Вплив екзогенних трьох-і шестіуглеродних вуглеводів на біосинтез аскорбінової кислоти в проростках ячменю

Г.М. Чупахіна, А.В. Добичина, Н.Ю. Чупахіна, И.Е. Ломова (Калінінградський державний університет, Московська Академія хімічного машинобудування)

хімізм біосинтезу аскорбінової кислоти (АК) в рослинах до цих пір не досить ясний. Відомо, що новоутворення АК стимулюють гексози, з яких перевагу віддається галактози [1, с. 271]. Метаболізм гексоз в АК може йти або через освіта проміжних триоз, або без розриву вуглецевого скелета вихідної молекули вуглеводу. У другому випадку ряд дослідників (2) допускає можливість інверсії вуглецевого ланцюга, інші [3] заперечують її наявність. Необхідність освіти триоз з вихідних гексоз при біосинтезі АК нами перевірялася в дослідах з використанням екзогенного діоксіацетона як субстрату для АК. Дія діоксіацетона порівнювався з С6-субстратами -- глюкозою і галактозою.

Об'єкт і методи дослідження

В Як об'єкти дослідження використовувалися 6-денні зелені, етіолірованние і альбіносние паростки ячменю ярого (Hordeum vulgare L.) сорту Роланд. Альбіносние проростки отримували з оброблених 0,25% розчином стрептоміцину насіння. Проростки вирощували при природному освітленні і кімнатній температурі. Вміст аскорбінової кислоти та її дериватів - дегідроаскорбінової кислоти (ДАК) і дікетогулоновой (ДКГК) - визначали колориметричні [4, с. 17]. Діоксіацетон, що використовується в дослідах, був отриманий методом біотрансформації гліцерину за допомогою Gluconobacter oxydans [5]. Освітлення проростків в дослідах проводилося в установці "Флора" з люмінесцентними лампами ЛДЦ-40. Інтенсивність світла дорівнювала 33 тис. ерг см-2 с-1, експозиція - 24 години. Досліди виконувалися в двох біологічних повторно та відтворювалися 2-3 рази. У роботі наводяться середні значення з усіх дослідів і середні помилки вимірювань.

Результати та обговорення

З метою вивчення можливості використання шестіуглеродних сполук (глюкози, галактози) в якості субстрату в біосинтезі АК використовувалися листя ячменю з різної пігментацією: зелені, етіолірованние, альбіносние, з тим щоб вирішити питання про джерело використовуваних вуглеводів (фотосинтетичні або запасні) і визначити залежність біосинтезу АК з вуглеводів від енергетичних процесів - фотосинтезу і дихання.

Масштаб Біосинтетичними процесу, що веде до накопичення АК, характеризує не тільки освіта відновленої форми АК, але і її дериватів, так як поряд з новотвором АК йде її активне використання з утворенням ДАК і ДКГК. Тому в дослідах з вивчення можливості використання С6-вуглеводів - глюкози і галактози в біосинтезі АК одночасно визначався зміст АК, ДАК і ДКГК.

Як видно з малюнка, при освітленні листя ячменю, що знаходиться на воді та 1% розчинах глюкози і галактози, рівень відновленої форми АК підвищувався по порівняно з вихідним вмістом у всіх варіантах, але перевищення контрольного значення (листя на воді) відмічено тільки при використанні в якості субстрату глюкози.

Освітлення зеленого листя ячменю призвело до зниження рівня дегідроаскорбінової кислоти по порівняно з вихідним вмістом тільки у контролі; в листі, що знаходяться на розчинах вуглеводів, зміст ДАК перевершило та контрольне і оригінал зміст. Отже, додаткове постачання листя шестіуглероднимі вуглеводами активізувало використання відновленої форми АК, причому в рівною мірою і в досвіді з глюкозою, і з галактозою.

Подальша метаболізацію ДАК з утворенням ДКГК активніше була в листі, що знаходяться на 1% розчині глюкози в порівнянні з галактозою.

Таким чином, С6-вуглеводи (глюкоза і галактоза) стимулюють накопичення АК в листах ячменю на світлі. Причому глюкоза активізує освіта і відновленої і окисленої форми АК, галактоза - тільки дегідроформи.

В етіолірованних листках (рис. 2) світло активно стимулював накопичення АК і в листі, що знаходяться на воді, і особливо в листі, поміщених в 1% розчини глюкози і галактози. Однак стимуляція біосинтезу АК глюкозою була вищою, ніж галактозою.

Рівень окисленої форми АК, а також продукту її необоротного окислення - ДКГК при освітленні етіолірованних листя знизився в порівнянні з вихідним, що говорить про знижений використанні АК у етіолянтах. Можливо, це і є однією з причин більш активного накопичення відновленої форми АК у етіолірованних проростках на світлі в порівнянні з зеленими.

Ще більшою мірою, ніж у етіолірованних проростках, блоковані процеси, пов'язані з функціонуванням фотосинтетичного апарата, однак у альбіносів їхня реакція на висвітлення була ближче до зелених проростків, ніж до етіолірованним (рис. 3). Вихідний рівень АК у зелених проростках був вищим, ніж у альбіносних, але характер зміни вмісту АК і в контрольних листах (на воді), і в листі, що знаходяться в розчинах вуглеводів, був однаковим: світло стимулював підвищення рівня АК у всіх варіантах, але перевищення контрольного значення було зазначено тільки на глюкози. У альбіносних проростків, так само, як і у етіолірованних і зелених, зміст ДАК на світлі підвищився в порівнянні з контрольним значенням у присутності екзогенних вуглеводів, особливо галактози. Зміст ДКГК при цьому не перевищувало контрольний рівень.

