нейрональні рецептори в клітинах імунної системи

Олександр Олександрович Болдирєв, доктор біологічних наук

Людина давно припускав наявність взаємодій між імунною і нервовою системами в організмі. Недарма нам усім звична прислів'я "У здоровому тілі - здоровий дух". Відомі також і приклади зворотнього зв'язку - ще Гіппократ відзначив цю закономірність. У його "Діалогах" учні запитують: "Учителю, ти лікував багатих і бідних, переможців і переможених. Яка різниця між ними? "І Гіппократ відповів:" Рани переможців заживають швидше! "

І ось зовсім недавно нейрохімікі отримали докази реального зв'язку між імунної та нервової системами. У лімфоцитах, що циркулюють в кров'яному руслі, виявлені специфічні рецептори нервових клітин. Вивчення властивостей цих рецепторів відкриває нові можливості взаємодії двох найважливіших систем організму.

Глутаматние рецептори в нервовій системі

Серед різних медіаторів, забезпечують передачу збудження між нейрональних клітинами, особливе місце займає досить проста за структурою молекула глутамінової кислоти, глутамат: HOOC-СН2-СН2-СН (NH2)-СООН. Глутаматергіческіе механізми представлені приблизно в 40% нервових клітин, а решта припадає на частку всіх інших медіаторів (серотоніну, ацетилхоліну, допаміну та ін.)

За своїм участі в роботі нервових клітин глутаматние рецептори поділяються на два великих підтипу. Одні, іонотропние, з'єднані з іонними каналами, вони відкривають їх після активації відповідними молекулами (лігандами), так що потоки іонів викликають електричну активність нейрона. Інші, метаботропние, структурно не пов'язані з іонними каналами, вони управляють метаболічними процесами в клітині через спеціальні сигнальні молекули-інформатори, контролюючи активність іонотропних рецепторів. Лігандами, активують нейрональні рецептори, - їх первинні інформатори (первинні месенджери), а сигнальні молекули, які утворюються при активації метаботропних рецепторів і що використовується для коригування сигналів усередині клітини, -- вторинні месенджери.

Наявність різних глутаматних рецепторів у глутаматергіческіх синапсах головного мозку продемонстровано з допомогою фармакологічних сполук, що взаємодіють з яким-небудь одним видом глутаматних рецепторів. Виділяють три групи іонотропних рецепторів, названих у відповідності з лігандами, що забезпечують їх активацію: NMDA-рецептори, каінатние рецептори і AMPA-рецептори.

Метаботропние рецептори в даний час представлені вісьмома різними білками, які поділяються на три групи в залежно від того, які вторинні месенджери вони включають в роботу. Рецептори групи I пов'язані з регулюванням кальцій-залежних реакцій, а II і III груп - з циклічними нуклеотидами.

Більш докладно про функції вторинних месенджерів в клітинах і внутрішньоклітинних шляхи регуляції можна прочитати в спеціальній літературі [1 ].

Крім з'єднань, що імітують дію глутамата на окремі види рецепторів, агоністів глутамата, відомі і речовини, що вибірково виключає їх, - антагоністи глутамата. Для простоти викладу не будемо наводити повні назви, а обмежимося загальновживаними скороченнями цих синтетичних лігандів, які активно використовують у експериментальної нейрохіміі. Однак варто звернути увагу, що всі різноманітність можливостей сучасної фармакології вмістилося в одну просту формулу глутамата, здатного в синаптичних структурах мозку активувати різні рецептори, причому в тому співвідношенні, що забезпечує узгоджену роботу всієї глутаматергіческой системи.

Молекулярні реакції активованого нейрона

Нейрон активується в результаті взаємодії глутамата з іонотропнимі рецепторами. Виникає при цьому електрична активність (електричний потенціал) поширюється вздовж по аксона до нервового закінчення і передає інформацію про порушення на інші нейрони. Одночасно в порушує нервову клітині відбуваються важливі метаболічні зміни. Тимчасова послідовність цих процесів в загальних рисах з'ясована і представляється в такий спосіб. При вивільненні глутамата в межсінаптіческую щілину серед усіх рецепторів, що взаємодіють з ним, найбільш активні каінатние. Вони відкривають відповідні іонні канали, через які іони натрію спрямовуються всередину клітини і формують збудливий потенціал. Аналогічну роль виконують AMPA-рецептори.

