Розвиток
антимікробної хіміотерапії та нові парадигми
А. М. Єгоров,
Ю. О. Сазикін, В. П. Іванов, Державний науковий центр антибіотиків, Московська
медична академія ім.І.М. Сеченова, Москва, Росія
Вступ
Розвиток
хіміотерапії на строго науковій основі стало можливим, природно, тільки
після робіт Л. Пастера, тобто виявлення об'єкта, на який повинні
впливати антимікробні агенти. Цілком закономірно також, що періоду
хіміотерапії передував період асептики та антисептики.
Виникнення
антимікробної хіміотерапії датується досить точно - першими роками ХХ століття і
пов'язано, як відомо, з роботами П. Ерліха і його школи. Суть не в знаменитому
препараті 606 (сальварсан) з ряду арсенобензолов, якого давно вже немає в
фармакопеях світу. Захоплено зустріли, цей препарат зберіг свою
об'єктивну цінність, але поступово була витіснена з практики спочатку
неосальварсаном, отриманим самим Ерліхом, а потім іншими препаратами. Суть
полягає в сформульованих Ерліхом тезах, які протягом 100 років виглядали
непорушними і лише зараз піддаються обережному перегляду, причому з
застереженнями.
Як відомо,
Ерліх сформулював низку тез, які відразу ж набули значення парадигм,
тобто сприйнятих всім науковим співтовариством "зразків", або моделей
вирішення проблеми, що дають реальний прообраз дійсності. Зміна парадигм по
міру поглиблення знань можлива, але вона рівнозначна наукової революції в конкретній
області.
Основоположні
тези Ерліха добре відомі. Їх аналіз показує, що Ерліх ставив на чільне
кута хіміотерапевтичний індекс антимікробної препарату [1]
. У перекладі, зробленому в 1910р., Стиль
якого став вже кілька архаїчним для нашого часу, це виглядає так:
"Хемотерапія ставить собі завдання знайти такі речовини, які при великому
вплив на паразитів принесли б можливо менше шкоди організму ". І далі:
"Засіб в практику не вийде, якщо взаємовідношення між отруйна і
лікувальної дозуванням несприятливо ". Звідси уявлення про ідеальну по
вибірковості магічної пулі, що переходили з підручника в підручник (магічна
куля Ерліха).
За першу третину
XX століття після знаменитих препаратів Ерліха арсенал антимікробної хіміотерапії
поповнився фактично тільки сульфаніламідами
. Починаючи ж з 40-х років
настав безперервне впровадження в практику природних, синтетичних та
напівсинтетичних речовин різноманітної хімічної структури з виключно
високою біологічною активністю. Остання обставина сформувала інтерес
до механізму їх дії і на клітинному рівні, і на рівні сумарних
біохімічних процесів і, нарешті, на молекулярному рівні.
Можна
стверджувати, що майже півстоліття рішення задачі цілеспрямованого створення нових
похідних антимікробних агентів ставилося в залежність від побудови
правильної моделі взаємодії прототипу з внутрішньоклітинної мішенню. При цьому
мішень в мікробної клітці малася на увазі як єдина (парадигма
вибірковості).
Обмеженість
такого подання без урахування хронобіологіческіх закономірностей і
закономірностей транспорту антибіотика в клітку, поняття проміжних
(тимчасових) мішеней, без знання субклітинному та молекулярної топографії всій
клітини стала зрозумілою до середини 60-х років.
Складність
організації клітини навіть у прокаріотів дозволяє стверджувати, що абсолютизувати
вибірковість не можна. Прикладом цьому можуть слугувати хоча б три широко
застосовуваних групи антимікробних агентів - b-лактами
,
хінолони
і аміноглікозиди
.
b-лактами
і хінолони
мають більше однієї мішені в мікробної клітці (різні пеніцилінзв'язуючими
білки, або ж ДНК-гіраза і ДНК-топоізомераза IV).
