Культивування вірусів

ВСТУП

Для кількісного накопичення вірусів найбільш зручну систему представляють культури клітин. Перші спроби культивування клітин тварин поза організмом відносяться до кінця минулого століття. Ці уривчасті спостереження вказували на можливість збереження життєздатності тканин і клітин у штучних умовах і поклали початок глибоким науковим дослідженням тканинних культур.

Велика заслуга у справі paзработкі методів культивування тканин належить Каррель Він вперше довів можливість розмноження клітин тварин у штучних умовах і тим самим продемонстрував їх «безсмертних» і схожість з одноклітинними вільноживучим організмами. Значних успіхів у цьому напрямку досягла група дослідників під керівництвом Ерла. Вони перші отримали зростання великого числа клітин на склі і в рідкій перемішуємо суспензії. Поява антибіотиків і успіхи у створенні штучних живильних середовищ відкрили нову еру в розвитку методів тканинних культур.

Тканинні культури давно знайшли застосування для вирішення різних питань біології і медицини. Однак лише успіхи в області вірусології, досягнуті за допомогою тканинних культур, стали потужним стимулом їхнього розвитку до сучасного рівня.

Культивування вірусів допомагає вирішити низку теоретично проблем, пов'язаних з вивченням особливостей взаємодії "вірус-клітина". Крім того вирішення цілої ряду прикладних задач, пов'язаних з діагностикою та виробництвом препаратів для профілактики вірусних інфекцій неможливо без накопичення віруссодержащего сировини.

ВИДИ культурі клітин.

Перенесення клітин цілісного організму до умов життя in vitro припиняє існування їх як одного з численних структурних елементів тканини або органу, до складу яких вони раніше входили. При цьому клітини виходять з-під контролю нейро-гуморальних факторів і набувають ряд особливостей, які залежать як від самого факту відторгнення клітин від цих тканин, так і від конкретних умов їх існування in vitro.

живуть поза організму клітини або тканини характеризуються цілим комплексом метаболічних, морфологічних і генетичних рис, різко відмінних від властивостей клітин органів і тканин in vivo.

Залежно від методики первинної експлантаціі тканини і техніки її культивування розрізняють кілька видів переживають і зростаючих культур тканин і клітин. Найбільше поширення мають одношарові, а також суспензійні культури зростаючих клітин. Саме вони складають основу сучасної лабораторної та вірусологічної виробничої практики.

Розрізняють два основні види одношарових клітинних культур: первинні і перевіваемие.

Терміном «Первинна» позначають клітинну культуру, отриману безпосередньо з тканин людини або тварини в ембріональному або постнатальному періоді. Термін життя таких культур обмежений. По закінченні певного часу в них виникають явища неспецифічної дегенерації, що виражається в грануляції і вакуолізація цитоплазми, округлення клітин, втраті зв'язку між клітинами і твердим субстратом, на якому вони вирощувалися. Періодична зміна середовища, зміна складу останньої і інші процедури можуть лише дещо збільшити терміни життя первинної клітинної культури, але не можуть запобігти її кінцевої деструкції і загибелі. Ймовірно, цей процес пов'язаний з природним згасанням метаболічної активності клітин, виведених з-під контролю нейро-гуморальних факторів, що діють в цілісному організмі.

Лише окремі клітини або групи клітин популяції на тлі дегенерації більшої частини клітинного пласта можуть зберегти здатність до зростання і розмноження. Ці клітини, виявивши потенцію нескінченного розмноження in vitro, при багаторазових перевівках дають початок перевіваемим культурах клітин.

Розрізняють лінії і штами перевіваемих клітин. Першим терміном позначають перевіваемие клітини, характеризуються потенційним безсмертям і, як правило, гетероплоідним каріотипу другим терміном - полуперевіваемие клітини з диплоїдні набором хромосом і обмеженою тривалістю життя in vitro. Поява і тих, і інших клітин пов'язано з процесом відбору в клітинної популяції первинних культур, що є, таким чином, джерелом всіх ліній і штамів перевіваемих клітин.

Основне перевага ліній перевіваемих клітин, в порівнянні з будь-якої первинної культурою, полягає в потенції необмеженого розмноження поза організмом і відносній автономності зближує їх з бактеріями і одноклітинними найпростішими.

Здатність перевіваемих клітин до нескінченного розмноження in vitro знаменує собою якісний стрибок, в результаті якого клітини набувають здатності до автономного існування, подібно до мікроорганізмів, що вирощуються на штучних поживних середовищах. Сукупність змін, що приводять до появи у клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини перевіваемих тканинних культур -- трансформованими.

