Дослідження крові

Ярославська Державна Медична Академія

Кафедра пропедевтики внутрішніх хвороб педіатричного факультету

Ярославль, 1997

Порядок дослідження:

Морфологічне дослідження крові складається з:

- визначення кількості гемоглобіну,

- визначення кількості еритроцитів і

- лейкоцитів у 1 ММЗ крові,

- підрахунку лейкоцитарної формули,

- колірного показника, а також

- визначення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ).

Рідше приєднують підрахунок ретикулоцитів, тромбоцитів.

Для морфологічного дослідження достатньо тієї кількості крові, яке можна отримати з уколу в палець.

Техніка взяття крові

Дослідження крові слід завжди проводити в один той же час за однакових умов, до прийому їжі. Кров беруть з IV пальця лівої руки. Перед уколом палець дезінфікують і знежирюють, протираючи його ватою, змоченою спиртом, а потім

ефіром або їх сумішшю. Прокол виробляють або стерилізовані скарифікатори, або голкою Франка зі змінними стерилізується лезами. Укол звичайно виготовляється у верхівку м'якоті перший фаланги на глибину 2,5 - 3 мм. Отриману після уколу першим краплю знімають фільтрувальної папером або ватою, змоченою ефіром. Кров для дослідження беруть в певному порядку: для

визначення ШОЕ, гемоглобіну, потім - для підрахунку лейкоцитів і еритроцитів; роблять мазки. Після взяття крові, м'якоть пальця обертається змоченою ефіром або спиртом ватою і притискається до долоні для того, щоб зупинити кровотечу.

Визначення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ)

Обладнання та реактиви:

1. Апарат Панченкова.

2. Капіляри Панченкова.

3. 5% розчин лімоннокіслого натрію (свіжоприготований).

4. Годинний скло.

5. Голка Франка або Скарифікатор.

6. Вата.

7. Спирт.

Апарат Панченкова складається з штатива з капілярами (12 шт.) шириною 1 мм, на стінці яких нанесені поділки від 0 (зверху) до 100 (знизу). На рівні 0 є буква К (кров), а на середині піпетки, біля позначки 50 - буква Р (реактив).

Хід дослідження:

У капіляр Панченкова набирають 5% розчин лімоннокіслого натрію до позначки 50 (літера Р) і видувають на годинне скло. З уколу пальця, тримаючи капіляр горизонтально, набирають кров до мітки 0 (Буква К). Потім видувають кров на годинне скло з лімоннокіслим натрієм, після чого вдруге набирають кров до мітки 0 і випускають додатково до першої порції.

Отже, на годинному скельце є співвідношення цитрату і крові, рівне 1:4, тобто чотири обсягу крові в один обсяг реактиву. Перемішують кров кінцем капіляра, набирають її до позначки 0 і ставлять в апарат Панченкова строго вертикально. Через час відзначають число міліметрів стовпчика плазми.

Оцінка отриманих даних:

У нормі ШОЕ дорівнює для чоловіків 4-10 мм, для жінок 4-15 мм за годину.

Визначення вмісту гемоглобіну

Обладнання та реактиви:

1. Гемометр Салі.

2. Піпетка від гемометра Салі.

3. 0,1 N HCI.

4. Дистильована вода.

5. Піпетка.

6. Скляна паличка.

7. Голка Франка або Скарифікатор.

Для кількісного визначення гемоглобіну користуються зазвичай колориметричні способом. Принцип визначення полягає в перетворенні гемоглобіну крові в солянокислий гематін і порівнянні кольору отриманого з наявним в приладі стандартом. Приладом для визначення служить гемометр Салі. Він складається з двох запаяних пробірок зі стандартною кольоровий рідиною 1% розчин солянокислим гематіна в гліцерині), що містить 16,67 г% гемоглобіну (16,67 г на 100 мл крові). Між ними розташована Градуйована пробірка, що має дві шкали. Одна - з поділками від 0 до 23 служить для визначення гемоглобіну в грамах на 100 мл крові, тобто в грам відсотках; інша шкала з поділками від 0 до 140 показує одиниці гемоглобіну (відсоток гемоглобіну).