Аміноглікозиди
,
зокрема стрептоміцин, також багатозначні у своїй взаємодії з
мікроорганізмом:
реагування з
30S рибосомного субодиницею на стадії ініціації білкового синтезу веде до
припинення синтезу білка;
реагування з
30S рибосомного субодиницею на стадії елонгації поліпептидного ланцюга веде до
синтезу "летальних" білків;
взаємодія
з oriC локусом запобігає реплікації ДНК.
До цього слід
додати, що, реагуючи з іонами магнію зовнішньої мембрани, стрептоміцин
"самопромотірует" своє проникнення в клітину. Нарешті, він же
викликає часткову деструкцію цитоплазматичної мембрани. Будь-яка молекулярна
модель "поза клітини", наприклад модель взаємодії стрептоміцину з
рибосомою, не зможе вичерпно пояснити механізм антимікробної ефекту
цього антибіотика.
Звертають на
себе на нещодавні (друга половина 90-х років) дослідження в області макролідних
препаратів. Виявилося, що рокситроміцин, кларитроміцин і азитромицин,
мабуть, володіють позитивним ефектом при лікуванні атеросклерозу,
артритів та астми - хвороб неінфекційної природи, відповідно до думки,
пануючому багато десятиліть.
В даний
час ведуться дискусії про етіологічне значення в цих захворюваннях
внутрішньоклітинно локалізованих бактерій, зокрема хламідій. На думку ряду
авторів, саме в цьому слід шукати причину ефективності даних
антибіотиків.
Однак
існує й інша точка зору: ефективність макролідів
пояснюється корекцією ними "надмірних" запальних реакцій,
обумовлених поліморфноядерними нейтрофілами і моноцитами, оскільки зазначені
макроліди
виявляються у високих концентраціях у фагоцитах [2]
.
Таким чином,
можна говорити про зміну парадигм або в патології, або в хіміотерапії.
Позитивною якістю певних антибіотичних структур виявляється
саме відсутність суворої вибірковості дії. Слід також відзначити, що
що не володіє прямою дією на пухлини кларитроміцин в останні роки
звернув на себе увагу як протипухлинний препарат. Його механізм дії
реалізується, мабуть, на рівні інтерлейкінів [2
, 3
].
Взагалі можна
вказати, що з 90-х років минулого століття не припиняються систематичні спроби
поєднувати в одній низькомолекулярної структурі дві якості - антибактеріальну і
імуномодулюючу активність. Поки найбільш вдалим результатом такого
цілеспрямованого пошуку вважається цефодізім. На основі цефалоспориновий
структури отриманий лікарський препарат, що діє (на клітинному рівні) на
дві мішені - бактерію і фагоціт і що володіє антибактеріальних і
імуностимулюючим ефектом [2
, 4
].
Пропонується
ретроспективний аналіз величезного переліку антибіотиків з метою виявлення серед
них фармакологічно активних речовин або здатних стати прототипом для
речовин такого роду, які можуть бути отримані шляхом хімічної модифікації.
Звичайно, при цьому не ставиться, як завжди, обов'язкова завдання збереження
антимікробної активності.
Так, наприклад,
ведуться пошуки похідних еритроміцину і ціклоспорінаА, що володіють,
відповідно, мотіліноподобним дією (стимуляція перистальтики кишечнику)
і здатністю повертати фенотип резистентної пухлинної клітини до
чутливого. При цьому декларується (як бажана) втрата
антибактеріальної або іммуносупрессорной активності, властивою прототипам.
Погляди
Ерліха були єдино правильними на тому рівні знань, який був доступний
на початку XX століття. Зміна парадигм в хіміотерапії обумовлюється зараз
досягненнями фундаментальних наук, що призвели до набагато більш глибокому
розуміння взаємодії ліки з патогеном в інфікованому організмі.
Багато чого очікується також від комбінаторної хімії, геноміки та протеоміка (Протеом --
повний набір або сукупність білків в клітині).
комбінаторна
хімія конструює нові структури, використовуючи "принцип подоби" - з
фрагментів, біологічна активність яких "в тому чи іншому
напрямку "була вже доведена. Необхідність аналізу кількісної
кореляції структурно-функціональних відносин не вимагає доказів.
