Взаємодії білків з РНК - структурний комп'ютерний
аналіз
Курсова робота
Виконала студентка 4 курсу, 541 групи Ревтович
Світлана
Самарський Державний Університет
Самара 2001
Введення
1. Огляд літератури
1.1. Відмінності
ДНК-білкових від РНК-білкових взаємодій
Подвійна
спіраль ДНК - це регулярна структура, в якій найбільш істотні відмінності
між сусідніми ділянками укладені в послідовності пар основ. В обох
жолобка специфічний сайт ДНК для впізнавання білком може бути сформований
мережею водневих зв'язків між основами нуклеотидів. Великий жолобок спіралі
ДНК доступнішим для контакту, що створює можливість для дискримінації
послідовностей в ньому [39]. Заснований на цьому припущенні механізм
впізнавання «прямим зчитуванням» був підтверджений для багатьох ДНК-що зв'язують
білків. Також було відзначено потенційне значення і «непрямого зчитування».
Деякі послідовності ДНК можуть мати зміни в конформації
цукрово-фосфатного остову або навіть бути деформовані в незвичайні структури. У
такому випадку специфічність зв'язування може визначатися контактами білка з
остовом ДНК [40]. Індуковані білком порушення структури ДНК звичними
і можуть варіювати за формою від невеликих вигинів, як в сайте Нуклеази EcoRI,
до великих вигинів і виведення підстав з Стекінг, як в комплексі з
ТАТА-зв'язує білком [24].
Механізм
«Прямого зчитування» припускає, що ДНК-білковими контактами, що визначають
специфічність зв'язування, є водневі зв'язки з підставами і гідрофобні
контакти з тіміновимі метилом, у той час як енергія неспецифічного
зв'язування забезпечується іонними і водневими зв'язками з цукрово-фосфатним
остовом. У «непрямому зчитуванні» можуть брати участь і інші види
взаємодій, наприклад, в комплексі з ТАТА-зв'язує білком ДНК
контактує з гідрофобною білкової поверхнею і ароматичні амінокислоти
інтеркаліруются в спіраль ДНК [24].
Молекули
РНК відрізняються від ДНК кількома особливостями, які впливають на можливості
білкового пізнавання. По-перше, в РНК ділянки Уотсон-криковських спіралей часто
перериваються випинання, внутрішніми петлями і шпильками. Дослідження часто
зустрічаються «четирехнуклеотідних» шпильок і консервативних внутрішніх і
шпилькових петель Хвороби, методами ЯМР і рентгеноструктурного аналізу
виявили специфічні нерегулярні структури, що містять неканонічні пари і
випинання. По-друге, спіралі РНК досить короткі, зазвичай менше пального
обороту, і мають А-форму, відмінну від В-форми ДНК. А-форма спіралі має дуже
глибокий і вузький великий жолобок, що створює труднощі для стеріческіе
взаємодії з білками. Однак прилеглий до нерегулярним ділянок великої
жолобок може бути доступний для зв'язування [41].
Наслідком
цих відмінностей є те, що білки виявляються перед значно більшим
різноманітністю водневих зв'язків і можливостей Стекінг нуклеотидів у разі
РНК, ніж це можливо в стандартній спіралі ДНК. Додатковою і вельми важливою
особливістю РНК є можливість «теоретичних» взаємодій, які можуть
з'єднувати різні ділянки РНК і створювати складні структури. Класичними
прикладами є підключення спіралей тРНК в «L-образну» молекулу,
виявлена в інтрони групи I «аденозинових платформа», що відкриває спіраль
РНК для Стекінг з іншого спіраллю РНК [12], і структура двох взаємодіючих
петлями транскриптів RNA I і RNA II плазміди ColE1, так званий «kissing»
комплекс [27]. Той факт, що завдяки вторинним і третинним взаємодій
може бути створена унікальна структура РНК, підвищує ймовірність
специфічної взаємодії білків тільки з цукрово-фосфатним остовом. Ця
ситуація може бути крайнім випадком «непрямого зчитування», коли підстави
нуклеотидів забезпечують білкове впізнавання тільки визначенням загальної
конформації РНК, а не прямими контактами з білком.