У спочиваючої нейроні NMDA-рецептори пов'язані з іонами магнію, через що їх спорідненість до медіатора знижене. Однак завдяки деполяризації мембрани, що викликається збудливим потенціалом, комплекс розпадається, іони магнію відокремлюються від NMDA-рецепторів, і здатність останніх пов'язувати глутамат підвищується. Таким чином, на другій стадії порушення відкриваються NMDA-залежні іонні канали, пропускають всередину нейрона натрій і кальцій. Це подовжує збуджений стан мембрани і одночасно включає внутрішньоклітинні реакції, що залежать від іонів кальцію.

Тривалість другої хвилі збудження визначається не тільки активністю NMDA-рецепторів. Поява глутамата в межсінаптіческой щілини стимулює спеціальні білки, які забезпечують захоплення і зворотний транспорт цього медіатора в нервові або гліальні клітини. Точно так само і іони кальцію, що потрапили всередину порушеної нейрона, з одного боку, ініціюють вивільнення додаткової кількості кальцію з внутрішньоклітинних депо, а з іншого, - активують іонні насоси, що викидають кальцій з клітини назовні. Отже, імовірність активації NMDA-рецепторів лежить в тому часовому інтервалі, коли вони ще можуть зв'язатися з медіатором (мембрана нейрона деполярізована і магній відділений від інгібуючої центру), а в межсінаптіческой області ще є молекули глутамата, уникли зворотного захоплення. Але і кальцій-залежні реакції в клітці мають обмежені часові можливості - поки стаціонарна (дуже низька) концентрація цього іона не буде відновлена. Таким чином, взаємодія між каінатнимі і NMDA-рецепторами визначає тривалість хвилі збудження і ефективність перебудови метаболізму нервової клітини під впливом кальцію.

Але навіть і ця складна гра на спорідненість різних рецепторів до глутамату та ефективності системи його зворотного транспорту не вичерпує тонкої настройки нервової клітини на передачу і реалізацію збудження. Вона довершує участю метаботропних рецепторів у регуляції активності іонотропних рецепторів і глутаматного транспортера.

На пресинаптический мембрані при порушення метаботропние рецептори груп II і III пригнічують вивільнення глутамата. Навпаки, метаботропние рецептори групи I стимулюють цей процес. Їх дія ініціюють арахідонова кислота (АА) і діацілгліцерін (DAG), які вивільняються при активації фосфоліпази С (PLC) метаботропнимі рецепторами групи I на постсинаптичні мембрані. Другий регулятор, діацілгліцерін, активація протеїн С, яка блокує калієві канали. На цій же постсинаптичні мембрані метаботропние рецептори груп II і III блокують потенціал-залежні Са-канали. Таким чином, збудження клітини, викликане іонотропнимі рецепторами синаптичному контакту, контролюється метаботропнимі рецепторами цих же синаптичних мембран (рис.1).

Рис.1. Схема взаємодії іонотропних і метаботропних рецепторів у функції нейрона.

Глутамат вивільняється з пресинаптичного закінчення і взаємодіє з іонотропнимі (іГлуР) і метаботропнимі (мГлуР) рецепторами (I, II і III) в залежності від того, з якими вторинними мессенджерам вони пов'язані - інозітолтріфосфатом, (IP3), циклічним АМФ, (Самро), іонами кальцію і ферментом аденілатциклази (АС). Ці месенджери активують різні внутрішньоклітинні кінази (у тому числі протеїн С, РKС), що регулюють проникність іонних каналів постсинаптичні мембрани. Надлишкова продукція вторинних месенджерів призводить до нейротоксичності. Метаботропние рецептори групи I збільшують вивільнення глутамата, а груп II і III - зменшують його.

