Які ж основні форми зв'язку амінокислот у складній молекулі білка? Ще в 1891 р. О. Я. Данилевський висловив припущення, що це амідні зв'язку, утворені карбоксілом однієї молекули амінокислоти і аміногрупи інший (поліконденсації типу "голова - хвіст"), наприклад:
-H2O H2N-CH2-C = O + HNHCH2COOH - а
OH
а H2N-CH2- CO-NH -CH2-COOH (пептидна зв'язок)
Амідні зв'язку цього типу називаються пептидними зв'язками, а низькомолекулярні сполуки, в яких амінокислоти з'єднані один з одним пептидними зв'язками, прийнято називати пептидами (або поліпептидами).
Пептиди утворюються при частковому гідролізі білків. Пептидний теорія будови білка була розвинена Е. Фішером і гофмейстером і в даний час остаточно підтверджена.
Залежно від числа амінокислотних залишків, що входять в молекулу поліпептиду, розрізняють дипептид, тріпептіди, тетрапептіди тощо. Характерну для пептидів угруповання
-CO-NH-називають пептидного.
Назви поліпептидів виробляють від назв залишків амінокислот, прореагировавших своїми карбоксильні групами, і від назви амінокислоти, що реагує своєї аміногрупи і зберігає вільну карбоксильної групи:
H2N-CH2-CO-NH-CH (CH3)-COOH
гліцілаланін (H-гли-ала-OH) NH2-CH (CH3)-CO-NH-NH2-CO-NH-CH2-COOH
Аланілгліцілгліцін (H-ала-гли-гли-OH)
До теперішнього часу розроблено багато методів перетворення а-амінокислот у пептиди і синтезовані найпростіші природні білки-інсулін, Рибонуклеаза, вазопресин, окситоцин та ін
Для того, щоб з'єднати дві амінокислоти пептидного зв'язком, необхідно: а) закрити (захистити) карбоксильних групу гліцину і аміногрупу аланіну, щоб не сталося небажаних реакцій по цих групах; б) утворити пептидних зв'язок; в) зняти захисні групи. Захисні групи повинні надійно закривати амінів і карбоксильних групи в процесі синтезу і потім легко зніматися без руйнування пептидного зв'язку.
Захист аміногрупи найбільш просто проводиться ацілірованіем:
Карбоксильна групу для захисту перетворюють на складноефірний:
-HOH
H2N-CH2-COOH + HOR - а H2N-CH2-COOR
Для утворення пептидного зв'язку або активують карбоксильної групи N-ацілаланіна, перетворюючи його в хлорангідрід, або проводять конденсацію в присутності сильних водовіднімаючих речовин (діціклогексілкарбодіімід, етоксіацетілен):
-H2O
R-CO-NH-CH-COOH + HNHCH2-COOR - а
|
CH3 гідроліз
а R-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOR ---- а
|
CH3
а H2N-CH-CO-NH-CH2-COOH
|
CH3
Потім знімають захисні групи в таких умовах, щоб не зачіпали пептидна зв'язок. Таким чином можна синтезувати не тільки ді-, а й три-, і тетрапептіди тощо.
Дуже перспективний метод синтезу пептидних зв'язків запропонував у 1960 р. Меріфільд (США). Цей метод потім отримав назву твердофазного синтезу пептидів. Перша амінокислота з захищеною аміногрупи приєднується до твердого носія - іонообмінних смолі, яка містить спочатку групи-CH2Cl (1-а стадія), з утворенням так званої "якірної" зв'язку, яка позначена жирною лінією: (1)-NaCl
Смола-CH2Cl + NaOOC-CHR-NHCOR'аСмола--CH2O-C-CHR-NHCOR 'Асмолов-CH2O-C-CHR-
| | | |
O O
+ HOOC-CHR''-NHOR (3)
-NH2 ----------- Асмолов-CH2O-C-CHR-
| |
(4) O
-NHCO-CHR''-NHCOR 'Асмолов-CH2O-C-CHR - NHCO-CHR''-NH2 і т. д. | |
O
Потім нарощують пептидних ланцюг, пропускаючи через смолу розчини відповідних реагентів. Для цього спочатку збирають групу, що захищає кінцеву NH2 - групу (2-а стадія). Пропускаючи через смолу розчин іншої амінокислоти з захищеною аміногрупи у присутності водовіднімаючих реагентів, утворюють пептидних зв'язок між першим і другим амінокислотою (3-я стадія). Якщо потім прибрати захисну групу (4-а стадія), синтез пептиду можна вести далі. Після нарощування пептидного ланцюга до потрібної величини гідролізують "якірну" складноефірний зв'язок і змивають поліпептид зі смоли:
HBr
Смола-CH2O-CO-CHR-NH ... CO-CHR'NH2 --- а
Асмолов-CH2OH + HOOCCHRNH ... COCHR'NH2
Поліпептид
Метод Меріфільда простий в технічному оформленні, що дозволяє повністю автоматизувати процес. Тому, хоча вищезгадані білки інсулін (51 амінокислота) і Рибонуклеаза (124 амінокислоти) були синтезовані класичними методами, метод Меріфільда дозволяє значно скоротити витрати праці і часу на синтез білків. Так, Рибонуклеаза була синтезовано Меріфільдом в 1968 р. менш ніж за місяць, хоча синтез включав 369 послідовних реакцій.
Чеботарьов А. 11п1