Хід дослідження:

В градуйованою пробірку, що знаходиться в середньому прорізі, наливають до початку шкали 0,1 N розчин соляної кислоти. Потім з місця уколу на м'якоті пальця піпеткою Салі набирають кров до позначки 0,02 мл (20 мм 3), насасивая її ротом через надіти на верхній кінець піпетки гумову трубочку зі скляним мундштуком. Кінчик піпетки обтирають від крові і опускають в пробірку з соляною кислотою, обережно видуваючи вміст, щоб не утворилися пухирці повітря. Б'ючи пальцем по нижній частині пробірки, ретельно розмішують кров і залишають її на 5 хв. для утворення солянокислим гематіна. За цей час набирають кров для решті частини аналізу. Після закінчення цього часу доливають в пробірку з краплях дистильовану воду, розмішують скляною паличкою до тих пір, поки колір розчину досліджуваної крові повністю зрівняється з кольором стандартної рідини. Відзначають, на якому розподілі знаходиться в градуйованою пробірці нижній меніск розчину крові, що показує вміст гемоглобіну в м% або одиницях (відсотках).

Оцінка отриманих даних:

У нормі вміст гемоглобіну в грам-відсотках у чоловіків коливається від 13,3 до 18 г%, у жінок - від 11,7 до 15,8 г% (в середньому 13,7); в одиницях (відсотках) у чоловіків - Від 80 до 108 од., У жінок - від 70 до 95 од.

Визначення кількості еритроцитів і лейкоцитів

Обладнання та реактиви:

1. змішувачі (меланжери) або пробірки для підрахунку еритроцитів і лейкоцитів.

2. 3% - розчин NaCl (для розведення еритроцитів) або рідина Гайема.

3. 3% розчин оцтової кислоти.

Рахункова камера.

Змішувачі являють собою капілярну піпетку з розширенням-ампулою, яка містить намистинку, що сприяє змішання крові з розводящий рідиною. Змішувачі, призначені для підрахунку еритроцитів, мають капілярів тоншого калібру і більше об'ємистій ампулою на них нанесені мітки одна - 0,5 інша - перед входом в ампулу - 1.0, третій - біля виходу з ампули - 101.

При набору крові до позначки 0,5 вона виявиться розведеною в 200 разів, при набору до 1,0 - у 100 разів. Для розведення еритроцитів застосовують 3% розчин кухонної солі або рідина Гайема, в якій краще зберігається форма еритроцитів. Смеситель для лейкоцитів має більш широкий просвіт капіляра і меншу за величиною ампулу. Нанесені три мітки: 0,5, 1,0 і 11. Це дозволяє розвести кров у 10, або в 20 раз (найчастіше розводять у 20 раз). Для розведення лейкоцитів використовують 3 - 50% розчин оцтової кислоти. Оцтова кислота розчиняє еритроцити, що дозволяє вести підрахунок тільки лейкоцитів.

Рахункова камера.

Для підрахунку формених елементів найбільш часто застосовується камера типу Бюркера з вигравіруваним на ній сіткою Горяєва. Рахункова камера складається з товстого предметного скла з особливим поглибленням. На дні поглиблення лічильної камери вигравіруваний сітка, у клітинах якої і підраховуються формені елементи. По краях поглиблення є підвищення, куди накладається покривне скло. Між нижньою поверхнею цього скла і дном поглиблення утворюється замкнуте простір, який і являє собою камеру лічильну. Глибина камери відповідає 0,1 мм. Рахункова камера типу Бюркера розділена навпіл глибокою канавкою і має на кожній половині сітку Горяєва, що дозволяє відразу вважати 2 краплі, не заповнюючи знову камери. Сітка Горяєва має 225 великих квадратів (15х15), 25 з яких розділені на малі, по 16 у кожному; є також порожні квадрати, зібрані в групи по 4 квадрата. Всього в сітці 100 великих порожніх квадратів, зібраних в 25 груп (5X5). Кожна сторона маленького квадратика дорівнює 1/20 мм, а так як висота камери становить 0,10 мм, то обсяг дорівнює 1/4000 ММЗ.

Хід дослідження:

Для підрахунку еритроцитів беруть змішувач для еритроцитів, надягають гумову трубочку, легким насасиваніем набирають кров з уколу до позначки 0,5. Надлишок крові видаляють фільтрувальної папером, після чого кінчик змішувача занурюють у приготований заздалегідь флакон з 3% розчином кухонної солі або розчином Гайема і Насмоктувати розчин, заповнюючи всю ампулу до позначки 101. Негайно знімають гумову трубку, затискають змішувач по довжині між великим і вказівним або середнім пальцем і струшують протягом 3 хвилин. Після цього заповнюють лічильну камеру, зливають

1-2 краплі і випускають наступну краплю на сітку.

