Біологічні
функції серинових протеїназ
Курсова
робота студента 2 курсу
факультету природничих наук Бабошина Івана
Київ-1999
Національний
університет "Києво-Могилянська академія"
Факультет
природничих наук
Кафедра
біології
1.Вступ.
Серінові
Протеїнази дуже поширені в природі і виконують найрізноманітніші функції. При
єдиному механізмі дії активного центру серінові Протеїнази (далі по тексту --
СП) мають великі відмінності у специфічності, пов'язані з біологічною функцією
кожного окремого ферменту. СП діють на біологічних рівнях від
внутрішньоклітінного (Протеїнази лізосом) до організменого (Протеїнази, що
модифікують нейропептид). Дослідження всього різноманіття функцій СП дало
змогу зрозуміти причини таких хвороб,
як панкреатити, гемофілія, емфізема, що створило теоретичний базис для їх лікування.
СП відіграють важливу роль в імунній та гормональній системах; детальне
дослідження цих СП, безсумнівно, дасть практичні результати.
Найбільш
вивчені на сьогоднішній день серінові Протеїнази - це хімотріпсін, трипсин та
еластаза. Вони виділені у чистому вигляді і вивчаються більш як півстоліття, що
привело до накопичення величезного масиву інформації, яка має як теоретичне,
так і відчутне практичне значення. Це особливо стосується трипсину і
хімотріпсіну, які отримали широке застосування у медицині, фармакології, легкій
та харчовій промисловості, аналітичній біохімії і найрізноманітніших галузях
біотехнології.
У той
же час навіть для цих найпростіших СП є багато неясностей теоретичного і
практичного планів. Наприклад, досі не вияснили, яким чином при актіваційному
розщепленні проформ білків фермент розпізнає строго визначений зв'язок.
Отже,
дослідження функцій серинових протеїназ - важлива робота, яка, безумовно,
принесе ще чимало корисних плодів.
2.Загальна
характеристика серинових протеїназ.
Більшість
відомих на сьогодні серинових протеїназ
мають подібні амінокіслотні ланцюги зі схожою третиною будовою і тому
вважаються еволюційно спорідненими. (Бактеріальна СП субтілізін має зовсім
відмінну від решти послідовність амінокислот і третину будову). Спільна ознака
усіх СП - тріада амінокислот, яка складає їхню каталітічну ділянку. Це три
жорстко зафіксованих у просторі залишки серин, гістідіну і аспарагінової
кислоти, які забезпечують гідроліз амідніх і складноефірніх зв'язків, що
потрапляють в зону його дії.
Такий
гідроліз відбувається внаслідок унікальної здатності серинових залишку
каталітічної тріади (у хімотріпсіну він знаходиться в положенні 195)
ацілюватіся субстратом. Вважається, що при взаємодії карбоксільної групи
субстрату із серин гідролітічного центру утворюється високоенергетичних
проміжна сполука, яка перетворюється на
ацил-фермент з наступним його гідролізом:
Близьке
розташування трьох залишків амінокислот - АСП, Сер, Гіс - привело до
формулювання класичної на сьогодні гіпотези активації оксігрупі Сер 195 шляхом
переносу протона на АСП 102 по так званому ланцюгу переносу заряду:
Відмінності
у специфічності СП зумовлені різницею в будові "кишеньки", яка звязує боковий
ланцюг амінокислоти, по якій іде гідроліз зв'язку. У молекулі хімотріпсіну є
чітко виражена кишеньку, що зв'язує великі гідрофобні бокові ланцюги. У
молекулі трипсину на дні аналогічної "кишеньки" замість серин знаходиться
залишок аспарагінової кислоти. Здатність від'ємно зарядженої карбоксільної
групи утворювати іонний зв'язок із додатним зарядженими групами лізину чи
аргініну визначає різницю в специфічності дії хімотріпсіну і трипсину: якщо
хімотріпсін розщеплює поліпептідній ланцюг по фенілаланіну, тирозин,
триптофану і - в меншій мірі - по лейцин, то трипсин специфічно гідролізує
зв'язки, утворені карбоксильного групами лізину і аргініну. Направленість дії
фермента задається в першу чергу спеціфічністю такої "гідрофобної кишеньки" (її
позначають S1). У випадку СП з більш складною організацією можливе існування
додаткових зв'язуючих ділянок, розташованих у досить автономних доменах
молекули. Прийнято вважати, що ці ділянки забезпечують вісокоспеціфічне
розпізнавання ферментами своїх фізіологічних субстратів і забезпечують
необхідну послідовність гідролітічного процесу, а також деякі стадії взаємодії
ферменту з його нативних білковим інгібітором.