Удосконалення техніки культивування клітин значно розширило можливості отримання перевіваемих клітинних ліній з найрізноманітніших тканин тварин і людини. При цьому не було виявлено вікова межа, вище якої тканини втрачали б здатність до адаптації до необмеженого росту in vitro, тобто до трансформації.

Іншим джерелом перевіваемих клітинних ліній є злоякісні новоутворення. У цьому випадку трансформація клітин відбувається in vivo в результаті розвитку патологічного процесу, етіологія якого багато в чому залишається ще невідомою.

Не всі злоякісні новоутворення здатні давати початок перевіваемим клітинним культурам. Так, наприклад, безуспішними були спроби отримати перевіваемие клітини з ракових пухлин шлунку і молочних залоз людини. З трудом вдається адаптувати до життя in vitro клітини плоскоклітинного раку шкіри і слизових оболонок. З іншого боку, порівняно легко виводяться лінії з тканин сарком і злоякісних пухлин нервової системи.

Особливу категорію клітинних культур складають полуперевіваемие штами, що мають диплоїдний набір хромосом. Вони вигідно поєднують в собі риси первинних і перевіваемих клітин.

ЖИВИЛЬНІ СЕРЕДОВИЩА.

У будь-якій клітинної культурі розрізняють клітинну і рідку фази. Рідка фаза забезпечує життєдіяльність клітин культури і являє собою живильні середовища різного складу і властивостей.

Все середовища по своїм призначенням поділяються на ростові і підтримують. У складі ростових середовищ повинно міститися більше поживних речовин, щоб забезпечити активну розмноження клітин для формування монослоя на поверхні скла або досить високу концентрацію клітинних елементів в суспензії (при отриманні суспензійний культур). Підтримка середовища фактично повинні забезпечувати лише переживання клітин у вже сформованому монослое при розмноженні в клітинах вірусних агентів.

Ростові і підтримують середовища багатокомпонентних. До їх складу можуть входити як природні продукти (амніотичних рідини, сироватки тварин), так і субстрати, отримані в результаті часткової обробки природних продуктів (ембріональні екстракти, гідролізат лактальбуміну, гемогідролізат, амінопептід і т. д.), а також синтетичні хімічно чисті речовини (амінокислоти, вітаміни, солі).

Як приклад живильного середовища, повністю складається з природних компонентів, можна назвати середу Баклі, запропоновану для вирощування клітинних культур з ниркового епітелію мавп. У цю середу входить коров'яча амніотіче-ська рідина (85%), кінська сироватка (10%) і коров'ячий ембріональний екстракт (5 %).

Всі природні продукти малостандартни, їх використання пов'язане з великою небезпекою мікробної та вірусної контамінації клітинних культур. У зв'язку з цим і відбувається поступове витіснення їх синтетичними стандартними сумішами. Найбільше застосування знаходять синтетична середу 199 і середу Голка. Широко використовуються середовища, що містять певні кількості солей, амінокислот і вітамінів.

Незалежно від призначення всі поживні середовища для тканинних культур конструюються на основі будь-якого збалансованого сольового розчину з достатньою буферної ємністю. Найчастіше ними є розчини Хенкса і Ерла. Ці розчини - обов'язковий компонент будь-якої живильного середовища. Невід'ємним компонентом більшості ростових середовищ є сироватка тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин і формування монослоя не відбувається.

Включення сироватки в той же час перешкоджає створенню ростових середовищ точного хімічного складу, дуже важливих для розвитку фундаментальних досліджень з клітинної фізіології, тому що разом з сироваткою (або її дериватами) вводиться цілий комплекс неконтрольованих факторів, які варіюють в залежності від серії сироватки.

У 50-і роки Ewans і Waymouth були запропоновані бессивороточние середовища точного хімічного складу. Однак ці середовища не забезпечували тих показників проліферативної активності клітин, які обумовлюють середовища з додаванням сироваток. У зв'язку з цим становить інтерес робота Birch і Pirt, що показали, що для забезпечення інтенсивного росту клітин в бессивороточних середовищах визначальним є включення сірчанокислих солей Fe, Zn, Cu, а також МnС12.

У ростові живильні середовища, а так само в буферний розчин для промивання тканин додають антибіотики. Їх вводять в середу безпосередньо перед вживанням з розрахунку 1 мл основного розчину антибіотиків на 500 мл середовища.