Таким
чином, спотворення регулярної структури нуклеїнової кислоти, як видно,
більш важливо для впізнавання РНК, ніж для ДНК. Спіраль ДНК досить стабільна
структура, в той час як неспарені нуклеотиди і петлі дестабілізують
структуру РНК. Комбінація багатого вибору нерегулярних структур в РНК і
можливості деформації її структури дозволяють припустити, що РНК-що зв'язують
білки будуть використовувати більш широкий вибір стратегій зв'язування, ніж
ДНК-що зв'язують білки, і що механізм пізнавання «непрямим зчитуванням» буде
серед них більш широко поширений.
1.2. Ранні
уявлення про РНК-білкових взаємодіях
1.2.1. РНК-що зв'язують
структурні мотиви в білках
Вивчення
властивостей РНК-зв'язуючих білків привело до виявлення в цих білках ряду і
консервативних мотивів. Їх відкриття дозволило розпочати класифікацію
РНК-зв'язуючих білків, виходячи з їхніх структурних особливостей, а також
передбачати РНК-що зв'язують властивості білків [8]. В даний час виділяють
наступні основні мотиви:
РНП
(ribonucleoprotein) мотив - найбільш поширений, складається з двох коротких
послідовностей РНП1 (октамер) і РНП2, розділених приблизно 30
амінокислотами [17].
S1
мотив - до складу входить п'ять антипаралельних b-тяжів. Ряд консервативних
ароматичних і заряджених амінокислот, розташованих в петлі між тяжами b1 і b2, в
середині b2,
в кінці b3
і в повороті між b4
і b5
знаходяться поблизу один від одного і, ймовірно, формують РНК-що зв'язує
ділянка домену [10].
Домен
холодового шоку - складається з п'яти b-тяжів з РНП-послідовністю, розташованої в одному
з тяжів і структурно дуже схожий з S1 мотивом [38].
КН
мотив - містить стабільну baabba
структуру. [11] Точна роль мотиву в РНК-зв'язуванні невідома.
Мотив
DSRM - має abbba топологію.
Можливий ділянку зв'язування знаходиться в петлі між b-тяжем та С-кінцевий a-спіраллю
[9].
RGG
мотив - містить 20-25 амінокислот і зазвичай є у комбінації з
РНК-зв'язуючими мотивами інших типів. Він складається з близько розташованих
поворотів Arg-Gly-Gly (RGG), розташованих серед інших, часто ароматичних
амінокислот [8].
Мотив
ARM - складається з 10-20 амінокислот з великою кількістю аргінонов. Зустрічається
у вірусних і фагів білках.
Домени
з «цинковими пальцями» - містить послідовності СХ4СХ12НХ3-4Н і
відповідне число іонів цинку, пов'язані цистеїну і гістидин [17].
Інші
РНК-що зв'язують мотиви. Існує ряд інших консервативних
послідовностей, які не мають гомології з вже перерахованими мотивами.
Наприклад, мотив білка-аттенюатора тріптофанового Оперон з B.subtilis. [2].
1.2.2. Взаємодії
білків з тРНК
Питання
про те, як аміноацил-тРНК-синтетази досягають високої специфічності в впізнаванні
тРНК, ймовірно, був одним з перших серйозно досліджуваних питань в проблемі
РНК-білкових взаємодій. Щоб взаємодіяти з усіма компонентами
трансляційного апарату, все тРНК повинні мати досить схожу тривимірну
структуру, що значно ускладнює для кожної з 20 синтетаз вибір своїх
ізоакцепторних тРНК з пулу тРНК клітини. У зв'язку з цим, можливості до
дискримінації досить обмежені і, в основному, зведені до впізнавання нуклеотидів
в специфічних позиціях.
До
теперішнього часу визначені елементи впізнавання для 19 з 20 синтетаз.
Виявилося, що вони неоднакові для різних синтетаз. Більшість цих ферментів
дізнається одну або більше з трьох наступних детермінант:
по
щонайменше, один нуклеотид в Антикодон;
одну
або більше з останніх трьох пар нуклеотидів акцепторній стебла;
так
зване «Дискримінаторні» підставу між акцепторні стеблом і ССА кінцем.