Для підрахунку лейкоцитів кров з місця уколу набирають до позначки 0,5, потім розводять 3% розчином оцтової кислоти до позначки 11. Енергійно струшують протягом 3 хвилин, після чого зливають

1-2 краплі і заповнюють лічильну камеру. При роботі з пробірками для підрахунку еритроцитів, наливають 4 мл 3% розчину кухонної солі або рідини Гайема і в неї випускають 0,02 мл. крові, відведені піпеткою від гемометра Салі. Для підрахунку білих кров'яних елементів в пробірку наливають 0,4 мл 3 - 5% розчину оцтової кислоти і 0,02 мл крові. Енергійно струшують пробірки, потім в рідину опускають піпетку з гемометра Салі і, набравши вміст, заповнюють лічильну камеру.

Заповнення лічильних камер:

Добре вимите і витерті шліфоване покривне скло накладають на виступаючі бічні краю. М'якоттю великих пальців покривне скло притирають, рухаючи вгору і вниз, весь час щільно притискаючи, поки не з'являться, так звані, Ньютонови кільця. Перед заповненням камери знову енергійно струшують змішувачі. випускають 2 краплі на фільтрувальний папір, а третій заповнюють щілину між камерою і покривним склом. Рідина по капілярності засмоктується між ними і заповнює простір над сіткою. Рідина при заповненні камери не повинна затікати в жолобки, якщо це стукає, то її видаляють фільтрувальної папером.

Підрахунок еритроцитів. Підрахунок виробляють через 1-2 хвилини (коли еритроцити осядуть на дно камери), користуючись об'єктивом 40Х і окуляром 7X, або об'єктивом 8Х і окуляром 15Х.

Щоб не збитися з рахунку, дотримуються певній послідовності рахунку: пересуваючи з квадрата в квадрат з горизонталі один ряд зліва направо, наступний - справа наліво. Вважають, крім що знаходяться всередині квадрата, всі еритроцити, що лежать на двох лініях, наприклад, на лівій і верхній, і пропускають все що лежать праворуч і знизу. Вважати еритроцити треба в 5 великих квадратах, тобто в 80 маленьких.

Щоб уникнути неточності, внаслідок не цілком рівномірного розподілу крові в камері, вибирають для підрахунку не 5 сусідніх квадратів, а просуваються по всій сітці.

Кількість еритроцитів в 1 ММЗ (шукане) обчислюють таким чином: одиницею рахунку завжди, при кожній підрахунку, в будь-якій сітці служить малий квадрат. Обсяг його, як було зазначено, дорівнює 1/4000 мм 3. Злічивши еритроцити в 5 великих квадратах (80 малих квадратів), ділять цю кількість на 80 і множать на 200 (ступінь розведення крові) та на 4000 (щоб отримати кількість клітин у всьому кубічному міліметрі); практично, отже, отримане число множать на 10000 (додають чотири нулі).

Приклад: У 80 маленьких квадратах підраховано 480 еритроцитів. Отже, кількість еритроцитів в 1 ММЗ крові одно: 480 * 4000 * 200

------------ = 4 800 000 80

Підрахунок лейкоцитів. Для отримання достатньо точного результату при підрахунку лейкоцитів необхідно порахувати не менше 100 великих квадратів (= 1600 малих). Кількість лейкоцитів в 1 мм 3 отримують у такий чином: число, перелічене в3100 великих квадратах, ділять на 1600 (призводять до 1 малому квадрату) і множать на 20 (ступінь розведення) і на 4000; практично, скорочуючи постійні цифри формули, кількість перелічені лейкоцитів (при розведенні в 20 разів) множать на 50.

Приклад: у 100 великих квадратах злічило 120 лейкоцитів.

Отже, кількість лейкоцитів в 1 ММЗ одно

120 * 4000 * 20

-----------= 6000

1600

Оцінка отриманих даних:

Нормальне кількість еритроцитів в 1 ММЗ від 4500000 до 5000000. У нормі середнє кількість лейкоцитів в 1 мм 3 від 5000 до 9000 (крайні межі 4000 - 9000).

Обчислення колірного показника:

Знаючи число еритроцитів у крові і вміст у ній гемоглобіну, можна вирахувати якою мірою насичений кожен еритроцит. Колірний показник відповідає максимальному вмісту гемоглобіну в одному нормальному еритроциті, величина його умовно приймається за одиницю.

Для обчислення колірного показника користуються такою формулою:

знайдене кількість Нв знайдене число еритроцит.

------------------------: -------------------------

нормальна кількість Нв нормальне число еритроцит.