Активація протеїнкінази С і придушення K-каналів утримують деполяризацію мембрани, тим самим перешкоджаючи зв'язування магнію з NMDA-рецепторами і підтримуючи їх спорідненість до медіатора. Ймовірно, саме завдяки цьому надмірне збудження метаботропних рецепторів викликає токсичний ефект NMDA. Ця властивість лежить в основі дисбалансу у функції нервових клітин, що проявляється при різних ушкодження мозку - від нейродегенерации до ішемії, що наступає при інсульті. Значить, нейротоксичність NMDA-рецепторів може призводити до клітинної смерті -- або до некрозу, або до апоптозу.

Для розуміння молекулярних механізмів роботи системи небайдуже, який шлях буде обраний. Важливо це знати і медикам, що розробляє способи захисту нейронів мозку від смерті в несприятливих умовах [2 ]. Сучасні прилади за допомогою спеціальних барвників дозволяють кількісно оцінити кожен з цих видів клітинної смерті при окислювальному пошкодженні мозку. Дуже часто для таких досліджень використовується проточна цитометрії -- метод індивідуальної характеристики клітин [3] .

Апоптоз, некроз і проліферація клітин

Завдяки проточною цитометрії дослідники можуть легко відрізняти живі нейрони від тих, які стали на шлях клітинної смерті, і диференціювати некротичні нейрони від апоптозних на самих ранніх стадіях. Апоптоз - генетично запрограмована смерть, що здійснюється за допомогою специфічних механізмів і ферментів. При апоптозу клітина зморщується, її структури руйнуються цистеїнових-аспарагінової протеїназ, так званими каспаз. Сімейство цих ферментів (до нього входить близько десяти різних протеїназ) складає каскад взаімоконтроліруемих білків, переклад яких в активний стан вимагає одночасної присутності ряду клітинних факторів. Такий ступінчастий механізм охороняє від випадкового виникнення апоптозу.

Некроз обумовлений механічним або іншим ушкодження клітинної мембрани, порушенням цілісності та керованості клітини. Клітини, не здатні виконувати свої функції, вмирають, а їх велике кількість створює в тканини вогнище запалення.

Незважаючи на принципові відмінності апоптозу і некрозу, їх об'єднує корисна властивість - вони допомагають організму очиститися від непотрібних (пошкоджених) або шкідливих (чужорідних) структур. У вогнище запалення спрямовуються макрофаги та інші клітини, "сміттярі", що видаляють некротичні частини тканин або чужорідні частинки (наприклад, що потрапили в тканині занози). За допомогою апоптозу організм намагається розпізнати і ліквідувати клітини-мутанти, які стали небезпечними для організму (перероджуються спонтанно або під впливом зовнішніх факторів). Так, частота появи в організмі злоякісних клітин багато вище, ніж вірогідність самого захворювання, оскільки в більшості випадків вони розпізнаються і нейтралізуються імунної системою без шкоди для організму.

Апоптоз запрограмований на поступове контрольоване усунення клітин, а некроз здійснюється швидко, хаотично і некероване. При апоптозу фрагменти клітин або навіть цілі білкові молекули можуть використовуватися іншими клітинами для виконання тих самих самих функцій. Наприклад, в тимусі, де відбувається дозрівання лімфоцитів, клітини, що розпадаються при апоптозу, постачають свої білки-рецептори для перетворення "юних" лімфоцитів на повноцінні імунні клітини.

Епітеліальні клітини слизової запрограмовані таким чином, що апоптоз активується у них періодично і з великою частотою (вони живуть лише 1.5-2 тижні). Відторгнення апоптозних клітин знижує ймовірність проникнення в організм вірусної інфекції. Цікаво, що в російській армії для запобігання кишкових епідемій за указом Петра I в їжу додавали перець. Сьогодні відомо, що це прекрасний засіб для активації апоптозу клітин слизового епітелію.

Так чи інакше, вигода розпізнавання ранніх стадій і типу клітинної смерті очевидна. Для кожного з них є свої специфічні маркери. Один з фосфоліпідів клітинних мембран, фосфатидилсерин, в нормальних умовах розташований з внутрішньої сторони мембранного бішару, при порушеннях цитоскелету сигналізує про початок апоптозу. До речі, саме так макрофаги розпізнають і видаляють злоякісні клітини. Білки, чутливі до фосфатидилсерин (аннексіни), використовують для раннього розпізнавання апоптозних клітин. А для некротичних клітин з пошкодженою мембраною є інший маркер. Ним може бути барвник, наприклад іодіда пропідія (PI), який зв'язується з нуклеїновими кислотами, але не проникає через мембрану живих (нативних) клітин.

