Вірусна безпека переливання крові

Ф.П. Філатов, д.б.н., зав. лаб .. вірусологічної діагностики Ін-ту переливання крові гематологічного наукового центру РАМН.

На будь-які надзвичайні ситуації (землетруси, повені, терористичні акти і тощо), що супроводжуються масовим травматизмом, наші співгромадяни, у яких співчуття чужому страждання в крові, негайно відкликаються чергами в пункти прийому цієї самої крові. За медичними показаннями донорська кров потрібна і в безлічі інших випадків, тому й існують кадрові донори, регулярно здають кров, або безоплатно, або за грошову компенсацію. У СРСР до 90% крові заготовлялися завдяки безоплатним донорам. Вони користуються певними пільгами, і Служба крові воліє мати справу саме з ними, оскільки їхнє здоров'я та їх кров протягом багатьох років ретельно перевіряються. Кадрові донори - золотий фонд будь-якої національної Служби крові ще і тому, що кров потрібно постійно, а не тільки в дні катастроф.

Разом з тим поширення СНІДу, вірусних гепатитів, а також експонентний зростання наркоманії в нашій країні змусили фахівців звернути пильну увагу на інфекції, які можуть передаватися з кров'ю. У свою чергу і у людей виникли цілком резонні побоювання відносно будь-якого травмуючого втручання - від хірургічних операцій до банальної ін'єкції. На цьому тлі у всьому світі стала скорочуватися сировинна база Служби крові. У Росії, де з зміною суспільного ладу були зруйновані абсолютно необхідні інститути колишнього держави, припинилося масове донорське рух, а Служба крові і Червоний Хрест теж стали жертвами національної традиції починати все з нуля. Масове зубожіння, зниження культурного й освітнього рівня разом з скороченням кадрового донорства частково компенсувалося у нас зростанням разового донорства. Сьогодні у платних разових донорів (нерідко це - солдати, які здають кров в індивідуальному або в "організованому" порядку) мотиви донації (так називається акт здачі крові) не обов'язково збігаються з потребами реципієнтів (тих, кому переливають кров). Разом з разовими добровільними донорами, співчуття яких чужого лиха перевищує тверезу оцінку якості того, чим вони готові поділитися, платні разові донори можуть представляти серйозну інфекційну загрозу здоров'ю тих, кому переливання крові потрібно за лікувальними, а не за життєвими показаннями.

Бактеріальна інфікованість гемотрансфузій

Спробуємо коротко розповісти про небезпеки переливання крові і про можливих небажаних наслідки гемотрансфузій. Мова піде про інфекційної небезпеки, причому лише про ту, яка викликається вірусами, не розглядаючи такі захворювання, як малярія, бруцельоз, хвороба Лайма, та ін. Для російської Служби крові віруси представляють набагато більшу небезпеку, ніж клітинні інфекційні агенти. Певною мірою ризик інфекції залежить від ареалів поширення патогенних мікроорганізмів і від національних правил. Так, у США наказують зберігати еритроцитарної масу на холоді (4 ° С) протягом майже півтора місяця (у нас -- половину цього терміну, а на ділі ще коротше; для тромбоцитів до 5 днів). За цей часом можуть розвинутися деякі холодолюбиві патогенні мікроорганізми (наприклад, Yersinia enterocolitica). Небезпека цієї бактерії пов'язана з її безсимптомним носіння. У Сполучених Штатах до 16% випадків загибелі реципієнтів в результаті переливань крові доводиться на бактеріальне зараження.

Незважаючи на періодично розповсюджуються міфи про сифіліс, трансфузійний (тобто що передається з донорською кров'ю) шлях зараження не відзначається багато десятиліття ні за кордоном, ні в Росії (Радянському Союзі). Збудник цієї інфекції дуже нестійкий і поза організмом носія живе кілька десятків секунд. Історично склалося, що тільки в нашій країні донорську кров саме на сифіліс аналізують дуже скрупульозно, кількома цілком чутливими методами. Спроби взагалі виключити дослідження донорської крові на сифіліс, наприклад у США, наштовхуються на стійкий протидію громадськості. Сифіліс може бути переданий тільки при прямому переливанні крові від донора реципієнту, з вени у вену. Але такий спосіб застосовується зараз дуже рідко, тільки за життєвими показаннями і при нестачі запасів перевіреної донорської крові.

