Експрес-діагностика
особливо небезпечних інфекцій
Виконав: Новак
А.Л., 301 гр., Л/ф, Владивосток, 1998.
Актуальність
проблеми
Особливо небезпечні
інфекції (ГОІ) - це інфекції, які можуть виникати серед населення у вигляді
окремих захворювань, епідемій і навіть пандемій, частіше супроводжуючи НС (стихійні
лиха, війни, масовий голод і т.п.), що характеризуються природного
думки про те, які інфекції слід зараховувати до ГОІ поки немає, вітчизняні
епідеміологи дотримуються такого переліку:
Чума
туляремія
Міелоідоз
Геморагічні
лихоманки
Жовта
лихоманка
Холера
генералізована
форма сибірської виразки
Найбільш
ймовірна поява ГОІ можливо під час НС. Різке погіршення
санітарно-гігієнічних умов загострює епідемічну ситуацію щодо інфекцій,
які раніше мали ендемічних характер, а завезених інфекції ззовні
прибувають особами призводить до того, що потенційні джерела інфекції
виявляються неізольованими і протягом тривалого часу мають
численні контакти з оточуючими їх особами. У зв'язку з цим до встановлення
остаточного діагнозу захворювання дотримується суворий протиепідемічний
режим.
При першій
ознаках чи підозрі на ГОІ здійснюється:
Виявлення
контактних осіб та їх обсервація;
Дача
антибіотиків широкого спектру дії (доксіцілін, тетрациклін тощо), тобто
екстрена профілактика;
Проведення
дезінфекційних заходів;
Відбір матеріалу
від хворих і доставка його в лабораторію для мікробіологічного дослідження;
Організація
частковою (повної) санобробки конкретних осіб.
У даній роботі
розбирається етап діагностики ГОІ на прикладі чуми, холери та туляремії. Якщо
діагноз встановлений з достатньою достовірністю, можна визначити характер
протиепідемічних заходів, встановити можливе джерело інфекції і
механізми його передачі. Саме з цього необхідно і виправдано застосування
експрес-методів діагностики ГОІ.
Загальні
принципи експрес-діагностики станів інфекції та імунітету
Сучасна
імунологія виключно багатолика, а сфери застосування імунологічних знань
і методів безмежно різноманітні. Вони використовуються практично у всіх
розділах біології, ветеринарії і медицини - від фундаментальних
молекулярно-біологічних дослідженні до медико-генетичного консультування
і безлічі інших суто практичних процедур, що здійснюються рослинникам,
тваринниками та медиками. І, тим не менше, особливо важливим у соціальному
відношенні і методично найбільш передовим продовжує бути той старий і
неухильно розвивається розділ імунології, успіхами якого забезпечується
розвиток теорії та практики здійснення протиепідемічної роботи-діагностики,
профілактики і лікування інфекційних захворювань. А методи імунологічної
експрес-діагностики мають ключове значення для ефективного вирішення названих
проблем та здійснення усіх відповідних протиепідемічних заходів.
Наступні нижче матеріали і присвячені саме цьому розділу прикладної
імунології, його стану та перспективам розвитку.
Найважливішою
передумовою ефективності будь-яких протиепідемічних заходів є
своєчасне прогнозування та виявлення моментів активізації тих екологічних
та соціально-екологічних взаємодій, які становлять істота
епідемічних процесів. Виключне різноманітність, властиве останнім і
потребує диференціації протиепідемічних заходів, обумовлене не
тільки самобутністю кожної з існуючого безлічі інфекційних хвороб.
Дуже велике значення має в цьому відношенні фундаментальне явище
гетерогенності популяцій, що входять до складу відповідних екологічних та
соціально-екологічних систем мікроб-жертва. Варіабільность цих вельми
складних біосоціальних факторів і умов в дуже великій мірі впливає на
специфіку того чи іншого етапу існування кожного епідемічного процесу. І
своєчасне розпізнавання цих особливостей, що здійснюється, як правило, з
використанням імунологічних методів, забезпечує ту диференціацію
протиепідемічних заходів.
Експрес-індикація
- Це своєрідна розвідка великої армії лабораторної діагностики. Вона
знаходиться на передньому краї наукового пошуку нових, простих, економічних, швидких
методів індикації мікробів, частина з яких в подальшому йде на озброєння
лабораторної практики і завдяки цьому остання весь час вдосконалюється.