Крім
того, по крайней мере, 8 синтетаз використовують і інші відмітні ознаки.
Елемент
пізнавання може впливати на специфічність аміноацілірованія тРНК, тому що він
пізнається «правильної» синтетазою (позитивний елемент) або тому що
запобігає взаємодія з «не своєї» синтетазою (негативний елемент).
Негативний елемент може маскувати присутність позитивних елементів [32].
Яскравою ілюстрацією цього факту є набори з трьох елементів специфічності
близько ССА кінця тРНК для аланіну, гістидину і гліцину. Кожна детермінанта
є позитивним елементом для однієї або двох синтетаз і негативним для
інших [19].
Незважаючи
на виконання однієї і тієї ж реакції аміноацілірованія, синтетази можуть
здійснювати різне зв'язування з субстратом реакції - тРНК, причому елементи
впізнавання тРНК не завжди є унікальними, а можуть мати структурний
схожість з іншими класами білків.
1.2.3. Взаємодії
білків з матричними РНК
Механізм
мРНК-білкових пізнавання є, мабуть, найменш вивченим питанням у проблемі
РНК-білкових взаємодій, через відсутність структур, вирішених з досить
високою роздільною здатністю (виняток - комплекс L30-мРНК).
Однак,
спираючись на дані, отримані методом ядерного магнітного резонансу було зроблено
припущення, що основну роль у процесі мРНК-білкового пізнавання грають
наведені раніше консервативні мотиви. Наприклад, RNP1 і RNP2 (білок U1A),
домен холодового шоку і гідрофільний С-кінцевий домен з чергуються
кластерами негативно і позитивно заряджених амінокислотних залишків
(Y-box-білки).
1.2.4. Взаємодії
білків з рРНК
Взаємодії
білків з рРНК дуже сильно відрізняються від взаємодій білків з ДНК і тРНК.
Місця зв'язування білків на ДНК і тРНК характерні наявністю специфічної еволюційно
консервативної послідовності нуклеотидів, заміна яких призводить до
сильного ослаблення або зникнення взаємодій [1]. Припущення про
визначальної ролі послідовності нуклеотидів у РНК-білковому впізнаванні,
засноване на дослідженнях комплексів білків-репресор з ДНК та вивченні
аміноацил-тРНК-синтетаз, виявляється некоректним стосовно рРНК-білкових
комплексам. Оскільки структура ДНК регулярна, саме послідовність
підстав, а не конформація кістяка, визначає специфічність зв'язування.
Таке ж можна сказати про комплекси аміноацил-тРНК-синтетаз з
відповідними тРНК, оскільки просторові структури тРНК однотипні і
специфічність пізнавання залежить саме від послідовності основ у
певних ділянках молекули тРНК.
рРНК,
на відміну від ДНК і тРНК, містить багато нерегулярних ділянок, і Рибосомна
білки можуть впізнавати специфічні конформації, утворені сахарофосфатним
остовом таких ділянок. Місця зв'язування рибосомна білків на рРНК можна розділити
на дві групи [18]. До перших відносяться дволанцюжкові спіралі довжиною до 40 нт,
містять випетліванія (loops) або опуклості (bulges), які або спотворюють
структуру спіралей нормальної А-форми, утворюючи унікальні конформації,
упізнаваний білком, або ж самі формують місця зв'язування. Друга група
містить домени рРНК, що мають складну просторову структуру, взаємне
розташування сегментів якої стабілізується рибосомна білками.
Для пошуку передбачуваних місць РНК-білкового
зв'язування в молекулах рибосомна білків використовують дві концепції:
Наявність кластерів еволюційно консервативних
позитивно заряджених або ароматичних амінокислотних залишків у структурах
білків може служити вказівкою на функціональну важливість даної області молекули
при взаємодії з рРНК;
Здатність рибосомна білків до специфічних
перехресним взаємодією з рРНК з еволюційно віддалених організмів
дозволяє використовувати порівняння структур гомологічних білків для локалізації
можливих місць зв'язування рРНК і говорити про консерватизм просторової
структури РНК-білкового інтерфейсу [31].