Інше справа - малярія і хвороба Лайма, що здобувають все більшу популярність у наших краях. Російські нормативні документи не пропонують аналіз донорської крові на збудників цих інфекцій, можливо, тому, що випадків зараження донорською кров'ю поки що небагато.

Вірусна небезпека трансфузій

Віруси відповідальні більш ніж за 80% інфекційних захворювань людини, і це число неухильно зростає. Питання, чи розвинеться інфекція при переливанні донорської крові, що містить вірус, залежить від двох обставин: дози вірусу і здатності організму реципієнта йому чинити опір. Оскільки здоровому людині, швидше за все, кров не переливають, така здатність за визначенням нижче середньої. Щодо вірусу багато що залежить від його виду. Так, для гепатиту У заражає доза становить 10-100 вірусних часток, які можуть міститися у 0.5 мкл крові носія (і навіть те, що залишиться після висихання цього обсягу, збереже інфекційності для людини, оскільки цей вірус надзвичайно стійкий у зовнішньому середовищі), а переливають зазвичай літрові обсяги плазми (1 л = 106 мкл)! Для більшості інших вірусів заражають дози, як правило, вище. Але й тут є неприємні винятки - віруси, що поширюються з укусами комарів або кліщів, коли в русло крові напередодні абсолютно здоровою жертви потрапляють кількості слідів вірусу. До таких вірусів належать, наприклад, вірус Західного Нілу, зовсім недавно ще екзотичний в нашій країні, а тепер став реальною загрозою у трансфузіології південних регіонів Росії.

Якщо людина захворює, він, природно, не здає кров, але іноді люди залишаються здоровими носіями небезпечного збудника, і тоді їх кров стає небезпечною.

Інфекції, що проходять безсимптомно і супроводжуються вірусоносійство і слідами перебування патогенного вірусу (так званими вірусними маркерами) в кров'яному руслі, найбільш небезпечні при переливанні крові. Патогенність персистуючого вірусу полягає у віддалених наслідки інфекції, яка у разі ВІЛ-носійства призводить до СНІДу, а у випадках вірусних гепатитів - до цирозу і первинного раку печінки.

Портрет "ворога"

Віруси супроводжують клітинним формам життя "з самого початку", тобто мільярди років. Тривалий шлях розвитку і співіснування їх з клітинної життям призвели до рівноваги, яка повинна мати не тільки недоліки для однієї з сторін, а й переваги для обох. Це - окрема тема. Тут лише нагадаємо, що з відомих сьогодні науці майже 2 тис. видів вірусів взагалі патогенних -- мізерна частка, патогенних для людини і того менше, а патогенних, здатних передаватися з донорською кров'ю (а не з кров'ю взагалі), ще менше. Головна особливість таких вірусів - здатність формувати безсимптомне носіння, яке можна виявити лише спеціальними засобами.

Які ж віруси і викликаються ними інфекції найбільш небезпечні при переливанні крові або її компонентів?

Перш за все, це вірус імунодефіциту людини 1-го і 2-го типів (ВІЛ-1, -2), і не треба пояснювати, чому. Росія сьогодні переживає пандемію СНІДу. З нашої точки зору, дуже важливо знати час, що минув між зараженням і появою перших симптомів хвороби, тобто інкубаційний період, протягом якого інфікований людина може здавати свою кров, не усвідомлюючи її небезпеки. При СНІД він становить від 6 місяців до декількох років. Для Служби крові, що перевіряє кров кожного донора, ще більше значення має короткий період між зараженням і можливістю виявлення вірусу сучасними методами, так зване негативне вікно. При використанні найбільш чутливих тест-систем (ПЛР) воно складає при СНІД приблизно 6 днів, а при стандартних методах в середньому - 3 тижні. Оскільки доза інфікуються ВІЛ не може бути настільки високою, щоб забезпечити його наявність в кожній пробі плазми крові (від 200 до 500 мкл), оскільки найсучасніші методи (тестування з нуклеїнових кислот вірусів; Nucleic Acid Test - NAT) практично ніколи не виявляють у ній менше 50 частинок, і, нарешті, оскільки стандартний обсяг здаваної крові -- 350-400 мл, то негативний вікно в принципі не можна звести до нуля, і ризик інфікування реципієнта донорською кров'ю завжди залишається. У розвинених країнах регулярно публікуються дані по залишковим ризикам вірусного інфікування мінімум за три роки (у нас аналогічних відомостей немає), у США - ~ 2 на 1 млн донацій на рік; в Італії до NAT - ~ 1 на 450 тис. на рік, після введення методу -- ~ 1 на 900 тис. на рік; в Австралії відповідно - 1 на 3 млн і 1 на 5 млн у рік.