Таким чином, аналіз реакції на висвітлення листя ячменю, що знаходяться на 1% розчині глюкози і галактози, показує, що глюкоза стимулює накопичення відновленої форми АК і в зелених, і в різному ступені депігментовані проростках. Активація біосинтезу АК галактозою мала місце тільки у етіолянтов.

Світло знижував рівень ДАК у всіх типів проростків. Додавання екзогенних вуглеводів стимулювало накопичення окисленої форми АК і мало відбивалося на утриманні ДКГК.

Враховуючи масштаб накопичення АК і ДАК у присутності екзогенних вуглеводів, можна зробити висновок про те, що в проростках ячменю екзогенна глюкоза більшою мірою стимулює біосинтез АК та АК + ДАК, ніж галактоза.

В дослідах із з'ясування можливості використання в якості субстрату в біосинтезі АК трехуглеродних вуглеводів використовувався діоксіацетон. Зелені, етіолірованние і альбіносние листя ячменю підставою містилися в 1% розчин діоксіацетона, і його дію порівнювався з контролем (листя на воді) і з 1% глюкозою, стимуляція біосинтезу АК якій показана в попередніх дослідженнях (рис.1-3).

В дослідах із зеленим листям було показано (рис. 4), що в присутності 1% діоксіацетона на світлі починається надзвичайно активний синтез - сверхсінтез АК: зміст АК підвищився в порівнянні з контрольним в 12 разів і в порівнянні з глюкозою - в 9 разів. Поряд з різким зростанням рівня відновленої форми АК, відбувалося активне накопичення окисленої форми і ДКГК.

Аналогічний феномен виявлено і у етіолірованних проростків, у яких у присутності діоксіацетона в 16 разів збільшився вміст АК в порівнянні з контролем, в 9 разів підвищився рівень ДАК і в 11 разів - ДКГК (рис. 5).

Кілька менше збільшення рівня АК, ДАК і ДКГК під дією діоксіацетона спостерігалося у альбіносних проростків, але і в цьому випадку рівень АК перевершував контрольний в 4 рази, ДАК - в 12 разів, ДКГК - більш ніж у 8 разів, тоді як у варіанті, де в якості субстрату використовувалася глюкоза, ці цифри були відповідно: 1,2; 1,2 і 1 (рис. 6).

З порівняння дії діоксіацетона, глюкози та галактози на біосинтез АК у проростках ячменю, чітко видно переважне використання трехуглеродного вуглеводу в порівнянні з шестіуглероднимі, що дає підставу підтримувати думку про те, що біосинтез АК з вуглеводів передбачає на певному етапі розрив вихідної гексози на триозы. Але оскільки діоксіацетон в дослідах стимулював активну накопичення не тільки відновленої форми АК, але й продуктів її окислення - ДАК, ДКГК - можна вважати, що в його присутності починається швидке використання АК. Таке явище може мати місце тоді, коли рослини перебувають у несприятливих умовах і активну новоутворення і використання АК є відповідною реакцією на стрес [6, с.21]. Тому при оцінці ролі діоксіацетона як субстрату в біосинтезі АК, ймовірно, не можна не враховувати і можливий негативний вплив самого діоксіацетона в 1% концентрації на рослини.

Використання вуглеводів екзогенного і ендогенного пулу в рослинах йде не однаково [7]. З огляду на наші дані по впливу екзогенної глюкози і галактози на біосинтез АК в проростках ячменю, можна зробити висновок про те, що глюкоза екзогенного пулу може використовуватися в біосинтезі АК зеленими, етіолірованнимі і альбіноснимі проростками. Переважного використання галактози в біосинтезі АК, як вказується в літературі [1], в наших дослідах не виявлено.

Стимулююча дію екзогенної глюкози і діоксіацетона на біосинтез АК не пов'язане з фотосинтетичним процесом, тому що воно спостерігалося не тільки в зелених проростках, але і в депігментовані.

Таким чином, екзогенні діоксіацетон в 1% концентрації викликає активне накопичення АК, ДАК і ДКГК в листі ячменю з різною пігментацією, значно перевершує даний процес в листі, забезпечених глюкозою, що підтримує думку про те, що біосинтез АК з гексоз включає етап освіти триоз. Порівняльний аналіз дії глюкози і галактози на біосинтез АК показує переважне використання в даному процесі глюкози.

Список літератури

1. Гудвин Т., Мерсер Е. Введення в біохімію рослин. М.: Світ, 1986. Т.1. С.392.

2. Isherwood F.A., Chen Y.T., Mapson L.W. Synthesis of l-ascorbic acid in plants and animals// Biochem. Journ. 1954. Vol. 56. N 1. P.11-15.

3. Loewus F.A., j. P.F.G. Hesper. Metabolism l-ascorbic acid in plants// American chemican society. Washington, 1982. P.249-261.

4. Чупахіна Г.М. Кількісне визначення АК, ДАК і ДКГК в рослинних тканинах //Спеціальний практикум з біохімії та фізіології рослин. Калінінград, 1981. 37 с.

5. Еронін В.А., Кустова Н.А., Махоткіна Г.А., Ломова І.Є., Миколаїв П.І. Спосіб отримання діоксіацетона: А.с. № 1218687// БІ. 1985. № 24.

6. Чупахіна Г.М. Світлозалежна зміни системи АК рослин: Дис. ... д-ра біол. наук. СПб., 1992. 48 с.

7. Щугаева Н.А., Вискребенцева Е.І. Принципові відмінності окислювального метаболізму екзогенного і ендогенного цукру// Фізіологія рослин. 1985. Т. 32. Вип. 6. С.1188-1196.

Для підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://elib.albertina.ru