Є прийоми для
підвищення ефективності роботи зі створення ряду речовин із запланованим
різноманіттям. Однак зміна функції речовин в одному випадку, наприклад, при
взаємодії з кінцевою мішенню, ще не означає вирішення питання про створення
ліки. Потрібно облік взаємодії з проміжними мішенями і т. д.
Ретроспективний
аналіз робіт щодо створення раціонального молекулярного дизайну, наприклад фторхінолонів
,
створює враження глибокого систематичного передбачення результатів
експериментів. У реальності систематичного просування на шляху від
налідиксової кислоти до сучасних фторхинолонам
не було, принаймні стосовно до створення принципово нових лав.
В останні
роки ведеться все більш жвава дискусія про можливості, які відкриваються
перед хіміотерапією за рахунок використання геноміки та протеоміка. Здійснено
повне секвенування геному багатьох патогенних бактерій. Міжнародні бази
даних, які мають особливо докладними відомостями про геномах так званих
"модельних" мікроорганізмів (Escherichia coli, Staphylococcus aureus
тощо), а також про геномі еукаріотів нижчих та вищих, в змозі швидко давати
інформацію з області структурної, порівняльної та метаболічної геноміки [5
, 6
]. Це дозволяє ідентифікувати у патогенів
гени, включені у відомі метаболічні процеси, диференціювати гени з
ще невідомими функціями.
Ампліфікація
цікавить дослідника гена за допомогою полімеразної ланцюгової реакції,
використання в подальшому систем транскрипції і трансляції дозволяють виявити
кодується їм продукт і встановити його функцію на рівні фенотипу. Таким
чином, створюється можливість перевірки активності рядів як синтетичних, так
та природних речовин в якості інгібіторів функцій конкретних генів, точніше - кодованих
ними продуктів. Іншими словами, відбір та вивчення нових антимікробних агентів йде
не від організму до гену, а від гена до організму відповідно до впровадженим
зараз в літературу терміном "зворотній генетика".
Успіхи геноміки
(і генної інженерії) дозволяють виявляти гени, необхідні патогенну при його
розмноженні тільки в інфікованому організмі і потім вести пошук інгібіторів
функцій їх продуктів. Так, з недавнього часу здобула популярність система
"InVivo Expression Technology" (IVET), що використовується для відбору генів
вірулентності (ivi гени) [7
, 8
].
Геном
досліджуваного патогена фрагментіруется за допомогою набору рестріктаз: в окремих
фрагментах виявляються або ivi гени, або "життєво важливі" гени.
Останні необхідні клітині для її росту і invivo, і invitro.
Інгібітори їх
функцій можуть бути виявлені і на штучної живильному середовищі, тобто
відомими шляхами. Гени ж вірулентності, мало вивчені взагалі, представляють,
як мішені для хіміотерапевтичного агента, особливий інтерес, оскільки патоген,
втратив вірулентність, буде швидко знищуватися захисними силами організму.
Система IVET, заснована
на захопленні промотора тих генів, які експресуються тільки invivo,
дозволила виявити, наприклад, у сальмонел приблизно 1% таких генів. Системи
виявлення ivi генів, що базуються на різних підходах, розробляються в різних
лабораторіях. До числа генів вірулентності входять не тільки гени, що кодують
освіта адгезінов, інвазінов і т. п., але і гени, які дозволяють мікроорганізму
переносити дефіцит необхідних речовин в макроорганізму, наприклад, гени системи
транспорту заліза, реутилізацію пуринів.
Безсумнівно, що
на парадигмах сучасної хіміотерапії, а точніше - хіміотерапії найближчого
майбутнього має позначитися розвиток протеоміка [9
, 10
, 11
].
Протеомика в
обов'язковому поєднанні з молекулярної біології, геноміки та білкової хімією
знаменує якісно нове поглиблення знань у всіх галузях біології, у тому
числі і мікробіології. Як правило, у статтях, присвячених питанням протеоміка,
підкреслюється, що її розвиток стає можливим. Більше того, воно неминуче
саме в "постгеномну" еру.
Якщо геноміка
заснована на диференціації кожного гена з їх сукупності в геномі і його
характеристиці в різних аспектах з використанням баз даних, то протеоміка --
на диференціації та характеристики клітинних білків також з використанням баз
даних.