Для гепатиту B інкубаційний період - в середньому 90 днів (від 30 до 180). Захворювання небезпечно високою ймовірністю переходу в хронічну форму, цироз і первинний рак печінки; найбільш злоякісні форми (1% випадків) і приєднання гепатиту "дельта" можуть виявитися фатальними. Інфекційності на три порядки вище, ніж у ВІЛ, тривалість негативного вікна - в середньому 59 днів (37-87). У США залишковий ризик - ~ 15.8 на 1 млн донацій на рік; в Іспанії - ~ 1 на 75 тис.; в Австралії - ~ 1 на 520 тис. У Росії ці показники повинні бути істотно вище ще й тому, що епідеміологічна грамотність, в першу чергу тих, від кого може залежати інфікування за межами станцій переливання крові (перукарів, стоматологів, часом навіть хірургів), залишається дуже невисокою. Відповідно стерилізація інструментарію неадекватна, і число вірусоносіїв зростає.

Біч Служби крові - вірус гепатиту С, оскільки до цих пір в основному його визначають по наявності специфічних антитіл, які з'являються в середньому через майже три місяці (від 54 до 192 днів) після зараження. Весь цей час носій (донор) може не знати про свій стан, а лабораторія не може виявити вірусні маркери. Близько 85% інфекцій стають хронічними і перебігають безсимптомно; у третини інфікованих через 15-25 років можуть розвинутися цироз і первинний рак печінки. У США залишковий ризик зараження з донорською кров'ю - 9.7 на 1 млн донацій на рік, після введення NAT - до 2.72 на 1 млн донацій на рік; в Австралії до введення NAT ризик зараження становив 1 на 120 тис., після - 1 на 1 млн; у Франції - 1 на 800 тис. і 1 на 10 млн відповідно. У Росії використання NAT донорської крові на вірус гепатиту С поки не обов'язково (на відміну від Європи, де такий аналіз введений з 1999 р.), оскільки вимагає серйозних вкладень, спеціальних лабораторій і дуже грамотного, відповідального і обережного персоналу. Там, де знаходяться кошти і розуміє адміністрація, NAT застосовується навіть у масштабах регіону. Основна проблема цього методу - його гранична чутливість (теоретично до 1 цільової молекули в пробі), що при недотриманні вимог до проведення загрожує ненадійністю результатів (у Зокрема, хибнопозитивних). У такій ситуації виходом може стати тільки введення карантину, тобто використання для трансфузії крові, що зберігається в протягом негативного вікна, і тільки коли кров того ж донора, взята за закінчення цього періоду, вільна від вірусу.

Вірус гепатиту А, який викликає інфекційну жовтяницю, може передаватися з кров'ю носія бессимптомной інфекції. Дуже стійкий в зовнішньому середовищі; описані випадки інфікування препаратами крові, виробництво яких хоч і супроводжується інактивацією вірусів, але вона може виявитися неефективною у відношенні безоболочечних вірусів - таких, як вірус гепатиту А і парвовіруси. Російської Службою крові не тестується; зараження реципієнтів крові рідко.

Вірус гепатиту Е також може передаватися з кров'ю, але для Росії він є актуальним. Ендемічен для країн Центральної Азії (наприклад, Афганістану).