Нижче наведено склад і метод приготування однієї з поширених поживних середовищ.

середу Голка

л-аргініну -- 17,4

л-цистину - 4,8

л-гістидину - 3,1

л-Ізолейцин -- 26,2

л-лейцііа - 13,1

л-лізину - 14,6

л-метіоніну -- 7,5

л-фенілаланіну - 8,3

л-треоніну -- 11,9

л-тріптафана -- 2,0

л-тирозину -- 18,1

л-валін - 11,7

біотину - 0,24

холіну - 0,12

холін-хлориду -- 0,14

вітаміну В12 (птероілглютаміновой кислоти) - 0,44

нікотинаміду - 0,12

пантотенової кислоти - 0,22

пантотенату кальцію - 0,48

піридоксаля (піридоксин хлоргідрата) - 0,20

тіамін-хлоргідрата - 0,34

рибофлавіну -- 0,04

хлористого натрію - 5850,0

хлористого калію - 373,0

фосфату натрію однозаміщений (NaH2PO4. Н2О) - 138,0

кальцію хлористого - 111,0

двовуглекислого натрію (NaHCO3) - 1680,0

магнію хлористого (MgCl2 . 6Н2О) - 102,0

глюкози - 900,0

л-глютаміна -- 146,2-292,3

пеніциліну -- 50,0

стрептоміцину -- 50,0

фенолу червоного - 5,0

води до 1000,0

Приготування.

Розчин 1. У 500 мл води, нагрітої приблизно до 80 °, помішуючи, розчиняють зазначені вище кількості амінокислот, після чого додають л-глютамін та фенол-червоний.

Розчин 2. У 100,0 мл води розчиняють неорганічні солі, за винятком двовуглекислого натрію (NaHCO3), змішують з попереднім розчином неорганічних солей і додають біотин і вітамін B12.

Розчин 3. У 200,0 мл води розчиняють всі вітаміни, окрім біотину і птеро-ілглютаміновой кислоти, і антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин. Всі розчини стерилізують фільтр через скляний фільтр-нутч (пориста скляна пластина, величина пір 0,7-1,5) або через асбестоцеллюлозние пластини Зейтца після попереднього промивання водою, а потім - приготованим розчином.

500 мл розчину 1 + 200 мл розчину 2 + 200 мл розчину 3 змішують і доводять стерильною водою до 1000,0 мл. Можна додати 1 мг інозиту на 1 л.

ОТРИМАННЯ Клітинні КУЛЬТУР. ПРИГОТУВАННЯ Первинних клітинних культур.

Первинною -- називається культура, отримана з тканини і вирощувана in vitro до початку субкультівірованія, тобто до першого посіву. Первинна культура позбавлена багатьох клітин, присутніх у вихідної тканини, оскільки не всі клітини здатні прикріплятися до субстрату і вижити in vitro. У процесі культивування клітин відбувається відносне збіднення культури неделящіміся або повільно які діляться клітинами.

На першому етапі отримання первинної культури проводять стерильне видалення фрагмента тканини, органу тваринного і його механічну або ферментативну дезагрегацію. Тканина подрібнюється до шматочків обсягом до 1 - 3 мм, шматочки тканини відмиваються від еритроцитів розчином Хенкса з антибіотиками. Для дезагрегація тканини використовують трипсин (0,25% неочищений або 0,01 - 0,05% очищений) або колагенази (200 -- 2000 од/мл, неочищена) та інші протеолітичні ферменти. Такий спосіб отримання культури забезпечує високий вихід клітин.

Первинні культури можуть бути також отримані від шматочків тканини, об'ємом 1 мм, які прикріплюються до поверхні субстрату завдяки власній адгезивність або наявності насічок на чашці, або за допомогою згустку плазми. У цих випадках буде відбуватися ріст клітин з фрагментів. Клітини, мігруючі з експлантатов можуть використовуватися для пасирування. Фрагменти тканини (експлантати) переносяться на нові чашки, мігруючі клітини можуть видалятися пересівань, сумішшю версії і трипсину, а залишаються експлантати будуть утворювати нові вирости.

Відомі такі первинні культури, як культура фібробластів курячого ембріона, культура клітин нирки теляти, лейкоцити.

ОТРИМАННЯ МОНОСЛОЙНИХ ПЕРЕВІВАЕМИХ культурі клітин.