Основні
об'єктивні вимоги до експресним методів діагностики інфекційних захворювань
зводяться до наступного:
1. отримання
результатів аналізу в максимально короткі терміни (години, ідеально-хвилини);
2. можливість
проведення і завершення аналізу без виділення шуканого мікроорганізму в чистій
культурі, при використанні тільки нативного матеріалу, в крайньому випадку-з
залученням елективних біосред для швидкого накопичення збудників;
3. безперечно
висока специфічність та висока чутливість, як передумови належної
достовірності аналізу;
4. висока
продуктивність, простота, доступність і відтворюваність аналізів.
Ці вимоги
рівною мірою застосовні і до методів експресному діагностики станів
імунітету. Переважне використання того чи іншого з існуючих
методів експрес-діагностики залежить від багатьох конкретних умов. Однак
найбільш бажаним є паралельне використання 2-3 методів. Такий
підхід значно збільшує надійність одержуваного результату.
На найближчі
роки найбільш перспективними такі напрямки розвитку експрес-індикації
мікроорганізмів.
Ензімоіндікаціонное
напрямок, пов'язаний з експрес-індикацією біохімічних властивостей і
визначенням ферментативного спектру мікробів. Як і раніше, збережуть свою
значимість дослідження з розробки Політропний (полісубстратних) живильних
середовищ. У нашій країні були розроблені оригінальні Політропний середовища та їх
комбінації, які з успіхом застосовуються в лабораторній практиці. При створенні
складних полікомпонентних поживних систем необхідно виходити з різних
біохімічних і енергетичних потреб мікроорганізмів. Для кращого
прояви життєдіяльності та біохімічної активності патогенних та інших
мікробів у середовищах необхідно створювати оптимальні умови для їх росту і
розмноження і одночасно вводити ферментіруемие субстрати (вуглеводи,
багатоатомних спирти, амінокислоти та ін) з найбільш чутливими
індикаторами, які швидко б реєстрували їх ферментацію. У результаті
застосування оптимальних полісубстратних середовищ проводиться виділення та накопичення
чистої культури мікробів з одночасним визначенням їх біохімічних
ознак. Перспективним слід розглядати розвиток ензімоіндікаціонних
методів, в яких субстрат з індикатором відділений від живильного середовища і
фіксований на спеціальному носії. У нашій країні розроблені
вуглеводно-паперові диски із захисною плівкою (паперові реагенти для визначення
дезамінази у мікробів) та їх аналоги ВІС (паперово-індикаторні системи),
вуглеводно-паперові поплавці, вуглеводно-полімерні плівки. Всі ці препарати
є дуже перспективними, вони дозволяють за найкоротший час (3-5
ч), використовуючи загальноприйняті поживні середовища та лабораторний посуд, визначати
ферментативну активність різних видів мікроорганізмів. Автономний препарат
- Олівець-фермент, що не має аналогів ні в нас, ні за кордоном, дозволяє без
застосування поживних середовищ безпосередньо на предметному склі визначати
біохімічні властивості мікробів. Полісубстратная тест-система і
ензімоіндікаторная стрічка використовуються для одночасної ідентифікації 20
біохімічних ознак у мікробів. Це нові види простих
"довгожителів" препаратів, призначених для швидкого і
економічного визначення біохімічних властивостей мікробів. Електрофізичних
метод визначення ферментативної активності мікробів включає посів мікробної
культури на рідкі поживні середовища, що містять пептони воду, різні
вуглеводи, багатоатомних спирти, амінокислоти з подальшим ферментативним
розщепленням досліджуваних речовин і утворенням різних іонізованих
продуктів розпад за природою, формою і розмірами види дрібнодисперсних носіїв
(сорбентів) антигенів і антитіл, що сприяють підвищенню чутливості
комплексних імунологічних методів. Реакції пасивної гемаглютинації та їх
модифікації пов'язані з використанням еритроцитарних діагностичних препаратів.
Еритроцитарна діагностику з успіхом застосовуються для прискореного виявлення і
ідентифікації як патогенних, так і умовно-патогенних мікроорганізмів
(наприклад, збудників туляремії, бруцельозу, сальмонельозу та ін) в різних
патологічних матеріалах, отриманих від хворих, і в об'єктах зовнішнього середовища.