Практично визначення колірного показника виробляють шляхом ділення відсотка (одиниць) гемоглобіну на подвоєні два перші цифри числа еритроцитів. Якщо ж кількість еритроцитів менше 1000000, то відсоток Нв ділиться на подвоєну першу цифру числа еритроцитів.

Приготування мазків:

Мазок крові роблять зазвичай слідом за наповненням обох змішувачів. Витирають палець і користуються свежевиступівшей краплею крові. Кров беруть на предметне скло, яке має бути ретельно знежирена. Потім шліфованим предметним склом, або товстим покривним склом, що ставлять на перше предметне скло під кутом 45 'в безпосередній близькості від краплі крові, щоб вона розтікалася тонким шаром по ширині шліфованого скла, роблять на ньому мазок. Добре зроблений мазок жовтуватого кольору, просвічує. Слідом за цим мазок фіксують.

Фіксація мазка робиться для того, щоб ущільнити протоплазму формених елементів крові та зробити мазок більш стійким. Висохлий на повітрі мазок занурюється для фіксації в банку з метиловим спиртом на 1 - 3 хв., або в суміш Нікіфорова, що складається з рівних частин етилового спирту та ефіру, на 10-20 хвилин. За закінчення фіксації мазки виймають пінцетом і ставлять у вертикальному положенні на фільтрувальний папір для висушування.

Фарбування мазка здійснюється, як правило, за допомогою суміші декількох фарб. Найбільш широко застосовується фарбування мазка за Романовським - Гимзе. Перед вживанням фарбу розводять дистильованою водою з розрахунку 1 - 2 краплі на 1 мл води. Мазки укладають на містки з скляних паличок, що спираються на краю кювети, і заливають барвником у максимальній кількості, яка може втриматися на склі. Тривалість забарвлення 30 хвилин. Після фарбування барвник змивають струменем води, а мазки ставлять вертикально на фільтрувальний папір для просушування.

Забарвлення ретикулоцитів:

1. Предметні скла (знежирені).

2. 1% розчин брілліанткрезілблау (спиртової).

3. Шліфувальне предметне скло.

4. Чашка Петрі.

5. Фільтрувальна папір.

6. Скляна паличка.

7. Иммерсионное масло.

Методика фарбування:

На знежирене абсолютно чисте предметне скло наносять скляною паличкою краплю 1% алкогольного розчину фарби брілліанткрезілблау. Шліфувальні предметним склом цю краплю розмазують так само, як при готуванні звичайного мазка крові. Після підсихання барвника на нього наносять краплю крові і роблять тонкий мазок, який відразу поміщають у вологу камеру (чашка Петрі з вкладеним в неї шматочком мокрій фільтрувального паперу). Через 3-5 хвилин мазок виймають, висушують на повітрі і досліджують під мікроскопом з іммерсіей.

Під мікроскопом еритроцити при цій забарвленням жовтувато-зеленуватого кольору, в окремих же еритроцитах помічається синя сіточка, іноді мізерна і ніжна, іноді рясна, зерниста - це і є ретикулоцити.

Підрахунок ретикулоцитів проводиться так:

підраховують в полі зору 1000 еритроцитів і відзначають скільки серед них ретикулоцитів. Знайдене кількість ділять на 10. Нормальний вміст ретикулоцитів в крові 0,2 - 1,0%.

Підрахунок лейкоцитарної формули:

лейкоцитарної формулою називають процентне співвідношення окремих форм лейкоцитів крові. Для більш точного її обчислення необхідно переглянути не менш 200 лейкоцитів. Так як різні види лейкоцитів розподіляються по мазку нерівномірно, необхідно дотримуватися таких правил: проводити підрахунок по верхньому і нижньому краю мазка, пересуваючи мазок по зигзагоподібної лінії. Вважають три поля по самому краю в горизонтальному напрямку, потім - три поля, прямуючи до середини мазка, і т. і. Отже, у кожному з чотирьох ділянок налічують 50 клітин, а всього - 200. Для підрахунку лейкоцитарної формули використовують спеціальний клавішний лічильник, на кожному клавіші якого відзначається початкова 6yква назви лейкоцитів. Результати підрахунку лейкоцитарної формули записуються в вигляді лейкограми, яка має в нормі приблизно такий вигляд:           

нейтрофіли                

Кiльк. Лейкоцитів         

базо-філи         

еозином-філи   

юні         

палички-ядерні         

сегменті-ядерні         

лімфо-ціти         

моно-ціти             

8000         

1%         

4%         

0         

4%         

60%         

25%         

6%       

Мікроскопічна картина крові:

Еритроцити - Без'ядерна клітка, фарбуються кислими фарбами в рожевий колір і має форму кілька сплощене кола з вдавлення в центрі. Діаметр в середньому близько 8 мікрон.