Протеомика,
кажучи з певною часткою умовності, ближче до пізнання фенотипу клітини,
вирощуваної в конкретних умовах або що знаходиться під впливом тих чи
інших стресових факторів. Виявлення гена саме по собі ще не означає, що він
експресується в будь-якому випадку, тобто що його продукт повинен братися до
увагу завжди. У той же час виявлення кодованого геном продукту і
визначення його кількості, як правило, має враховуватися при характеристиці
властивостей клітини.
Стандартний
аналіз протеома починається з добування розчинних білків та їх розподілу і
візуалізації методом двовимірного електрофорезу в гелі. Індивідуальний білок
після попередньої обробки аналізується методами мас-спектрометрії або
іншими методами (капілярна рідинна хроматографія). Ідентифікація білків
здійснюється з використанням знову ж таки відповідних баз даних.
Така
методологія дозволяє вловити відповідь клітини за якісними та кількісними
змін білкової експресії на всілякі зовнішні дії, включаючи
реакцію на доданий антибіотик, на фактори імунітету; уловлюються також по
характеру білкової експресії зміни, що ведуть до патогенності,
антибиотикорезистентности і т.д.
Одна з важливих
завдань протеоміка - контроль за Посттрансляційна модифікація білків. З
допомогою баз даних залучили до себе увагу білки класифікуються за
функцій, внутрішньоклітинної локалізації та іншими показниками, які характеризують їх
роль.
Техніка
двовимірного електрофорезу вимагає, однак, у ряді випадків удосконалення. Наприклад,
ведеться пошук особливих прийомів для поліпшення ідентифікації гідрофобних (пов'язаних
з мембранними структурами) білків.
Актуальним
є зменшення трудомісткості аналізу сукупності білків мікробної клітини,
оскільки в ній налічується кілька тисяч індивідуальних білків. Тим не
менш вже досягнута ідентифікація в одному експерименті близько 2000 білків.
Останнім
час стала розвиватися кількісна протеоміка, що дозволяє кількісно
зіставляти експресію окремих білків. У цілому протеоміка не тільки
доповнює геноміку, її напрямок, який одержав назву
"метаболічної" або "функціональної", але і є етапом
(не останнім) наближення до розуміння клітки як єдиної динамічної
сукупності макромолекулярних структур.
Можливо, що в
майбутньому належить термінологічне оформлення і "постпротеомной"
ери, коли предметом уваги виявиться склад і кількісне співвідношення (на
даний момент ростового циклу) усіх низькомолекулярних метаболітів - продуктів
ферментативних реакцій. Враховуючи, що реалії хіміотерапії дуже часто
базуються на препаратах, які є аналогами ферментних субстратів, можна
також очікувати принципової вкладу в хіміотерапію майбутнього.
Цікаво
відзначити, що основні чинники, що стосуються механізму дії
пеніциліну, як потім виявилося, що застосовуються і до інших b-лактамних
антибіотиків, були отримані більш ніж за третину століття до формування протеоміка
саме відповідно до методології цієї, невідомої тоді, наукової
дисципліни. У той період, коли було встановлено, що пеніцилін, будучи
інгібітором D-аланінтранспептідази, припиняє освіта пептидоглікану
клітинної стінки в бактерій, і коли увага зосередилася на пеніцилін
як аналог субстрату в активному центрі цього ферменту, абсолютно несподівано
виник новий, як нібито зайвий, термін - "пеніцилінзв'язуючими
білки ".
Методами
електрофорезу (у поєднанні з радіоізотопними) була показана необхідність врахування
топографії всій мікробної клітини при встановленні механізму дії b-лактамів
.
Множинність D-аланінтранспептідаз, однакових за каталітичної функції, але
не за молекулярною масою та інших фізико-хімічними властивостями, що відповідають за
завершення синтезу пептидоглікану на полюсах клітини, або при формуванні
клітинної перегородки, або при подовженні паличковидних форм, виявилася вкрай
важливою. Вони володіли неоднаковим спорідненістю до різних b-лактамами
.