Реакції з еритроцитарних діагностикумами є дуже чутливими, і в
цьому відношенні часто перевершують інші серологічні реакції. Вони введені в
офіційні інструкції по експрес-індикації бактеріальних агентів в елементах
зовнішнього середовища і в матеріалах, отриманих від уражених людей і тварин.
Одночасно тривають пошуки нових носіїв антигенів і антитіл, які
були б безантігеннимі, стабільними, не руйнується при тривалому зберіганні,
а що застосовуються реакції - простими з техніки постановки (наприклад, скляні
тести) і дослідження з їх допомогою - економічними. Удосконалюються реакції з
застосуванням кольорових целюлозних частинок як носіїв антигенів і
антитіл.
Позитивними
властивостями такого роду препаратів є:
відсутність
власної антигенів;
стабільність
при тривалому зберіганні;
демонстративність
і простота техніки постановки реакції, зазвичай на предметному склі;
висока швидкість
економічність.
Крім того,
корисним і виправданим вважаємо пошук нових носіїв антигенів і антитіл. У
цьому відношенні перспективними є іонообмінні смоли, латекси, целюлоза і
її похідні і ряд інших речовин, які можуть сприяти підвищенню
чутливості серологічних реакцій.
імунохімічної
напрямок, пов'язаний з використанням різноманітних комплексних сполук
специфічних антитіл або антигенів з хімічними речовинами. Приєднані
хімічні речовини надають їм нові феноменологічні здібності та властивості,
тим самим, розширюючи можливості експрес-індикації мікробних агентів у
Зокрема і лабораторного аналізу взагалі. Велику популярність і практичну
значимість набули методи швидкого імунофлуоресцентного аналізу (прямої,
непрямий, антікомплементарний), які нині офіційно використовуються як методи
експресному індикації і швидкого визначення мікроорганізмів. Подальше
розвиток дуже перспективного імунохімічної напрямку багато в чому залежить
від хіміків, які повинні розробити досить яскраві нові барвники,
вступають у з'єднання зі специфічними антитілами і антигенами. У результаті
можуть бути отримані препарати з новими феноменологічним властивостями,
що дозволяють проводити експрес-індикацію мікробних культур та окремих клітин
за допомогою широко розповсюджених мікроскопічних пристроїв (типу МБІ
різних марок).
Імуноферментні
напрям, що інтенсивно розвивається в останні роки. Розроблено прямій,
непрямий, антікомплементарний й інші методи швидкого виявлення мікробів
шляхом використання іммуноензімологіческого принципу; запропоновані нові види
ферментів, а також різноманітні види хромогенних субстратів. Дане
напрямок є дуже перспективним, розвиток його може привести у
найближчі роки до появи нових методів експрес-індикації мікроорганізмів.
Іммуноелектрофоретіческое
напрямок успішно розвивається з кінця 50-х років. Розроблено численні
методи іммуноелектрофореза. Однак для цілей експрес-індикації мікробів частіше
вдаються до зустрічного іммуноелектрофорезу. Застосування нових хімічних
барвників, ферментної або радіоактивності дозволить різко підвищити
чутливість методу іммуноелектропреціпітаціі.
Іммунорадіологіческое
напрям пов'язаний з використанням різноманітних кон'югатів специфічних
антитіл або антигенів, з'єднаних з радіоактивними речовинами, які надають
їм нові феноменологічні властивості і здібності, р встановити природу
збудника навіть у тих випадках, коли іншими методами, з причини його мінливості
або забруднення матеріалу, він залишається нерозпізнаним.
Біологічне
напрямок, пов'язаний з вивченням токсичних і агресивних властивостей патогенних
мікроорганізмів. Біологічні методи здійснюються на одноклітинних
організмах, на культурах клітин, курячих ембріонів, а також на здорових, а ще
краще спеціально підготовлених лабораторних тварин. Ці методи більше
трудомісткі і менш точні в порівнянні з іншими.
Фізико-хімічне
напрямок. Цей напрямок пов'язане з використанням порівняно швидких, але
в той же час і досить складних за апаратурним оформлення методів. Сюди
входять методи вивчення бактеріальних популяцій і їх екстрактів за допомогою
хроматографії (газорідинна та ін), спектроскопії (інфрачервоної,
ультрафіолетової та ін), резістографіі по відношенню до різних антибіотичних,
хімічних і лікарських речовин, а також методи температурної і кислотної
агрегації, коагуляції мікробних суспензій і їх токсинів.