Вірус гепатиту "дельта" асоційований з вірусом гепатиту В; небезпечний при переливанні інфікованої крові, якщо у реципієнта виявлений маркер гепатиту В -- поверхневий антиген вірусу (HbsAg). У російській Службі крові широко не досліджується. Вірус ендемічен для країн Центральної Африки, Амазонії та Близького Сходу.

Віруси Т-клітинного лейкозу людини (HTLV-I,-II) вважаються неактуальними для Росії, але уважно вивчаються вітчизняними фахівцями. У США залишковий ризик інфікування з донорською кров'ю - 1.56 на 1 млн донацій на рік.

Парвовірус В19 може передаватися з донорською кров'ю і викликати патологічну симптоматику, наприклад, аплазії еритроцитів. Актуальний при переливанні крові вагітним, у яких може викликати патологію плоду. Дуже стійкий в зовнішній середовищі. У нашій Службі крові не аналізується, в США виявляється з частотою 1 на 3300-40 000 донорів.

герпесвіруси - Велике сімейство оболонкових збудників однотипної морфології. Як правило, супроводжують людину з перших місяців життя; стають небезпечними при ураженні імунної системи (СНІД, захворюваннях крові і їх хіміотерапії). У людини описано вісім патогенних видів, з яких найбільш актуальні цитомегаловірус (ЦМВ) і вірус Епштейна-Барр (ВЕБ). На тлі імунного дефіциту при переливанні вільною від цитомегаловірусу крові може реактивувати власний ЦМВ, якщо реципієнт виявився безсимптомним носієм. У Службі крові віруси герпесу аналізують в донорської крові для спеціальних цілей (наприклад, перед трансплантацією органів і тканин). Інфекція цитомегаловірусу небезпечна і при вагітності.

Вірус Західного Нілу - новий для нашої країни. Перша серйозна спалах з безліччю смертельних випадків зареєстрована у Волгоградській області в 1999 р. Передається з укусом комара: у 90% випадків інфекція залишається бессимптомной; в 10% випадків розвивається важкий менінгіт, хворих госпіталізують, але 10% з них врятувати не вдається. Вірус одночасно з'явився і на території США, де його вивчають як модель для розробки засобів боротьби з несподіваними і невідомими інфекції (наприклад, у випадку біотероризму). Досліджують його і російські фахівці, але Служба крові спеціальних заходів поки не робить і кров на цей вірус не тестує.

Ми не будемо продовжувати перелік нововідкритих вірусів, актуальних для національних Служб крові (у тому числі російської), просто в силу журнальних рамок цього огляду; крім того, вони і вивчені недостатньо.

Варто згадати тільки про абсолютно новий клас інфекційних агентів, про пріони, передаються через донорську кров. Це збудники сумно відомого "Коров'ячого сказу", нейродегенеративних хвороб Крейтцфельдта-Якоба, яка зареєстрована на території Європи, і хвороби куру, для нас географічно неактуальною. Пріони виявляються в білих клітинах крові (лейкоцитах), і ВООЗ рекомендує звільняти від них призначену для трансфузій плазму. Будь-яке підозра на симптоматику хвороби Крейтцфельдта-Якоба (тією чи іншою мірою деменція, наприклад), а також попереднє лікування препаратами гіпофіза (гонадотропіном або гормоном росту) повинно бути приводом для відводу донора.

Заходи щодо вірусної безпеки переливань крові

Чим ж забезпечується вірусна безпека гемотрансфузій? Хоча список відповідних заходів не дуже довгий, у виконанні він не так вже простий.

В першу чергу, це грамотна організація Служби крові та її елементів (по суті - Відновлення), чи то на основі злиття чи взаємодії виникли на її уламках в Росії відомчих та інших служб крові, створення баз даних у складі ЕРС (Єдиної донорської системи), організація системи карантину для компонентів крові і т.п., тобто відповідні адміністративні заходи.

Друга завдання - адекватна оцінка необхідності трансфузії з боку лікаря.