Як вже зазначалося вище, одним з методів отримання перевіваемих клітинних ліній є відбір клітин з підвищеною активністю росту і розмноження з популяції первинних культур. Відбір можна здійснити при регулярній зміні середовища, омиваючої монослой первинно тріпсінізірованной клітинної культури. Для цього відбирають матраци з добре сформованим клітинним монослоем (самі матраци повинні мати рівне дно і не повинні мати на стінках подряпин і матових плям). Приготовлену для систематичної зміни ростові середу розливають по невеликих судинах (щоб виключити бактеріальне забруднення) і зберігають при t - 4 °.

Зміну середовища проводять регулярно, не рідше 1 разу на тиждень. Протягом перших 3 тижнів замінюють по 20 - 30% обсягу ростової середовища, протягом наступних 3 - 4 тижнів -- 50 - 60%, пізніше проводять повну зміну середовища. Свіжу середу безпосередньо перед роботою підігрівають до t - 37 °.

У міру зміни середовищ клітини змінюють свою морфологію. Частина клітин округлюється і відпадає від скла. Більшість клітин стягується до центру, і монослой набуває зірчастий вид. Самі клітини при цьому трохи збільшуються. Через 7 - 10 змін середовища в матрацах, як правило, починають з'являтися нові клітинні елементи, причому в різних культурах вони мають різну морфологію.

У культурі клітин нирки курячого ембріона в центрі монослоя або між стягнутими його ділянками з'являються округлені клітинні елементи, з яких поступово формуються скупчення у вигляді невеликих колоній. У культурі клітин нирки мавпи з'являються поодинокі освіти, що нагадують зерна. Клітини щільно прилягають один до одного, утворюючи дрібні прозорі колонії. Кількість таких клітин наростає повільно, розміри колоній також майже не збільшуються. Колонії з'являються не тільки на дні матрацу, але також на бічних поверхнях, на кордоні живильного середовища. Тому обов'язковою умовою при зміні живильної середовища є підтримка її постійного об'єму. У культурі клітин нирок ембріона людини на тлі масової дегенерації стягнути до тяжі монослоя виявляються великі полігональні клітини з довгими відростками.

що виникли в процесі відбору атипові клітинні елементи повинні бути відокремлені від інших ділянок монослоя і перенесені в окремі пробірки або матраци. Для цього може бути використаний метод версенізаціі чи механічний відкол атипових клітин за допомогою бактеріологічної петлі або шпателя. Останній спосіб особливо необхідний при роботі з культурою клітин нирок мавпи, де колонії атипових клітин щільно прикріплені до скла і самі від нього не відокремлюються.

При зміні живильного середовища у разі появи атипових клітин рекомендується обережно видалити більшу частину ростової середовища, а меншою частиною енергійно отполоскать монослой і це середовище розлити по пробірках. У цьому випадку в середовищі можуть виявитися атипові клітини, що володіють здатністю утворювати колонії, придатні для подальших пересівань.

Після перенесення культури атипових клітин у новий посуд спостереження за основною культурою доцільно продовжити, так доак процес виведення нової клітинної лінії вельми складний, і далеко не завжди відібрані атипові елементи дають початок життєздатної лінії перевіваемих клітин. Необхідно, щоб вся робота з отримання нових клітинних ліній, що триває протягом багатьох місяців, проводилася з одними і тими ж поживними середовищами, сироватками тварин і серіями антибіотиків.

Відомі такі первинні культури, як культура клітин нирки золотистого хом'ячка (BHK), культура клітин нирки сибірського гірського козерога (ПСГК), культура клітин нирки зеленої мавпи (CV).

роллерниє Культивування клітин

До недавнього часу тканинні культури застосовувалися у вірусології переважно у вигляді одношарових стаціонарних культур. У багатьох випадках цей метод вирощування клітин є незамінним. Багаторічний досвід показує, що при використанні одношарових стаціонарних культур зустрічається ряд труднощів, пов'язаних з величезними витратами робочого часу і матеріалів. З цієї точки зору, більш вигідні роллерниє культури, які економічні, характеризуються оптимальним відношенням корисної площі культивування до об'єму живильного середовища і відкривають сприятливі можливості для накопичення клітинної маси.