Лейкоцити розрізняються серед еритроцитів за їх більшою величиною, за наявністю ядра і за характером забарвлення. Розрізняють лейкоцити: базофільні, еозинофільні, нейтрофільні, лімфоцити і моноцити.

Перші три види об'єднуються в групу гранулоцитів, тобто клітин в протоплазмі яких є зернистість.

базофіли - клітини розміром 12 - l4 мікрон, з ядром невизначеної форми. Протоплазма містить численні великі зерна, фарбуються в фіолетовий колір. Кількість клітин не перевищує 0,5-1%.

Еозинофіли - клітини розміром 12 - 15 ", мають сегментоване ядро у вигляді двох грушовидних сегментів, з'єднаних між собою тонким містком. Найбільш характерною ознакою еозінофіла є зернистість протоплазми яскраво-червоного кольору. Кількість еозинофілів в нормі від 1 до 4%.

Нейтрофіли - круглі клітини, середня величина 9 - 12 мікрон.

Протоплазма рожевуватим з дрібною зернистістю червонувато-

фіолетового кольору. Ядро складається з 2-х, 4-х і більше сегментів, з'єднаних між собою тоненькими містками, фарбується основними фарбами в синьо-фіолетовий колір. Сегментоядерние нейтрофіли становлять від 50 до 68%. У менш зрілих клітинах ядро витягнуто у вигляді палички, так звані палички-ядерні нейтрофіли 1-4%. Ще рідше, близько 1%, зустрічаються нейтрофіли з круглим ядром - юні форми. Збільшення числа палички-ядерних, поява юних, аж до миелоцитов, носить назву зсуву вліво, або регенеративного зсуву. зрушенням в право називається зміна формули лейкоцитів у бік збільшення більш зрілих клітин.

Лімфоцити - клітини розміром 7 - 9 мікрон. Лімфоцити бувають малі, середні та шірокопротоплазменние. Ядро кругле або овальне, синьо-фіолетового кольору; іноді воно має з одного боку гостре поглиблення. Протоплазма блакитна, нерідко розрізняються яскраво-червоні зерна. Навколо ядра залишається безбарвний або більш блідий обідок. У нормі лімфоцити складають 25 -- 38%.

Моноцити - найбільша клітина нормальної периферичної крові. Діаметр 12-20 мікрон з великим овальним ядром, ниркоподібним або підковоподібної форми. Забарвлення ядра світліше, ніж у нейтрофілів і лімфоцитів, протоплазма сіро-блакитного кольору з дрібної азурофільной зернистістю. Моноцити складають 6-8% всіх лейкоцитів крові.

Визначення тривалості кровотечі з Дуке

0борудованіе і реактиви:

1. Голка Франка або Скарифікатор.

2. Фільтрувальний папір.

3. Секундомір.

Хід дослідження:

голкою Франка роблять укол глибиною 3 мм в м'якоть пальця або мочку вуха. Мимовільно що виступає кров знімається кожні 15-30 секунд фільтрувальної папером. Через 1-3 хвилини знята фільтрувальної папером крапля стає маленькою, потім папір зовсім не фарбується. Проміжок часу від моменту появи першої краплі крові до припинення фарбування фільтрувального паперу позначається як тривалість кровотечі.

Оцінка отриманих даних:

Нормальна тривалість кровотечі 2 -- 4 хвилини.

Визначення часу згортання крові за способом Бюркера

Обладнання та реактиви:

1. Годинний скло.

2. Чашка Петрі з вологою фільтрувальної папером на дні.

3. Тонка скляна паличка або голка.

4. Голка Франка або Скарифікатор.

5. Дистильована вода.

6. Секундомір

Хід дослідження:

На годинне скло наносять одну краплю прокип'яченої дистильованої води. Голкою Франка роблять укол у м'якоть пальця, першу краплю знімають, а другий наносять на годинне скло, помішують тонкої скляною паличкою. Час взяття крові відзначають за секундоміром. Годинний скло поміщають в чашку Петрі. Найкраще проводити дослідження при температурі 25'C. Кожні півхвилини тонкою скляною паличкою або голкою торкаються до краплі крові від центру до периферії до тих пір, поки за паличкою не потягнуться першим ниточки фібрину, після чого зазначають час появи їх.

Оцінка отриманих даних:

У здорових людей час згортання за методу Бюркера одно 5-6 хвилин.

Список літератури

Для підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://study.online.ks.ua/