І, нарешті, питання, що безпосередньо пов'язані з переливанням крові: це, по-перше, еволюція трансфузійний середовищ; вивчення вірусів, що представляють інфекційну загрозу при гемотрансфузіях, методами молекулярної біології, найбільш адекватно описує сьогодні біологічні об'єкти, їх функції і поведінку, і, по-друге, вдосконалення засобів детекції (ідентифікації вірусів в матеріалах від донорів і в препаратах крові) на основі даних молекулярної біології цих вірусів.

В силу своєї спеціальності я не буду торкатися адміністра?? івних питань. Вірусологи можуть і повинні залучатися лише для експертної оцінки пропонованих чиновниками заходів. До того ж часто завдання виробників препаратів крові (розширення масштабів виробництва) і вірусологів (контроль і вибракування сировини, фактично ведуть до скорочення і без того небагатій сировинної бази Служби крові) суперечать один одному. До адміністративних заходів треба віднести й загальне оздоровлення нашого життя, боротьбу з наркоманією, бідністю та ін., оскільки чим менше вірусоносійства в так званих групах ризику, тим менше його і в популяції донорів.

За тих самих причин не буду розмірковувати про медичні показання до переливання крові. Зазначу лише, що, всупереч поширеній думці, втрата крові в першу чергу вимагає поповнення НЕ кіслородоносітеля, а об'єму рідини і біологічно активних білків, звичайно розчинених у плазмі крові.

І лише три останні пункту наведеного вище переліку безпосередньо стосуються молекулярної вірусології. Один з них (портрет ворога) ми вже обговорили.

Еволюція трансфузійний середовищ

трансфузійний середовища, тобто те, що переливають реципієнту (тут мова йде тільки про донорську крові), менш ніж за століття зазнали дуже помітну еволюцію.

Цілісна кров - найбільш вірусоопасний продукт, оскільки найчастіше віруси або сорбуються на поверхні клітин, або, інфікуючи їх, проникають всередину. Вона давно перестала бути основною трансфузійної середовищем. Її пряме переливання -- анахронізм, його роблять, тільки якщо немає іншого способу негайно повернути постраждалого до життя. Проте в деяких країнах (наприклад, Аргентині) цей спосіб практикувався до недавнього часу.

Сьогодні основна трансфузійна середовище - компоненти крові: плазма і клітинні елементи (еритроцити, лейкоцити і тромбоцити). З плазми холодовим осадженням отримують білковий концентрат, так званий кріопреципітат, також використовується для гемотрансфузій.

Найбільш безпечний продукт - перевірена на наявність цільових вірусів плазма. Крім того, її можна зберігати без втрати активності білків аж до того моменту, коли донор прийде знову здавати кров. Якщо його плазма буде вільна від вірусів, її залишають на зберігання, а використовують збережене. Так забезпечується додаткова гарантія безпеки продукту. Терміни карантину залежать від тривалості негативного вікна. Клітинні

елементи крові зберігаються гірше: еритроцити (за російськими правилами) - до восьми днів, тромбоцити - доба. Про використання лейкоцитів (найбільш вірусоопасного компоненти крові) йде дискусія. Основна проблема з тромбоцитами: вони дуже нестабільні поза природного середовища, але як терапевтичний засіб часто абсолютно незамінні.

Подальша еволюція трансфузійний середовищ йде в напрямку виділення та використання квінтесенції, п'ятого елемента, діючого початку, заради якого плазма і переливається. Це білки крові, які виділяються в ході спеціального фракціонування. У результаті холодового розділення з центрифугуванням (при отриманні Кріопреципітат) концентруються не тільки білки плазми, але і віруси, оболонка яких також має білкову природу.

Для отримання білків, що володіють специфічними функціями, - так званих факторів згортання (VIII і IX), необхідних для лікування хворих з порушеннями системи тромбоутворення, - потрібно ще більш глибоке фракціонування плазми.

вірусну безпека препаратів забезпечує вірусологічний контроль плазми крові, призначеної для переробки, - вхідний контроль. Методично він повторює процедуру вибракування донорської крові. Але з економічних міркувань зразки плазми об'єднують в пули по кілька десятків. При об'єднанні можливо розведення вірусу, що в свою чергу висуває підвищені вимоги до чутливості методів.