Експериментально показано, що після тривалої (30 хв) індукції окисного стресу активацією NMDA-рецепторів з'являються і некротичні, і апоптозние клітини, причому їх частку в популяції легко розрахувати (рис. 2). Таким чином, в руках дослідників є модель, що дозволяє оцінювати як потенційну вразливість нейронів з боку різних факторів, так і можливість захисту клітин від апоптозу або некрозу (наприклад, за допомогою лікарських препаратів).

Рис.2. Експериментальні результати індукції апоптозу і некрозу в суспензії нейронів: у контролі (зліва) і після 30 хв інкубації у присутності 0.5 мМ NMDA (праворуч). Цифрами вказані субпопуляції нейрональних клітин: живі (3), апоптозние (4), що піддаються легкому (1) і важкого (2) некрозу.

Стежити за розвитком апоптозу можна також, вимірюючи активність внутрішньоклітинних каспаз, які в клітці взаємно контролюють один одного (рис. 3). Так, при зв'язуванні на клітинній мембрані позаклітинних сигнальних молекул із спеціальним рецептором (CD95/Fas) в цитоплазмі неактивна прокаспаза 8 перетворюється в активний фермент, який, у свою чергу, активує каспаз 3, що відкриває клітці шлях до апоптозу. Навантажуючи клітини флуорогенним субстратом каспаз 3 і стимулюючи їх різними способами, можна вимірювати сигнал від флуоресцентного продукту. Зростає продукт -- активується каспаз 3, і інтенсивність сигналу буде пропорційна активації ферменту та ймовірності розвитку апоптозу.

Рис.3. Схема активації апоптозу, викликаної лігандом, взаємодіє з рецептором CD95/Fas і стимулюючим каспазний цикл.

1 - взаємодія ліганда з клітинним рецептором;

2 - вивільнення прокаспази 8 і її активація (сигнал клітинної смерті);

3 - поява одного з факторів активації апоптозу (активна каспаз 8);

4, 5 - утворення білків клітинної смерті (Bid, Bax), що знімають захист мітохондріальної мембрани білок Bcl-2, що перешкоджає витоку цитохрому с;

6 - витік цитохрому з з мітохондрій та освіта апоптосом за участю фактора Apaf-1;

7 - освіта апоптосом і перетворення прокаспази 9 в активний фермент, який активує каспаз 3, яка ініціює апоптоз.

Однак каспаз 3 бере участь не тільки у реалізації апоптозу, а й у багатьох стадіях клітинного циклу і в процесах проліферації [4 ]. Особливо важливі ці реакції для клітин імунної системи. Значить, у ряді випадків активність каспаз 3 не обов'язково означає початок апоптозу, а може бути пов'язана з проліферацією лімфоцитів.

Глутаматние рецептори іммуннокомпетентних клітин

Історія відкриття та вивчення глутаматних рецепторів накопичила масу прикладів їх причетності до роботи нервової системи: NMDA-рецептори відповідальні за молекулярні механізми пам'яті, метаботропние рецептори залучені в процеси нейропластічності [5 ]. Тим несподіванішою виявилися факти, що вказують на можливу наявність глутаматних рецепторів не тільки в нейрональних клітинах [6 ]. У 1997 р. І. А. Костанян і співавтори виявили, що глутамат добре зв'язується з мембранами лімфоцитів людини [7 ]. Витіснити з зв'язку з цим його можна, додаючи структурний аналог глутамата -- квісквалоновую кислоту. Пізніше було показано, що глутаматние рецептори є у лімфоцитах гризунів, і їхня активація призводить до росту в клітинах вільних іонів кальцію і активних форм кисню, в результаті чого активується каспаз 3 [8 ]. Запобігання зростання активного кисню блокує цей фермент (рис.4). Всі ці факти демонстрували, що робота NMDA-рецепторів в лімфоцитах - не випадковий процес, а пов'язана з глутаматной регулюванням іммуннокомпетентной системи клітини.

