичної енергій [5].

    Поряд з методом ядерного магнітного резонансу, рентгеноструктурний аналіз також не позбавлений своїх недоліків, найбільш значущими з яких є проблема кристалізації РНК-білкових комплексів (необхідна наявність досить великих, стабільних і однорідних кристалів), а так само фазова проблема, яка розв'язується методами ізоморфно заміщення, молекулярного заміщення та аномальної дисперсії на декількох довжинах хвиль.

    В Останнім часом, завдяки використанню синхротронного випромінювання, нових типів детекторів, а також розробці нових програм для обробки даних і розрахунку фаз, метод рентгеноструктурного аналізу отримав найбільш широке поширення.

    2. Експериментальна частина

    2.1. Матеріали та методи дослідження

    2.1.1. Метод молекулярного заміщення

    Для вирішення проблеми фаз в даній роботі використовувався метод молекулярного заміщення. Метод заснований на використанні відомої структури гомологічною молекули (білка, РНК або ДНК) в якості моделі для отримання початкового наближення набору фаз [16].

    Для розрахунку початкового набору фаз необхідно, щоб модель найкращим чином апроксимувати положення невідомої молекули в елементарній комірці кристала. Визначення таких положень моделі є основним завданням методу молекулярного заміщення, яка зазвичай вирішується в два етапи. На першому етапі визначається ортогональноє перетворення W, що забезпечує правильну орієнтацію моделі в кристалічній комірці. На другому етапі проводиться пошук вектора трансляції v, що задає положення орієнтованої моделі в елементарній комірці кристала. Частіше за все, вищезгадана ортогональноє перетворення виражається через кути Ейлера або сферичні кути [37].

    Опції обертання

    Перетворення

         
     
         
    Реферат Банк
     
    Рефераты
     
    Бесплатные рефераты
     

     

     

     

     

     

     

     
     
     
      Все права защищены. Reff.net.ua - українські реферати !