Термін «Роллерниє культури» позначає метод культивування, при якому клітинний монослой розташовується по всій циліндричної поверхні горизонтально обертаються судин і періодично омивається живильним середовищем. У силу певних причин деяка кількість клітин може в окремих випадках бути зважено в культуральной середовищі. У подібному варіанті культуру клітин називають роллерниє-суспензійного. "Врожайність" клітинної культури буде тим більше, чим більше площа, з якої збирають клітини. Дослідники використовували різні шляхи збільшення площі поверхні, на якій відбувалося прикріплення і розмноження клітин. Для цього застосовували різного характеру основи з великою питомою поверхнею: тверду, губчату, з вовни, колагену, на скляних спіралях і т. д. Широкого поширення ці методи не отримали, тому що значно ускладнювали маніпуляції з клітинами, але слід відзначити описану Л. С. Ратнером і В. А. Крикунов методику багатоярусного культивування. Клітини культивували в 1,5, 10 і 15-літрових бутлях, повністю завантажені овальними скляними трубками, розташованими паралельно поздовжній осі судин. Корисна площа при цьому зростала в порівнянні із стаціонарними одношаровими культурами в судинах того ж обсягу в 20 разів. Культивування проходило в 2 етапи. На першому етапі бутлі обертали навколо горизонтальної осі з метою рівномірного розподілу клітин. Надалі, коли клітини прикріплялися до скла, культивування тривало в стаціонарному положенні. Описана культуральна система була успішно використана для культивування вірусу ящуру.

Більше ефективним виявилося обертання судин, в яких відбувалося розмноження клітин. Спочатку клітини вирощували в пробірках, але з розвитком технічного оснащення зросли обсяги культуральних судин, і від вирощування клітин під обертаються пробірках дослідники перейшли до обертається бутлях. Роллерниє культури стали застосовуватися як для накопичення клітин, так і розмноження вірусів.

Для роллерниє культивування використовуються спеціальні стелажне-ярусні апарати для обертання бутлів або барабани. Найчастіше для культивування використовують 0,5-3-літрові бутлі. У виробничих умовах обсяг їх може досягати 20 літрів і більше. Апарати для роллерниє культивування прості, надійні і обслуговування їх нескладно. Велике значення має швидкість обертання бутлів. Вона не повинна бути дуже великою, щоб не перешкоджати прикріплення клітин, але і не дуже низькою, тому що тривале перебування клітин в газовій фазі погіршує умови їх живлення. У роботах різних авторів швидкості обертання бутлів варіювали від 8-12 об/годину, до 1 об/хв. Найбільш придатною для різних клітинних культур виявилася швидкість обертання флаконів в межах 0,5-1 об/хв. Рекомендується протягом перших 30 хв. після засіву клітин забезпечити високу швидкість обертання флаконів (0,5-1,0 об/хв) для рівномірного розподілу матеріалів, потім перевести їх на низьку швидкість обертання (20-30 об/год).

Посівна концентрація в 1 мл середовища складає для клітин СПЕВ, ВНК-21, HeLa, L - 60-80 тис., для диплоїдних клітин 100-200 тис., для первинних культур - 200-300 тис. Обсяг ростової середовища повинен становити 1/10, 1/20 частину обсягу роллерниє флакона. Роллерниє метод культивування дозволяє отримати більшу кількість клітин. Так, з флакона місткістю 3 л можна отримати врожай клітин HeLa в 8 разів, ВНК-21 - у 9 разів, АТ - у 11 разів більший, ніж з монослойной стаціонарної культурою флакона ємністю в 1 л. Кратність економії середовищ при використанні 3-літрових пляшок становить для клітин HeLa 2,8; ВНК-21 - 5,0, АТ - 4,0. Здатністю до зростання і розмноження в роллерниє умовах володіють субкультури, перевіваемие культури і рідше первинні, а також диплоїдні штами клітин. Для кращого розмноження клітин в роллерниє апаратах необхідна адаптація їх до нових умов культивування. Роллерниє метод культивування дозволяє отримати велику кількість клітин. Перевагою роллерниє культур в порівнянні з традиційними стаціонарними культурами є, зокрема, більш економічне використання поживних середовищ і більше високий вихід вірусного антигену (на 1-2 lg).

суспензійний культивування клітин

В 1953 році Оуенз зі співробітниками вперше показав здатність клітин розмножуватися в рідкій середовищі у вільно суспендованих стані. З тих пір метод суспензійного культивування привертає увагу дослідників у зв'язку з його високою ефективністю при накопиченні великої кількості клітин. Виявилося, що клітини перевіваемих ліній, на відміну від інших типів клітинних культур, можуть довгостроково культивуватися в підвішеному стані. Клітини в цих умовах розмножуються, не прикріплюючись культурального до стінок судини, перебуваючи в суспензійним стані, завдяки постійному перемішування середовища. При оптимальному режимі вирощування клітини в суспензіях швидко розмножуються, мають більш високий «врожай», ніж у стаціонарних культурах. Первинні та перевіваемие лінії клітин мають неоднакову здатність зростання в суспензії. Так, гетероплоідние і анеуплоїдних постійні лінії, на відміну від псевдодіплоідних ліній, швидше адаптуються до росту в суспензії.