рецепторні і
генетичне напрямки швидкої індикації патогенних і санітарно-показових
мікроорганізмів. Методи, засновані на цих принципах, тільки починають
розвиватися. Так, за допомогою целюлозно-глобулінового або
еритроцитарної-глобулінового діагностикумів швидко виявляють патогенний
стафілокок, що містить білок А, а шляхом гомології невідомих нуклеїнових
кислот з відомими нуклеїновими кислотами встановлюють вид патогена.
Комплексне
напрям прискореної ідентифікації патогенних і санітарно-показових
мікроорганізмів, що використовує методи експрес-індикації, засновані на
інтеграції різних принципів, пов'язаний з розробкою і створенням індикаторних
тест-систем, що дозволяють протягом короткого терміну і з мінімальними витратами
на аналіз визначити комплекс основних ознак патогена або
санітарно-показового представника, достатніх для його ідентифікації до
роду, виду і навіть типу.
Напрями,
пов'язані з розробкою нових принципів мікробіологічного аналізу. Цілком
ймовірно, і ми маємо право очікувати в найближчі 5-10 років появи нових ідей,
підходів і принципів у мікробіологічної науки та суміжних з нею областях.
Відкриття нових видів рецепторній, імунологічної та генетичної специфічності
у мікробів дозволить створити нові і можливо більш досконалі методи швидкої
ідентифікації мікроорганізмів.
Основні шляхи
розвитку експрес-індикації мікроорганізмів на найближчі роки:
створення і
конструювання нових препаратів, що сприяють прискоренню і здешевленню
досліджень, підвищення ефективності лабораторної діагностики інфекцій та
індикації патогенних та інших мікроорганізмів. На цьому шляху належить зробити
дуже багато чого, оскільки загальноприйняті діагностичні препарати значною
мірою вичерпали свої потенційні можливості;
розробка
нових більш чутливих, простих методів лабораторного аналізу.
розробка
комплексних методів та видів досліджень. Триватиме подальша
інтеграція методів і видів досліджень, що мають різні принципи дії,
що лежать в їх основі;
створення нових
схем досліджень. Оскільки лабораторна діагностика інфекційних хвороб, а
також експрес-індикація, хоча і в меншій мірі, пов'язані з вивченням
комплексу різних властивостей і особливостей мікроорганізмів з використанням
звичайно різноманітних методів і прийомів, заснованих на різних принципах, то
створення нових схем досліджень із застосуванням нових методів є
об'єктивною реальністю і важливим завданням, що випливає із суті самого
процесу розвитку мікробіологічного аналізу;
?? азработка і
створення нових методів реєстрації та обліку результатів експрес-индикационного і
лабораторних досліджень.
розробка
нової мікромініатюрной лабораторного посуду, апаратури і приладів для
досліджень;
автоматизація та
комп'ютеризація досліджень.
У сучасних
умовах ці питання повинні вирішуватися комплексно. Таким чином, розглянувши від 10
осіб. Флакони поміщають в термостат при 370с. Через 3 - 4 години холерні вібріони
починають агглютініроваться і поступово (протягом найближчих 2 годин) падають у
вигляді пластівців на дно флакона. Досліджуючи під мікроскопом пофарбовані мазки і
"висячу краплю", виявляють склеїти і частково вільних
вібріонів. Через 6 годин дається відповідь і в разі виявлення холерних вібріонів
негайно проводиться посів індивідуально від кожного з 10 осіб. Такий метод
дає можливість досліджувати до 16 000 чоловік за 3 - 4 дні. Метод
іммунодіагностіческой мікроплівки. Вивчення антигенних властивостей холерних
вібріонів проводять шляхом постановки пробірочними або пластинчастої реакції
аглютинації з використанням сухих ліофілізованих діагностичних
аглютинативна холерних 0-сироваток і сироваток Огава і Інаба. Сироватку
розводять у фізіологічному розчині або дистильованої води і змішують при
постановці аглютинації на склі з досліджуваної культурою вібріонів. При
підготовці сироватки використовується додаткова посуд, що ускладнює роботу
бактеріолога, а в що залишилася розведеною сироватці швидко проростає
бактеріальна мікрофлора і інактивує її. Для вивчення антигенної структури