Окрім вищезгаданих ділянок міжмолекулярної
взаємодії СП мають ще й регуляторну (ефекторним) ділянку. Зв'язування нею
відповідного ліганда (ефектора) приводить активний центр ферменту в активованим
стан. Саме наявність таких ділянок пояснює явище субстратної активації --
нелінійного зростання швидкості гідролізу по мірі збільшення концентрації
субстрату.
Крім
того, усі серінові Протеїнази є кальцій-залежними білками, що містять одну
кальцій-зв'язуюча ділянку. Зв'язування іонів кальцію такого роду ділянками
збільшує стабільність молекули, підвищує її стійкість до денатураційніх впливів
і уповільнює процес автолізу ферменту.
Регуляція
активності СП здійснюється трьома основними шляхами, які знаходяться у
складному взаємозв'язку:
утворенням
протеаз у вигляді неактивних попередників (проферментів, зімогенів) з
перетворенням їх у активні форми під дією ферментів-актіваторів тільки у
фізіологічно передумовленіх органел;
локалізацією
ферментів всередині спеціальних утворів, оточених мембраною (лізосом у тварин;
вакуоль і білкових тіл у рослин);
присутністю
в клітинах і тканинах специфічних білків, що діють як інгібітори - серпінів.
3.Функції
окремих серинових портеїназ у різних процесах.
3.1.Згортання
крові (гемостаз) і лізіс тромби.
СП у
процесі згортання крові виконують функцію утворення фібрінового згустка, який
запобігає витіканню крові. Цей процес відбувається як складний каскад
послідовних розщеплювальніх актівацій факторів згортання крові - одна
протеїназа розщеплює проформу іншої. При цьому є два шляхи згортання:
внутрішній і зовнішній.Зовнішній запускається внаслідок активації т.зв. фактору
X після
стикання його з чужорідною поверхнею (схема 1). Внутрішній механізм спрацьовує
при появі в крові чужорідної для неї
речовини (що відбувається через руйнування прилеглих тканин) (схема 2). Після
відновлення структури судини в дію вступає СП, яка виконує лізіс тромби. За винятком трьох, всі активовані фактори
згортання крові являють собою СП. Зімогені цих СП мають амінокіслотні
послідовності, гомологічні послідовностям панкреатічніх зімогенів: трипсину,
хімотріпсіну, еластазі.
циркулюючих
в кровотоці фібриноген являє собою великий глікопротеїд з молекулярною масою
340 кДа і містить 4% вуглеводів. Його молекула складається з двох ідентичних
субодініць, кожна з яких сформована трьома неоднаковими пептидними ланцюгами --
АA, ВB і g. При
утворенні тромби серинових протеїназа
тромбін гідролізує один специфічний зв'язок Arg-Gly у кожному з ланцюгів АA і ВB; в
результаті від N-кінців відщеплюються
Пептиди А і В відповідно. Потім мономер фібріну агрегують з утворенням
м'якого згустку.
На завершальній
стадії утворення фібріну бере участь фактор ХІІІ (фібрінстабілізуючій фактор - FSF), що знаходиться в
тромбоцитах і плазмі. FSF із тромбоцитів
складається із двох ідентичних a-ланцюгів. FSF плазми має два a-ланцюги,
ідентичні ланцюга з тромбоцитів, і два b-ланцюги, що містять вуглеводи (
близько 5%). Обидві форми фактора ХІІІ є зімогенамі, що активуються тромбіном,
який гідролізує специфічний зв'язок Arg-Gly в N-кінцевій частині кожного
a-ланцюга. При цьому вивільняються
два пептиди, що мають по 37 амінокислот. Після модифікації внаслідок дії
тромбіну FSF тромбоцитів, який позначається а2, стає ферментативно активним.
Відповідний фактор плазми а2 `b2 залишається неактивним, доки
а-ланцюги НЕ відокремляться від b-ланцюгів; цей процес відбувається в присутності Са2 +. Активованим
фактор ХІІІ (ХІІІа) є трансглутаміназою, яка каталізує утворення поперечних
зшівок між поліпептіднімі ланцюгами ланцюгами субодініць фібріну. Кожен a-ланцюг зв'язаний з принаймні двома a-ланцюгами
іншої субодініці, g-ланцюг - тільки з одним g-ланцюгом іншої субодініці. Такий
згусток називається щільним. Він являє собою тривимірну сітку з розгалужених
протофібріл товщиною у дві молекули фібрін-мономеру, зміщеніх на половину
довжини молекули.