Наступний заслін на шляху ймовірного зараження препаратів крові - обробка проміжних продуктів хімічними (наприклад, сольвент-детергентнимі тощо) і фізичними (наприклад, нагріванням, опроміненням, фільтр та ін) методами. Заключний етап щодо забезпечення безпеки препаратів крові - вихідний вірусологічний контроль.

геноінженерний білки. В даний час еволюція трансфузійний середовищ йде шляхом синтезу чинного початку (білка) методами генної інженерії. Біологічні системи (наприклад, дріжджова) експресії генів для виробництва білкових препаратів добре вивчені, а віруси, супутні їм, або обмежені природними господарями, або непатогенних для людини. Ми не один рік маємо на ринку (у тому числі російському) продукти дріжджовий генної експресії, наприклад вакцину проти гепатиту В, яка в ряді країн застосовується і у новонароджених. Сьогодні геноінженерний методом отримані обидва чинники згортання - VIII і IX. Поки вони ще занадто дорогі, але в перспективі повинні стати істотно дешевше екстрагуються.

Генна терапія. Геноінженерний білки, отримані в результаті експресії генів у неприроднім молекулярному контексті (наприклад, білки людини в дріжджовий системі), можуть виявитися не строгими аналогами "природних". У першу чергу це стосується їх просторової структури і постсінтетіческіх модифікацій (глікозилювання тощо), які в чужорідному оточенні не завжди точно відтворюються. Крім того, білкова природа таких препаратів робить їх особливо чутливими до навколишніх умов (наприклад, температурним) і обмежує термін придатності. Ось чому особливу увагу привертає пряма доставка генів цільових білків, здатних до експресії в клітинах людини для синтезу необхідних продуктів. Ця технологія, що розробляється лише близько 10 років, на практиці поки не застосовується. Найбільш цікаві препарати такого класу - ДНК-вакцини (наша лабораторія бере участь у відповідних проектах). Виробництво ДНК-препаратів обіцяє бути набагато дешевше білкових. Крім того, вони істотно менше чутливі до коливань умов зберігання. Але їх використання, якщо і буде називатися гемотрансфузіями, то тільки за традицією.

Лабораторна діагностика вірусів

В лабораторіях Служби крові вірусні білки аналізують методами імуноферментного аналізу (ІФА). Його чутливість вимірюється в одиницях маси, нг, і порівняти з NAT (у тому числі з полімеразної ланцюгової реакцією - ПЛР), чутливість якого вимірюється кількістю молекул, або в геном-еквівалентах. Проте у ряді випадків імуноферментний аналіз -- цілком адекватний метод. Наприклад, при гепатиті B аналізується поверхневий білок вірусу (HbsAg), а при реплікації вірусу його синтез значно перевищує потреби збирання вірусної частки. Імуноферментний аналіз може бути прямим, коли реєструється вірусний білок, або непрямим, коли визначаються антитіла, що виникають у відповідь на вірусне інфікування. NAT і методи ІФА не конкурують, але взаємно збагачують один одного. Обидва вони залишаються основними в арсеналі прикладної вірусологічної лабораторії, але безперервно вдосконалюються.

При визначенні вірусних нуклеотидів стандартну ПЛР-діагностику починають посилювати (поки не витісняти - через досить високу вартість обладнання). Цей варіант, названий ПЛР в реальному часі (реал-тайм), має три серйозними перевагами: він істотно вільніше від псевдопозитивних результатів (оскільки сама реакція і реєстрація результату відбуваються в одній камері), може скоротити час аналізу до 2-3 год (стандартний лабораторний ІФА також вимагає 2-3 год, стандартна ПЛР - не менше 8-10 і більше годин) і дозволяє кількісно оцінювати цільової мікроорганізм.

Наступний крок у вдосконаленні вірусологічної лабораторної діагностики - технологія мікрочіпів. Вона інтенсивно розробляється більше 10 років і використовується в основному в експериментальній науці, але сьогодні поступово виходить і в практику. Мікрочіпи дозволяють одночасно проводити десятки, сотні, тисячі і сотні тисяч реакцій - в мікрокамерах, фіксованих на невеликому майданчику - скажімо, 4