холерних вібріонів були розроблений іммунодіагностіческій препарат у вигляді
мікропленок разового застосування, який володів достатньою специфічністю,
демонстративністю і економічністю. Іммунодіагностіческіе холерні мікроплівки
(ІХМП) у вигляді полімерної плівки з нанесеними висушеними краплями,
фіксованими на папері, містять мінімальну кількість сироватки,
плівкоутворювальний компонент і консервант. Плівкоутворюючий компонент зв'язує,
склеює і фіксує мікрокількості інгредієнтів до поверхні носія,
виключає крошенію мікропленок; консервант охороняє препарат від руйнування
при тривалому зберіганні. Концентрація діагностичної сироватки в ІХМП є
достатньою, оскільки після емульгування у краплі фізіологічного розчину, антитіла
містяться в титрі 1:100, що повністю забезпечує хід реакції. Тим самим
забезпечується достатня концентрація антитіл, знижується, витрата
діагностичної сироватки і виключається можливість її невикористання. При
цьому створюються умови для швидкого розчинення ІХМП, контакту її з холерними
вібріонами і проведення реакції безпосередньо на полімерній плівці. Готові
ІХМП зберігають у темному сухому місці при 4 - 7 ° С в картонних коробках (термін придатності
3 роки - термін спостереження) і в міру потреби ІХМП використовують для визначення
холерних вібріонів. Для виключення випадкового зараження навколишніх предметів
ІХМП поміщають в чисту чашку Петрі. На поверхню ІХМП наносять краплю
фізіологічного розчину, в якій розчиняють її. Розведену сироватку
змішують з досліджуваної культурою вібріонів, знятої бактеріологічної петлею з
живильного середовища. При іншому варіанті постановки реакції ІХМП знімають
скальпелем з паперової підкладки і переносять на предметне скло, розчиняють в
краплі фізіологічного розчину і змішують з досліджуваної культурою вібріонів.
При позитивній реакції через 1-3 хв з'являються зерна агглютіната,
пофарбовані в зелений колір, а крапля просвітлюють. При негативній реакції
крапля залишається гомогенно-каламутній. Використану частина полімерної плівки
відрізають, а частину, що залишилася плівки з ІХМП зберігають у тій самій чашці Петрі для
подальших досліджень. Використання ІХМП в дослідженнях вібріонів та інших
мікроорганізмів дозволяє отримати статистично достовірні результати,
заощадити дорогі діагностичні сироватки, підвищити якість і
ефективність досліджень. Реакція аглютинації мікрометодом.
Останнім
час у бактеріологічної практиці знайшов досить широке застосування
мікрооб'емний метод постановки серологічних реакцій з використанням
спеціальних планшеток і мікротітровальних голок. Реакції аглютинації
мікрометодом ставлять з холерними аглютинативна референс-сироватками в
полістролових мікротітровальних планшетка з плоским або V-образ-ним дном,
призначених для імунологічного агглютініровалісь в планшетка і пробірках
відповідно в 95 і 96% випадків. У холерних вібріонів класичного і ельтор
біовари серовар Огава співвідношення в обох методиках були практично ті ж.
Цікавий факт, що при постановці реакції аглютинації з RO-сироваткою
найбільше число штамів, аглютинативна RO-сироваткою до титру, було
виявлено в мікрометодом; в пробірках аглютинація встановлена в одного штаму.
Всі штами вібріонів 040-056 сероварів в мікрометодом НЕ агглютініровалісь
холерними аглютинативна сироватками, а в пробірках штам II 258-1099 (040
серовар) агглютініровался усіма холерними сироватками. Більшість вивчених
штамів представників сімейства Enterobacteraceae також не агглютініровалось
холерними аглютинативна сироватками, за винятком Sh. flexneri 2503, у
якого в пробірках була виявлена аглютинація з усіма сироватками, і штаму
S. typhimurium 21, у якого відзначена неспецифічна реакція аглютинації зі
всіма сироватками як в пробірках, так і в планшетка. При користуванні цим
методом витрата аглютинативна сироваток зменшується в 10 разів, значно
скорочується час, необхідний для постановки реакції, і прискорюється термін видачі
відповіді. Крім того, описаний метод менш трудомісткий.