Рис.4. Експериментальні криві активації каспаз 3.

Інкубація лімфоцитів миші з N-метил-D-аспартат (NMDA) призводить до збільшення каспазной активності. Антиоксидант N-ацетилцистеїн перешкоджає активації каспаз.

Подальші дослідження, що проводяться в МДУ ім.М.В.Ломоносова і в Інституті неврології РАМН, показали, що, крім NMDA-рецепторів, в лімфоцитарною мембрані є й метаботропние рецептори групи III. Як і в нейрональних клітинах, вони виступають регуляторами іонотропних рецепторів. У наших експериментах при активації NMDA-рецепторів у лімфоцитах збільшувалася концентрація іонів кальцію і активних форм кисню, як наслідок, активувалася каспаз 3. Жоден з цих ефектів не проявлявся, якщо в середу інкубації додавали активатор метаботропних рецепторів L-AP4. Однак спільне присутність NMDA і L-AP4 надавало драматичний ефект на життєздатність клітинної популяції. Навіть після короткої інкубації з'являлося велика кількість мертвих клітин. Це привело нас до висновку, що присутність іонотропних і метаботропних рецепторів глутамата на мембранах лімфоцитів робить їх чутливими до тих же самим сигнальним молекул, які керують активністю нейронів (мал. 5).

Рис.5. Регулювання життя і смерті лімфоцита глутаматнимі рецепторами.

При взаємодії глутамата (Глу) з іонотропнимі рецепторами (іГлуР) іони кальцію входять усередину клітини, активізують протеїнкінази і каспаз 3, яка стимулює проліферацію. Взаємодія глутамата з метаботропнимі рецепторами (мГлуР) через G-білки стимулює активність іГлуР, що призводить до додаткової активації протеїнкінази та посиленому росту активних форм кисню (АФК). У цьому випадку можлива індукція клітинної смерті як шляхом апоптозу, так і шляхом некрозу. NMDA і L-AP4 імітують роздільний ефект глутамата на іГлуР і мГлуР відповідно.

* * *

Наскільки важливий факт розповсюдження глутаматних механізмів регуляції на імунну систему? Фактично, відкриття на клітинах імунної системи глутаматних рецепторів, відповідальних за молекулярну пам'ять, дозволяє припускати спільність формування поведінкових, адаптаційних та інших реакцій у клітинах нервової і імунної систем. Іншими словами, і ті й інші клітини відкриті одним і тим же видів сигнальних молекул, та інформація, обумовлена їх появою, доступна як нервової, так і імунній системі. Значить, ці системи можуть "спілкуватися", використовуючи мову одних і тих же хімічних символів [9 ]. Наявність глутаматних рецепторів у клітинах імунної системи розкриває структурну основу цих взаємодій і дозволяє вважати глутамат не тільки нейро-, але й іммунномедіатором.

Список літератури

1. Введення в молекулярну медицину/Ред. М. А. Пальців. М., 2004.

2. Болдирєв А.А. //Биохимия. 2000. Т.65. С.981-990.

3. Болдирєв А.А., Юнева М.О.// Соросівський освітній ж-л. 2004. Т.8 (№ 2). С.7-14.

4. Caspases: their role in cell death and cell survival / Eds M. Los, H. Waczak. 2002.

5. Carpenter D. NMDA receptors and the molecular mechanisms of excitotoxicity, in Oxidative Stress at Molecular, Cellular and Organ Levels / Еds P. Johnson, A. Boldyrev. Research Signpost, Trivandrum, 2002. P.77-88.

6. Болдирєв А.А., Тунева Е.О.// Біол. мембрани. 2005. Т.22. С.142-145.

7. Костанян І.А., Наволоцкая Е.В., Нурієва Р.І. и др.// Біоорг. хім. 1997. Т.23. С.805-808.

8. Boldyrev A.A., Kazey V.I., Leinsoo T.A. et al.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V.324. P.133-139.

9. Nedergaard M., Takano T. and Hansen A.J.// Nature Rev. Neurosci. 2002. V.3. P.748-755.