Зрештою це зіграло визначальну роль у тому, що b-лактами
стали найбільшою за різноманітністю і значущості груп?? ой антибіотиків.
Роль протеоміка
в хіміотерапії в майбутньому може бути пов'язана з вирішенням багатьох проблем, що стоять
перед наукою. В якості прикладу слід вказати на назріла потреба
вивчення методами протеоміка клітин Helicobacter pylori при мікроеволюції цього
патогена в інфікованому організмі [12]
.
Відомо, що
культура H.pylori при стресовій ситуації invivo диференціюється як би на два
субпопуляції - одна частина клітин гине і лізує, інша ж частина
адаптується і поглинає ДНК, що звільнилася з ціалізуватися клітин.
Передбачається, що загальний сигнал для популяції - "quorum santis" --
забезпечує виживання культури у важких умовах за рахунок збагачення геному
компетентних клітин. Однак для того щоб підтвердити біологічне значення
цього явища потрібно вивчити експресію поглинених генів, використовуючи методи
протеоміка, зокрема кількісної.
Широке
використання підходів з боку не тільки геноміки, а й протеоміка
необхідно для з'ясування причин сучасної епідемії туберкульозу. Це відноситься
як до характеристики протеома клітин мікобактерій, наприклад, доказ
реальності компенсаторних мутацій і вивчення їх фенотипова вираження, так
і до проблеми гетерогенності людської популяції відносно сприйнятливості
до туберкульозу [13]
.
Число таких
додатків методології протеоміка безпосередньо до вирішення завдань хіміотерапії
велике. Доцільно проте згадати про протеоміка стосовно
біогенезу вторинних метаболітів з антибіотичними властивостями у актиноміцетів.
Проблема експресії "мовчазних" генів, включених в біогенезу антибіотичних
структур, може бути дуже важлива для поповнення переліку природних
хіміотерапевтичних речовин.
Напрошується
можливість зіставлення генів, експресія яких грає роль у
пристосуванні патогенного мікроорганізму до дії несприятливих факторів
invivo, і в пристосуванні грунтового мікроорганізму до мінливого зовнішнього
середовищі.
Проблема
стає, таким чином, загально біологічних. Прикладні ж мети тут різні:
пошук генів, тобто їх білкових продуктів як нових мішеней для
хіміотерапевтичних речовин, і пошук генів, тобто кодованих ними ферментів,
включених до біогенезу ще не описаних хіміотерапевтичних агентів.
Як випливає з
усього викладеного, провідну роль у кожному новому напрямку, від якого
очікується прогрес антимікробної хіміотерапії, грають не мікробіологи. В одному
випадку - це хіміки-органіки і біоорганікі, в іншому - генетики, зокрема
генні інженери, у третьому - фахівці з білкової хімії та біохіміки.
Використовуючи методологію комбінаторної хімії, геноміки та протеоміка, вони з повним
підставою вказують на реальність нових підходів до отримання антимікробних
агентів.
І все ж сама
блискуча розробка теоретичних основ цих підходів ще не означає
безпосереднього вкладу в практику. Останній може затриматися через
недостатньої уваги до особливостей мікробної клітини в цілому і особливостям
конкретного патологічного процесу.
Образно кажучи,
наміри фундаментальних наук декларовані, а міць їх методології
продемонстрована. Настала черга істотного практичного внеску в
вирішення актуальних проблем хіміотерапії.
Як свого роду
зразок для порівняння пошукових стратегій, розділених півстолітнім періодом, і
у зв'язку з нещодавно відзначеним 50-річним "ювілеєм цефалоспоринів"
цікаво повернутися до історії відкриття цефалоспорінаС [14
, 15
]. Вона є прикладом самовідданої
праці без далекосяжних теоретичних побудов: в той же час цефалоспорини
чотирьох поколінь є напівсинтетичними варіантами цього цефалоспоринів.
Його відкриття - ланцюг випадковостей і щасливого вибору правильного напряму
досліджень.