Таким чином,
стандартність, достовірність отриманих результатів, висока економічність
методу дозволяють рекомендувати його при ідентифікації холерних вібріонів,
вивченні штамів і популяції штамів холерних вібріонів за ознакою
агглютінабельності. А також: Іммобілізація вібріонів холерними сироватками і
типовими холерними фагами. Краплі випорожнень або матеріалу з поверхні
пептонов води обробляють холерної О-сироваткою, типовими сироватками Огава і
Інаба або типовими холерними фагами. Готують з них препарати
"розчавлена крапля", які досліджують за допомогою темнопольной і
фазовоконтрастной мікроскопії. У позитивному випадку через 3-5 хвилин рух
вібріонів припиняється. РИФ. Препарати з досліджуваного матеріалу обробляють
флюоресцирующим протихолерної сироваткою і досліджують в люмінесцентному
мікроскопі.
Позитивним
результатом вважається виявлення в препараті навіть одиничних вібріонів з яскравим
жовто-зеленим світлом у вигляді блискучого обідка по периферії клітини.
Позитивний результат можна отримати через 1-2 години після початку дослідження
при концентрації вібріонів не менше 106 клітин в 1 мл., тому рекомендується
попередньо підрощування матеріалу на поживних середовищах.
Експрес-діагностика туляремії Збудник туляремії (Туляре - район
Каліфорнії) - Franciella tularensis відноситься до роду з нез'ясованим становищем
в систематиці мікробів. Етіологічна природа туляремії була встановлена в
1912 Г.Мак-якому і Ш. Чепіним, а далі докладно вивчена Е. Франсісом.
туляремії --
важка кров'яна зоонозних інфекція з природного осередкових. Основні джерела
інфекції - водяні пацюки, ондатри, зайці, щури, миші. Хвора людина
неконтагіозен і для збудника є біологічним тупиком. Передається
трансмісивних шляхом через кліщів, а нерідко і контактним, аліментарним або
аспіраційних шляхом. Збудник містить нуклеопротеїдні О-і оболончатий
білково-ліпідний Vi-антиген. У перенесли хвороба виробляється дуже
напружений і тривалий імунітет. Матеріал для дослідження: кров, гній,
пунктат бубон, слиз із горла. Реакція аглютинації-розсіювання. Запропоновано
проста, швидка, високочутлива і специфічна реакція
аглютинації-розсіювання, для постановки якої використовується антитільний
діагностикумів. Це суспензія темно-коричневого кольору, що представляє собою
комплексне з'єднання кулястих крупнодісперсних НК-частинок (Нікітін і Котіч)
і протівотуляремійних імуноглобулінів. Препарат зберігають у холодильнику при +4 ° С
протягом 2-3 років. Після закінчення 3 років препарат можна ресенсібілізіровать, так
як НК-частинки высокостабильны. Для постановки реакції аглютинації-розсіювання
на ретельно знежирене предметне скло наносять ліворуч відносяться також Y.
pseudotuberculosis і Y. enterocolitica, що викликають септичні
гастроентероколіти або ієрсиніози.
Чума - особливо
небезпечна, дуже важка кров'яна інфекція, схильна до широкого поширення і
що дає високий відсоток смертності (від 20 до 100%). Це зоонозних трансмісивна
природно-осередкова інфекція. Джерела - пацюки, ховрахи, піщанки, полівки,
бабаки, мишоподібні гризуни. Переносники - кровоссальні комахи. У складі
бактерій чуми міститься понад півтора десятка специфічних і групових
антигенів. Перехворіли набувають довічний, стійкий імунітет
фагоцитарного характеру. Матеріал для дослідження: вміст бубонної,
відокремлюване виразок, харкотиння, кров, випорожнення. Метод паперових індикаторних
систем. Класичні методи (посів на середовища Гіссен) громіздкі, вимагають багато
часу і великої кількості поживних середовищ, що мають обмежений термін
придатності. В даний час ці методи не задовольняють запитам протичумної
системи. В даний час найбільш перспективним методом визначення
ферментативної активності штамів збудника чуми з метою ідентифікації
виділених культур і вивчення їх властивостей можна вважати метод вуглеводно-паперових
дисків, запропонований В. М. Нікітіним і С. В. Плугару. Як середовище краще
використовувати бульйон Хоттінгера, тому що він дає найбільш швидку ферментацію - 3
години. Доцільно застосовувати БІС в польових умовах, тому що набори компактні
і можуть тривалий час зберігатися при кімнатній температурі. Фаготіпірованіе.