суспензійні культури готують з одношарових культур. Клітини відшаровує від скла за допомогою розчинів версії і трипсину. Осад клітин після центрифугування (1000 об/хв.) ресуспендіруют у свіжій поживному середовищі. Приготовлену суспензію поміщають в культуральні судини (реактори, ферментера) і вирощують при постійному перемішуванні. У наукових дослідженнях концентрація клітин у вихідній суспензії коливається від 0,3 до 10х10 в 1 мл. Оптимальна концентрація клітин у вихідної суспензії повинна бути 2-5х10 в 1 мл. На думку Ерла і його співробітників, концентрація клітин в суспензованого культурі повинна бути такою, щоб фаза логарифмічного зростання наступала не пізніше 16-24 годин після приготування культури. Суспензійні клітинні культури проходять характерні стадії: лаг-фазу, фазу логарифмічного зростання, стаціонарну фазу та фазу логарифмічного відмирання. У першій стадії, як правило, кількість клітин зменшується, в другій стадії популяція клітин збільшується (логарифмічна стадія зростання), в третій стадії збільшення кількості клітин не спостерігається (стаціонарна фаза). Якщо культивування продовжити далі, то виявиться період зменшення чисельності клітин-фаза логарифмічного відмирання (фаза руйнування). Швидкість розмноження клітин в логарифмічній фазі росту висловлюють часом генерації. Під часом генерації мається на увазі період, необхідний для подвоєння популяції клітин в культурі. Для суспензійного вирощування клітин важливою умовою є перемішування рідини, яка повинна бути безперервним і досить інтенсивним, щоб підтримувати клітини в зваженому стані, перешкоджати їх осадження і прикріплення до стінок судини і в той Водночас не викликати їх механічного пошкодження.

Перемішування суспензійний культур проводять лопатевими магнітними мішалками, а також круговими гойдалками. В даний час широко застосовують обертання флаконів і бутлів навколо поздовжньої осі (15-40 об/хв). На магнітних мішалках швидкість обертання становить 100-200 об/хв. Швидкість перемішування залежить від обсягу культури; малі обсяги культури вимагають невисокою швидкості, тоді як її необхідно збільшити при великих обсягах. Для запобігання осідання клітин на внутрішньої поверхні судини виробляють сіліконірованіе. Силіконове покриття в силу своєї гідрофобності перешкоджає прикріплення клітин до стінки судини.

Внутрішні культурального стінки судини змочують 5% або 10%-им розчином силікону і після випаровування розчинника (бензолова, ацетоновій) судини витримують при 85 ° С і 200 ° (відповідно протягом 30 і 60 хв). Після охолодження судини наповнюють гарячої бідістіллірованной водою і залишають на 2 години, потім їх 3 рази обполіскують бідістіллірованной водою і висушують при 100 ° С. Судини стерилізують у сушильній шафі при 170 ° С протягом 2 годин.

Максимальний ріст клітин у суспензії спостерігають при рН 7,0-7,2. Поживні середовища, застосовувані для вирощування клітин в суспензії, не відрізняються від середовищ, використовуваних для вирощування клітинних ліній у одношарової культурі. Найчастіше при культивуванні клітин в суспензіях беруть середу Голка з дворазової концентрацією амінокислот і вітамінів.

суспензійні культури споживають в 2-7 разів більше глюкози, ніж монослойние. У процесі споживання глюкози клітини виділяють в середу токсичну для них молочну кислоту. Споживання клітинами глюкози і вироблення молочної кислоти йдуть паралельно і перебувають у прямій залежності від щільності клітинної популяції. Корисним виявилося додаток до живильному середовищі інсуліну в кількості від 40 до 200 ОД на 1 л. Збільшення до живильному середовищі інсуліну змінює співвідношення між кількістю поглиненої глюкози та виділеної молочної кислоти. Для клітин лінії L зазначений коефіцієнт може бути знижено з 74-81 до 37-38%.