Помилкова в
цілому концепція самоочищення морської води за рахунок антибіотиків, утворених
морськими мікроорганізмами, у поєднанні з відсутністю захворювань черевний тиф
у тих, що купаються поблизу місця скидання стічних вод призвели до виявлення в Сардинії
гриба - продуцента цефалоспорінаС.
Цей антибіотик
малоактивний взагалі і зовсім неактивний проти збудника черевного тифу.
Утворювався він в малих кількостях і був до того ж "замаскований"
присутністю антибіотичних тритерпенових структур (вже відомих на той
часу) і пеніціллінаN. Він був виділений як випадково виявлена мікропрімесь
в препаратах пеніціллінаN. Його цінність сама по собі була відсутня, і
знадобилося проявити інтуїцію та ентузіазм, щоб вивчати цю структуру.
Як згадував
багато років по тому один з авторів препарату Е. Абрахам, тільки диво могло
вирішувати все нові і нові проблеми, з якими стикалися на шляху до цефалоспоринів
(не знаючи, що з часом цефалоспорини
складуть не менше половини
застосовуваних у клініці антимікробних антибіотиків). Тут же Е. Абрахам віддав
належне правильної організації прикладної науки: "Успіх - в інтуїції,
терплячості і готовність йти на ризик фармацевтичних компаній "[14]
.
Дійсно,
початкове фінансування університетських досліджень (в Оксфорді) було
додати після підтвердження цінності препарату безпосередньою участю на
пізніх стадіях його розробки лабораторій фірми "Lilly".
Створення
принципово нових лікарських препаратів інноваційними шляхами в XXI столітті
буде, безсумнівно, найбільш успішним при інтернаціоналізації досліджень.
Список
літератури
СазикінЮ.О.
П. Ерліх і початок сучасної антимікробної хіміотерапії. Антибіотики й хіміотер
1999; 44 (12) :5-14.
LabroM.T. Antibacterial agents - phagocytes: new
concepts for old in immunomodulation. Int JAntimicrob Agent 1998; 10:11-21.
MikasaK. SawakiM., KitaE., Et al. Significant survival
benefit of clarithromycin threatment for patients with unrespectable lung
cancer. Proceedings of the 4th International conference on the macrolides,
azalides, streptogramins and ketolides. Barcelona, Spain; 1998. 40, 4.05.
LabroM.T. Experimental evaluation of antibiotics as
immunomodulators. JChemother
1994; 6 (Suppl.5) :10-4.
ЕгоровА.М.,
СазикінЮ.О. Антимікробні агенти в майбутньому. Вклад геноміки в їх створення.
Антибіотики й хіміотер 1999; 44 (12) :5-14.
MoirD.T. , ShawK.J., HareR.S., VovisG.F. Gemomics and
antimicrobial drug discovery. Antimicrob Agent Chemother 1999; 43:439-46.
HeithottD.M., ConnerC.P., HannaP.C., etal.
Simultaneous identification of bacteral virulence genes by invivo gene
expression, PNAS USA 1997; 94:934-9.
MahanM.T., TobiasT.W., StauchT.M. Antibiotic - based
selection of the bacterial genes that are specifically induced during infection
of a host. PNAS USA 1995; 92:669-73.
CordwellS., NoawensA., VerrillsN., et al. The
microbial proteome database - an automated laboratory. Catalogue for monitoring
protein expression in bacteria. Electrophoresis 1999; 20:3580-8.
MannM. Quantitative proteomics? Nat Biotechnol 1999;
17:954-5.
WashburnM.P., YatesJ.R. Analysis of the microbial
proteome. Current Opinion Microbiol 2000; 3:292-7.
LorenzM.G., WackernagelW. Bacterial genes transfer by
natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev 1994;
61:627-32.
DaviesJ. Antibiotic resistance in mycobacteria In:
Genetics and tuberculosis. John Wiley and Sons; 1998. р.195-205.
AbrahamE.P. Reflections on the development of the
cephalosporins. Giorn Ital Chimioter 1970; 17:4-12.
Hamilton-MillerJ.M.T. Sir Edward Abraham's contribution
to the development of the cephalosporins: a reassessment. Int JAntimicrob Agent
2000; 15:179-84.