1. Внесення бактеріофагу в досліджуваний матеріал у момент його посіву на агар з
генціанвіолетом дозволяє виявити під мікроскопом негативні колонії фага
або "доріжку" в перші години, коли зростання бактерій ще майже не помітний
(через 2,5 - 3 години). Метод простий, доступний і дає гарні результати при
високої концентрації чумного мікроба і при відносно великій зміст
сторонніх мікроорганізмів. 2. Визначення наростання титру чумного фага,
вноситься у досліджуваний матеріал, де в разі наявності збудника фаг починає
розмножуватися вже через 30-40 хвилин. У рідкий досліджуваний матеріал (25-50-100
мл) і в контрольну рідину додають стільки фага, щоб отримати його
розведення 1:50 - 1:100; ставлять проби в термостатах при 370C на 45-60 хвилин.
Після інкубації беруть 0,5 мл рідини з кожної проби і розводять бульйоном у 10
разів; з цього першого розведення фага готують серію послідовних 10-кратних
розведень (до 10-10 - 10-11). По 0,5 мл рідини з кожного розведення досліджуваного
і контрольного рядів додають до 2,5 мл напіврідкого агару (0,1%),
попередньо розплавленого і потім охолодженого до 48-500С. Тут же до агар
додають 0,1 - 0,2 мл суспензії 1 - 2 добової індикаторної культури (вакцинний
чумного штам мікроба), що містить 15-20 млрд мікробів у 1 мл. Вміст
пробірок ретельно перемішують і виливають на чашки Петрі з 2% агаром
Хоттінгера. Після того, як напіврідкий агар застигне, чашки перевертають дном
догори і ставлять в термостат при 370с. Облік результатів проводять через 3-4
години. На тлі суцільного зростання індикаторної культури видно стерильні плями
(негативні колонії фага), кількість яких на чашках з досліджуваним
матеріалом може перевершувати в 100-1000 і більше разів число негативних колоній
на контрольних чашках. Завдяки гарній дифузії фагів частинок і
бактеріальних клітин через напіврідкий агар двошаровий метод дає стерильні
плями більшого розміру, ніж при розмазування досліджуваної маси шпателем по
поверхні агару. Підрахунок колоній ведуть в лічильної камері. А також: РИФ, РПГА і
ін
Деякі
інші методи
Хемілюмінесцентний
іммуноаналіз. Новим етапом на шляху розвитку імунологічних методів
діагностики ГОІ є хемілюмінесцентний іммуноаналіз - ХЛІА. Перевага
цього методу визначається його високою чутливістю, відносної
простотою і продуктивністю, можливістю повної автоматизації У відкритій
літературі є окремі повідомлення, присвячені застосуванню ХЛІА в
медичної мікробіології, як для виявлення бактеріальних антигенів, так і
Специфічність ХЛІА залежить від якості використаних імуноглобулінів. На 42
близькоспоріднених і гетероло-гічної штамах позитивні реакції отримані з Y.
pseu-doTuberculosis 816111 (37 °) з чумними загальними ІПК і В. sereus 1 і 3 з
сібіреязвеннимі ІПК в концентраціях 1 -106 м. т./мл. ХЛІА слід рекомендувати
для лабораторної діагностики ГОІ особливо в тих випадках, коли в досліджуваному
матеріалі передбачається незначний вміст збудника.
іммуноблотінга
імуноблотінгу
- Різновид гетерогенного імунного аналізу. Сутність його полягає в
перенесення молекул досліджуваного речовини з одного твердого носія,
використовуваного для фракціонування біополімерів, на інший, де за допомогою
імунохімічної реакції відбувається їх специфічне виявлення. Залежно
від досліджуваної речовини розрізняють ДНК, - РНК і білок - блот. При постановці
імуноблотінгу дотримується наступна методична послідовність:
електрофоретичної поділ аналізованого матеріалу на індивідуальні білки
або поліпептиди в гелі; отримання репліки шляхом блот білків або
поліпептидів з гелю на твердофазних матрикс; блокування фону, відмивання від
компонентів, які використовуються при блокуванні фону; інкубування зі специфічною
тест-сироваткою; відмивання від надлишку сироватки; інкубування з Jg до антитілам
специфічної тест-сироватки, кон'югованими з міткою; відмивання від надлишку
міченого іммунореагента; виявлення тестованих антигенів авторадіографіческі
або ферментативно по реакції з відповідним субстратом. Імунохімічної
виявлення антигенів можна проводити з допомогою антитіл, кон'югованих з
міткою. В якості мітки останнім часом широко застосовують або радіоактивні
ізотопи, або ферменти (пероксидазу, лужну фосфатазу, лактамазу та ін.)