Різні амінокислоти споживаються з живильного середовища зростаючими клітинами з неоднаковою швидкістю. Відзначено, що регулярне додавання аргініну (20-40 мг/л) і збільшення кількості глутаміну до 450 мг/л сприяють зростанню зважених культур.

Додаток інозитол (0,4 мг/л) дозволяє прискорити зростання культур амніотичних клітин людини. Бажаним є додавання до середовища каталази (1 мг/л) і тироксину (12 мг/л).

Великий інтерес представляють роботи, присвячені отриманню зважених культур клітин у синтетичної середовищі, що не містить сироватки крові. Робляться спроби збільшити в'язкість живильного середовища за рахунок безбілкових інгредієнтів. З цією метою використовується метил-целюлоза і гіалуронова кислота.

метилцелюлоза в концентрації 0,1-0,2% має максимальний захисною дією на зважені в середовищі клітини. Протективного дію метилцелюлоза полягає в тому, що молекули утворюють захисний шар навколо клітини, що запобігає пошкодження клітин в результаті перемішування середовища. Дуже важливим показником стану суспензійний культури є парціальний тиск кисню в рідкій фазі. Концентрація кисню в газовій фазі залежить від щільності клітинної популяції і нерідко буває нижче атмосферної. Нестача кисню веде до появи грануляції цитоплазми, клітини втрачають правильну округлу форму. При невеликому надлишку кисню клітини мають добре окреслену, правильну, округлу форму, і стають дуже великими при шкідлива дія надлишку кисню. Оптимальна концентрація кисню для різних клітинних культур знаходиться в межах від 9 до 17% або 293 мм рт. стовпа. При концентрації кисню вище 20% відбувається інгібіція клітинного росту. Так, при концентрації кисню 24% розмноження клітин нирок ембріона кролика (лінія ERK) знижувалася наполовину, а при 30% зводилося до нуля. Підвищення концентрації кисню токсично впливає на клітинний метаболізм.

Таким чином, розмноження клітин в суспензії залежить від концентрації клітин у вихідній суспензії, аерації і рН середовища, складу живильного середовища, способу перемішування, об'єму суспензії та інших факторів.

Однорідність суспензії, можливість тривалого підтримання клітин в логарифмічній фазі зростання, перспективи математичного моделювання процесів клітинного росту в залежно від впливу факторів зовнішнього середовища, зручність багаторазового дослідження фізіологічного стану культури клітин в суспензії, висока економічність методу-ось далеко не повний перелік переваг суспензійний культур.

суспензійні культури широко використовується в вірусологічних дослідженнях і для накопичення великих кількостей віруссодержащего матеріалу, при виготовленні вакцин і діагностичних препаратів.

культивування клітин на мікроносіях.

У 1967 р. Van Werel запропонував метод культивування, поєднує елементи монослойного та суспензійного вирощування клітин, який він назвав методом «мікроносіях». Суть його полягає в тому, що клітини прикріплюються і розмножуються на поверхні полімерних кульок-частинок «Мікроносіях» (МН), які містяться в суспензії за допомогою щоперемішує пристрої, наприклад мішалки. На одній частці МН діаметром 160-230 мм може поміститися 350-630 (або в середньому 460) клітин. В одному мл середовища можна суспензованого кілька тисяч часток мікроносіях, при цьому загальна площа їх складе від кількох до 50 см2/мл.

інокульована в культиватор клітини прикріплюються до поверхні частинок МН і розмножуючись, утворюють суцільний монослой на кожній окремій частці.

Основними перевагами цього методу є:

1) створення рівномірних умов по всьому об'єму посудини, що робить можливим ефективно контролювати необхідні параметри (рН, р02 та ін); 2) отримання високої щільності клітинної популяції до 5-6 млн. клітин в 1 мл; 3) культивування одночасно кілька сотень мільярдів клітин; 4) запровадження постійного контролю за динамікою росту клітин; 5) зниження зростання контамінації у зв'язку зі скороченням операцій, пов'язаних з розгерметизацією культураль-ного судини; 6) значна економії поживних середовищ; 7) можливість зберігати виросли клітини безпосередньо на частинках при низьких температурах; 8) можливість штучно створювати різні концентрації МН з виросли на них клітинами; 9) можливість пасирування культури без застосування трипсину шляхом додавання свіжих порцій мікроносіях.