Додатково
використовують модифікації білка генно-інженерними або біохімічними методами,
які полягають в заміні або хімічної модифікації амінокислотних залишків
або ж у видаленні частини поліпептидного ланцюга з подальшою перевіркою константи
зв'язування.
1.3. Сучасні методи
дослідження РНК-білкових взаємодій
1.3.1. Біохімічні
методи
До
біохімічних методів належать визначення констант зв'язування на фільтрах,
рухливість в гелі та центрифугування в градієнті сахарози.
1.3.1.1. Зв'язування на фільтрах
Є
стандартно використовується методикою для визначення РНК-білкових взаємодій і
оцінки константи зв'язування. Принцип даного методу заснований на здатності
нітроцелюлозних фільтрів утримувати білки, а також пов'язані РНК, поки
незв'язані РНК проходять через фільтр. Незважаючи на свою концептуальну
простоту, метод все ж не є достатньо надійним і не підходить для
вивчення деяких РНК-білкових комплексів: він добре працює для порівняно
невеликих молекул РНК, великі ж молекули РНК-білкових комплексів часто не
утримуються.
Методика
полягає в тому, що еквімолярних кількості радіоактивної РНК змішуються з
білком в різної концентрації і фільтруються через нітроцелюлозні фільтри. У
ідеалі при високій концентрації білка має утримуватися до 100% РНК, в
Насправді ж цей відсоток значно менше. Крім того, білкові
фракції також можуть не утримуватися фільтром. Наприклад, при аналізі
взаємодії білка L18 з 5S рРНК було виявлено, що ефективність
зв'язування комплексу 5SрРНК-L18 становила 35% при утриманні 65% білка L18, і
<5% для вільної 5S рРНК. Проте, точність вимірювання не залежить
безпосередньо від ефективності затримування.
На
оцінку ефективності зв'язування впливають багато параметрів, і вони повинні бути
оптимізовані для кожного конкретного випадку:
Буфер:
Підвищення концентрації солей зменшує ефективність зв'язування. Для
більшості комплексів концентрація іонів одновалентних повинна становити близько
150 mM, щоб гарантувати специфічність зв'язуватися.
Температура:
Низька температура збільшує ефективність зв'язування.
Швидкість
подачі буфера і умови промивки: швидкість подачі буфера повинна бути постійною
(однієї і тієї ж) у кожному експерименті. Неспецифічне утримання незв'язаного
РНК на фільтрі можна зменшувати інтенсивної промиванням, але найчастіше це веде і до
зниження специфічної сорбції в цілому. Тому для деяких комплексів
застосовується промивка невеликим обсягом, у той час як для інших комплексів
найкращі результати виходять при промиванні великими обсягами.
ренатурації
РНК: добре відомо, що різні препарати РНК дають різну ефективність
зв'язування. Ретельна ренатурації зменшує варіабельність між цими
препаратами [23].
1.3.1.2. Рухливість в гелі
Оцінка
рухливості в гелі заснована на різниці в рухливості між вільними РНК та
РНК-білковими комплексами при їх міграції в нативної поліакриламідному гелі.
Зростаючий розмір комплексу, а також невеликий позитивний заряд пов'язаних
з білками нуклеїнових кислот викликає розходження в їх рухливості.
Метод
дозволяє безпосередньо оцінити стехіометрії РНК-білкового комплексу. Якщо
зв'язується більш ніж один білок, то видно додаткові зрушення (supershifts)
в мобільності РНК. При додати антитіл, цю особливість можна використовувати
для ідентифікації білків в комплексі, коли для утворення комплексу
використовуються невідомі препарати білка.
Основна
проблема виконання даної методики - це вибір умов, що забезпечують
специфічне РНК-білкове зв'язування. Головне при цьому - витримати високу
концентрацію солей (300-500 mM NaCI або KC1), але при цьому треба враховувати, що
висока концентрація солі має тенденцію збільшувати і відсоток дисоціації комплексу
при електрофорезі. Таким чином, концентрація солей повинна бути оптимізована
в залежності від конкретного експерименту. Велика кількість експериментів за визначенням
рухливості в гелі РНК-білкових комплексах вивчаються в 50 mM трис-гліцінових
буферах, а, наприклад, специфічні комплекси Escherchia coli вимагають по
принаймні додаткового додати 150 mM Na і 5 mM Mg.