Час блот шляхом дифузії складає 36-48 ч. Але найбільш швидкий і
ефективний спосіб перенесення білків з гелів - електроблот, час якого,
основному, становить 1-3 години (2), для деяких високомолекулярних білків-більше
12 ч. Конкретний вибір сорбентів для різних модифікацій блотом
(нітроцелюлоза або папір, оброблена відповідним чином), вибір
умов блокування та імуно-хімічного виявлення антигенів повністю залежить
від антигену, його кількості, методу іммуноаналіза і цілей дослідження. Метод ІБ
з цілого ряду обставин отримав найбільше поширення як метод,
придатний для використання в якості тесту підтвердження. Безумовне
достоїнство методу - можливість тестування антитіл до слабко або зовсім
нерозчинним антигенів і виключення стадії введення радіоактивної мітки в
антигени. Про чутливості в разі ІБ судять щодо граничного кількості
нанесеного на гель антигену, який при фракціонування білків вдається
виявити імунохімічний після перенесення з гелю на тверду фазу (нітроцелюлозу).
Загальна чутливість аналізу залежить від цілого ряду причин: умов
фракціонування та іммобілізації антигену на твердому носії, рівня фону,
специфічності і афінності антитіл. Важливе значення має вид використовуваної
мітки та спосіб її виявлення.
Таким чином,
метод іммуноблотінга дозволяє ідентифікувати зони антигену на твердій фазі,
не зв'язуючи весь білок з антитілами специфічної сироватки. Іммуноблотінга і
його модифікації в основному використовуються для типування бактеріальних і вірусних
антигенів і антитіл, особливо в разі недостатньої роздільної здатності
звичайних систем, а також при аналізі імуноглобулінів, нуклеїнових кислот або
як тест підтвердження в поєднанні з іншими методами.
Виявлення
збудників, антигенів і антитіл за допомогою суспензійний препаратів.
Принцип:
фіксовані на частинках компоненти вступають в реакцію антиген-антитіло,
яка супроводжується утворенням великих, видимих неозброєним оком
агломерацій. У суспензійний препаратах для виявлення та кількісного
визначення ан?? Іген і антитіл використовується властивість багатьох неорганічних і
органічних речовин, таких як активоване вугілля, дерматол, бентоніт,
каолін, гідроокис алюмінію, си технічними можливостями лабораторії,
контингентом заражених людей, характером і масштабом поширення
передбачуваної інфекції. Діагностику необхідно провести в найбільш короткі
терміни, тому що від цього залежить ефективність ізоляції та лікування хворих. При
роботі з патологічним матеріалом важливо враховувати і попереджати можливість
зараження медичного персоналу, тому треба суворо дотримуватися інструкції
збору матеріалу від хворих. Класичні методи експрес-діагностики в
здебільшого вичерпали себе, у зв'язку з цим необхідно розробляти принципово
нові, такі як ПЛР, і т.д. та автоматизувати існуючі.
Таким чином,
експрес-діагностика ГОІ і до цього дня залишається актуальною і однією з найважливіших
завдань мікробіології та епідеміології. Список використаної літератури
Прискорені методи діагностики інфекційних хвороб (СБ тр.)-Кишинів,
"Штиинца", 1987. Препарати для експрес-діагностики (СБ тр.) --
Ленінград, 1981. Імунохімії та лабораторна діагностика особливо небезпечних інфекцій
(СБ тр.) - Саратов, 1985. Щербак Ю.Ф. Особливо небезпечні інфекції - М.,
"Медицина", 1975. Рання та диференціальна діагностика основних
інфекційних захворювань (уч.-мет. допомога) - Ленинград, 1988. Медицина
катастроф (уч. допомога) - М., "ІНІ Лтд", 1996. Лебедева М.Н.
Керівництво до практичних занять з медичної мікробіології - М.,
"Медицина", 1973. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлін І.С.
Керівництво до лабораторних занять з медичної мікробіології, вірусології і
імунології - М., "Медицина", 1993. Повловіч С.А. Медична мікробіологія
в графах - Минск, "Вышэйшая школа", 1986.