В
кровотоці ссавців існує рівновага між згортанням і розчинення фібріновіх
утворів (гемостаз). Основним шляхом видалення фібріну, що вже виконав свої
функції, є фібриноліз. Він здійснюється і контролюється складною
багатокомпонентних системою. Основними її компонентами є:
плазмін
- СП, основний фермент протеолітічної системи;
плазміноген
- Циркулюючих у кровотоці проферменту плазміну;
ряд
актіваторів і проактіваторів плазміногену;
інгібітори
плазміну - a2-антіплазмін та a2-макроглобулін.
нативний плазміноген людини являє
собою прошитий 24 дісульфіднімі
зв'язками одноланцюговій глікопротеїд з молекулярною масою близько 92 000 кДа,
він містить 790 амінокислот і до 2% вуглеводів.
Плазміноген зустрічається у більшості тканинних рідин. Його активація до
плазміну включена до цілого ряду фізіологічних і патологічних процесів, які
вимагають обмеженого протеолізу - таких як фібриноліз, запальні процеси,
тканинні перетворення, овуляція, ріст пухлин і метастазування.
Для
активації плазміногену в плазмін необхідне розщеплення пептидного зв'язку Arg560-Val561. При цьому утворюються важкий і
легкий ланцюги, з'єднані двома дісульфіднімі зв'язками. В даний час поширена
гіпотеза активації зв'язаного плазміногену, згідно з якою плазміноген і його
фізіологічний активатор завдяки специфічній спорідненості сорбуються на
фібріновій згусток, де і відбуваються процеси активації та фібринолізу.
Фібриноліз має вибірковий характер: направленість дії гідролітічного центру
задається аргініл-зв'язуючих ділянками, які ефективно конкурують з
"Гідрофобною кишенькою" плазміну за аргінільні залишки фібріну і забезпечують
тим самим розщеплення фібріну по лізільнім зв'язкам. Вівільнюваній в кровотік
по мірі лізісу згустка плазмін відразу інактивується a2-антіплазміном.
Важлива роль у взаємодії плазміногену з фібріном і плазміну з a2-антіплазміном
відводиться лізин-зв'язуючих ділянкам плазміногену (плазміну). Слід зазначити,
що крім взаємодій фібринолітичної системи лізин-зв'язуючих ділянками
опосередковані складні і маловівчені взаємодії з культуральному ендотеліальнімі
клітинами, гістідін-багатим глікопротеїном, тромбоспондіном, клітинними
рецепторами і компонентами екстрацелюлярного матриксу, що свідчить про
важливість і багатофункціональність лізин-зв'язуючих ділянок.
3.2.Актівація
ферментів підшлункової залози і травлення у тонкому кишечнику.
Подібно
до більшості біологічно активних білків, СП синтезуються у вигляді неактивних
попередників (проформ, зімогенів). Процес активації носить характер обмеженого
протеолізу і зводиться до розщеплення невеликого числа пептидних зв'язків
(іноді - навіть одного) в молекулі білка-попередника.
Ключове
положення в системі активації зімогенів підшлункової залози має трипсин, який
активізує усі без винятку зімогені підшлункової залози - хімотріпсіногені А, В,
С, проеластазу, прокарбоксіпептідазі А і В, зімоген фосфоліпазі та проформи
багатьох інших біологічно активних білків. Сам же Трипсиноген може
перетворюватися на трипсин як автокаталітічно - під дією трипсину, так і під
дією свого фізіологічного активатора - ентерокіназі (ентеропептідазі,
К.Ф.3.21.9), який здійснює активацію тріпсіногену шлункового соку при його
надходженні у дванадцятіпалу кишку. Якщо активація ентерокіназою відбувається ще
тоді, коли панкреатічній сік знаходиться у підшлунковій залозі, то передчасно
спрацьовують всі протеолітічні та ліполітічні його ферменти, через що
відбувається розщеплення структурних компонентів тканин - розвивається гострий панкреатит.
Трипсиноген
пертворюється на трипсин внаслідок єдиного розщеплення зв'язку Lys6-Ile7 і відщеплення N-кінцевого гексапептіду
(преактіваційного пептиду). Будова преактіваційніх пептидів різних організмів
досить подібна і характеризується наявністю кластера із чотирьох аспарагіновіх
кислот, що грають роль "іонного замка", який утримує проферменту в неактивного
стані. Внаслідок відщеплення в молекулі відбуваються конформаційні зміни, що
приводить до формування активного центру ферменту.
викликана
трипсином активація хімотріпсіногену проходить за схожим, хоча й складнішим
механізмом. Активація хімотріпсіногену А в активний фермент відбувається за
рахунок конформаційніх змін, викликаних тріптічнім розщепленням зв'язку Arg15-Ile16. На відміну від трипсину
актіваційній пептид залишається в складі молекули через дісульфідній зв'язок,
утворений його N-кінцевим цістеїном. Автокаталітічні розщеплення ведуть до
накопичення