Якщо
комплекс чутливий до підвищення сольовий концентрації, неспецифічне
зв'язування може бути зменшено додаванням носія РНК [23].
1.3.1.3. Центрифугування в сахарозних градієнті
Центрифугування
в градієнті сахарози є найбільш простим, але в той же час менш
чутливим методом аналізу РНК-білкових комплексів, основною перевагою
? е іонних умов,
ніж, наприклад, при використанні електрофоретичної методів. При застосуванні
можливо формування спеціальних градієнтів, таких як ізокінетіческій
градієнт для визначення коефіцієнтів седиментації.
Найбільш
поширеним типом градієнта є лінійний градієнт сахарози. Оскільки
рібонуклеопротеіновие комплекси більш щільні в порівнянні з максимально
можливої щільністю сахарози (1.3 г/мл), вони завжди утворюють осад в нижній
зоні. Так що вибір градієнта для поділу визначається залежністю від
кількості обложеної частини: 5-20% (w/w) градієнт зазвичай вибирається для
поділу малих нуклеопротеїнів, 10-30% (w/w) градієнт - для розділення
сплайсосом, рибосомна субодиниць і Моносу, оскільки 20-47% (w/w) градієнт --
для об'єктів полісомних розмірів [23].
1.3.2. Фізичні методи
Засновані
на вирішенні просторових структур РНК-білкових комплексів з атомарним
роздільною здатністю. До цих методів відносять метод ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і
метод рентгеноструктурного аналізу.
Метод
ЯМР дозволяє бачити структуру макромолекули в розчині без обмежень на
взаємне розташування атомів, що накладаються кристалічної упаковкою. У
Нині з-за складності і величини РНК-білкових комплексів сфера його
застосування сильно обмежена.
Найбільш
ефективним і універсальним методом визначення тривимірної структури
РНК-білкових комплексів з атомною роздільною здатністю є рентгеноструктурний
аналіз. Метод заснований на властивості біологічних макромолекул утворювати
монокристали, що представляють собою безліч ідентичних молекул, упорядкованих
певним чином. З кристалів можливе отримання рентгенівської
дифракційної картини, з подальшим аналізом отриманих даних і побудові на
їх основі карти електронної щільності. Потім отримують просторову модель
структури, яка після ряду уточнень мінімізується по хімічній і
кінетичної енергій [5].
Поряд
з методом ядерного магнітного резонансу, рентгеноструктурний аналіз також не
позбавлений своїх недоліків, найбільш значущими з яких є проблема
кристалізації РНК-білкових комплексів (необхідна наявність досить великих,
стабільних і однорідних кристалів), а так само фазова проблема, яка розв'язується
методами ізоморфно заміщення, молекулярного заміщення та аномальної дисперсії
на декількох довжинах хвиль.
В
Останнім часом, завдяки використанню синхротронного випромінювання, нових типів
детекторів, а також розробці нових програм для обробки даних і розрахунку
фаз, метод рентгеноструктурного аналізу отримав найбільш широке
поширення.
2. Експериментальна частина
2.1. Матеріали та методи
дослідження
2.1.1. Метод
молекулярного заміщення
Для
вирішення проблеми фаз в даній роботі використовувався метод молекулярного
заміщення. Метод заснований на використанні відомої структури гомологічною
молекули (білка, РНК або ДНК) в якості моделі для отримання початкового
наближення набору фаз [16].
Для
розрахунку початкового набору фаз необхідно, щоб модель найкращим чином
апроксимувати положення невідомої молекули в елементарній комірці
кристала. Визначення таких положень моделі є основним завданням методу
молекулярного заміщення, яка зазвичай вирішується в два етапи. На першому етапі
визначається ортогональноє перетворення W, що забезпечує
правильну орієнтацію моделі в кристалічній комірці. На другому етапі
проводиться пошук вектора трансляції v, що задає положення орієнтованої
моделі в елементарній комірці кристала. Частіше за все, вищезгадана
ортогональноє перетворення виражається через кути Ейлера або сферичні кути
[37].
Опції обертання
Перетворення