мікроносіях повинні мати:

- невеликий позитивний заряд в межах 1,5-1,8 мЕкв/м. У зв'язку з тим, що більшість клітин тварин мають слабо негативний заряд, вони легше будуть прикріплюватися до такого МН:

- щільність 1,05-1,15 г/см; вказана щільність є оптимальною для підтримки МН під зваженому стані;

- діаметр частинок від 100 до 250 мкм, що забезпечує площі для зростання кількох сотень клітин;

- гладку поверхню;

- прозорість;

- відсутність токсичності компонентів для клітин;

-- незначне всмоктування компонентів середовища;

-- універсальність, що забезпечує можливість використання їх для первинних, диплоїдних і гетероплоідних клітин. Важливе значення мають властивості МН, які дозволяють використовувати їх багато разів.

Проведено дослідження багатьох гранульованих препаратів різної хімічної природи, в тому числі з поперечно-зшитого (ПС) декстрану, ПС-агарози, ПС-полівінілпіролідон, поліакрілнітріта, пористого селікагеля, полістиролу, капрону, нейлону, алюмосилікат з метою використання їх як мікроносіях.

Придатними є тільки деякі з них, головним чином мають у своїй основі ПС-декстран.

Кілька зарубіжних фірм розробили комерційні препарати мікроносіях, готові до вживанню: Цітодекс-1, 2, 3 (Франція, Швеція), Супербіо (США, Англія), Біосілон (Данія). Вартість перерахованих препаратів досить висока, тому необхідно проводити дослідження з розробки та виробництва вітчизняних МН.

Культивування клітин на мікроносіях проводять в обичних ферментера для суспензійного культивування. У ферментера не повинно бути будь-яких виступів, кишень, щоб запобігти накопичення мікроносіях в застійних зонах. Тому розумно використовувати ферментера з круглим дном і гладкими стінками. Внутрішня поверхню ферментера повинна бути силіконізоване для запобігання прилипання мікроносіях до скла або нержавіючої сталі ферментера.

Для контролю за оточуючими культуру умовами такими, як рН і О2, може бути використане стандартне обладнання. Швидкість перемішування суспензії з носієм повинна бути 40-60 об/хв. Для вирощування на МН застосовуються різні типи клітин.

Концентрація цітодекса може варіювати від 0,5 до 5 мг/мл. Однак, при виробництві профілактичних вакцин, застосовують зазвичай кінцеву концентрацію цітодекса, не що перевищує 1 мг/мл. Підвищення концентрації до 3 мг/мл і вище створює додаткові труднощі, пов'язані з необхідністю перфузії живильного середовища і часткової її заміни, що ускладнює технологічний процес.

Посівна концентрація клітин, а також умови культивування на МН в перші години в значною мірою визначають оптимальні параметри для проліферації і максимального накопичення клітин. Показано, що посів 10 клітин/мл перевіваемой лінії нирок мавп (Vero) і диплоїдних клітин фібробластів ембріона людини (MRC-5) у зменшеному до 1/3 об'єму живильного середовища і при періодичному включенні мішалки (30 об/хв) на одну хвилину через кожну годину протягом 4 годин, з наступним додаванням живильного середовища до кінцевого об'єму, веде до збільшення проліферації клітин та їх кількості по порівняно з контролем (повний обсяг живильного середовища в момент посадки клітин і безперервна робота мішалки з початку культивування).

Важливе значення для культивування клітин на МН має живильне середовище. Правильний підбір живильного середовища також сприятиме оптимізації процесу проліферації клітин та їх якість. Необхідно проводити підбір поживних середовищ для культивування клітин на різних типах МН. Показано, що перевіваемая лінія клітин нирок мавп (Vero) на цітодексе дає найбільший вихід при використанні середовища Голка ДМЕ (посадковий концентрація клітин 105 мл) але порівнянні із середою вме і 199. Якщо ж кількість клітин при посадці знизити до 104, то найкращі результати дає середу 199. Всі піддослідні середовища містили 10% фетальної сироватки.

ВИРОЩУВАННЯ ВІРУСІВ в культурі клітин.

В даний час для виділення і розмноження вірусів тварин використовуються первинні культури, штами клітин і встановилися клітинні лінії. У загальних рисах процедура виявляється однаковою для всіх вірусів.

Середу видаляють з клітинного монослоя і монослой промивають збалансованими буферними сольовими розчинами (СБСР) або фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) для видалення інгібіторів (антитіл), які можуть бути присутніми в середовищі. Вірусні частинки суспендується в невеликій кількості СБСР або ФСБ і адсорбуються клітинами протягом 30 - 60