Діагностика
стафілококових інфекцій
Виконав: Новак
А.Л., 301 гр., Л/ф, Владивосток, 1998.
Передмова
Незважаючи на те,
що стафілококи належать до числа найбільш легко виявляються і
розпізнаваних мікроорганізмів, які не потребують складних діагностичних прийомів
для їх виявлення, в практичній роботі мікробіологи досі відчувають
певні труднощі при встановленні їх причинного ролі в ряді різноманітних
захворювань. З одного боку, присутність патогенних стафілококів,
що виявляється в досліджуваному матеріалі, не завжди є переконливим
доказом їх етіологічного значення.
З іншого,
враховуючи велику різноманітність проявів біологічної активності цих мікробів,
залежне від різних, не завжди піддаються обліку факторів, широку їх
мінливість під впливом лікарських речовин і самого макроорганізму,
досить складно буває визначити їх потенційну патогенність. Нарешті,
третя причина пов'язана з тим, що стафілококи є представниками
нормальної мікрофлори з групи умовно патогенних мікроорганізмів і, разом з
непатогенних, патогенні представники мешкають в організмі людей,
поширюючись при цьому вельми нерівномірно на різні ділянки людського
тіла. Якщо виділення патогенного стафілокока, з крові хворих людей і
різних порожнин, які прийнято вважати стерильними, у переважній
більшості випадків може бути доказом його ролі як збудника
хвороби, то присутність стафілококів на слизових зіва, носа і т. д. навіть при
явному хворобливому стані їх вимагає великої обережності дослідника в
висновках про етіологію даних захворювань.
Тому,
природно, не може бути загальних рекомендацій, як при діагностиці різних
стафілококових інфекцій, так і при мікробіологічних дослідженнях ділянок
тіла людини і різних об'єктів зовнішнього середовища. Широкий обмін думками між
мікробіологами наукових установ і практичних лабораторій, що здійснюється на
з'їздах і конференціях, присвячених проблемам стафілококових інфекцій, а також
при особистих контактах, здавалося б, повинен був привести до певних поглядів
на різні методи дослідження, пропоновані для виділення та ідентифікації
стафілококів. Однак, велика кількість запитів, що надходять з лабораторій СЕС і
лікувальних закладів, свідчить про явні труднощі, які виникають у
дослідників при вирішенні різних питань мікробіологічної діагностики
стафілококів, а в ряді мікробіологічних установ існують ще деякі
застарілі методи і прийоми, що призводять до неправильних оцінок і навіть прикрим
непорозумінь.
Важливою умовою
ефективності лабораторної діагностики є поєднане визначення
якісних і кількісних критеріїв змісту патогенних стафілококів у
досліджуваному матеріалі. Виходячи з цього, я вважаю за необхідне викласти ряд
методів основних мікробіологічних досліджень, найбільш простих і доступних
для кожної практичної та наукової лабораторії, якими ми користуємося протягом
багатьох років.
ОСНОВНІ
ПРИНЦИПИ виявлення та ідентифікація патогенних стафілококів
Попередня
діагностика стафілококів може грунтуватися на бактеріоскопічне вивченні
препаратів - мазків, пофарбованих за Грамом. Патогенні стафілококи, крім
гроздевідного розташування, характеризуються правильної сферичної формою
клітин. Виявлення стафілококів, що знаходяться всередині клітин, дозволяє дати
відповідь про наявність стафілококової інфекції. У більшості ж випадків для точного
встановлення патогенності виявлених стафілококів потрібно виділити ці
мікроорганізми в чистій культурі шляхом посіву досліджуваного матеріалу на щільні
поживні середовища. В даний час асортимент диференціальних, елективних і
накопичувальних середовищ, запропонованих для виділення патогенних стафілококів, вельми
значний і продовжує розширюватися.
Багато
дослідники на основі знання основних біохімічних характеристик і
поживних потреб патогенних стафілококів при конструюванні середовищ
прагнуть підвищити їх висеваемость і забезпечити можливість здійснювати їх
кількісний облік, отримати надійний спосіб відрізняти потенційно
хвороботворні стафілококи від сапрофітів. Вживання рідких накопичувальних
середовищ для першої гемолітичну активність стафілококів. При цьому необхідно
пам'ятати, що гемолітична здатність, яка визначається на чашках з кров'яним
агаром, залежить від багатьох факторів - виду крові, її концентрації, наявності в ній
антитоксинів, товщини шару середовища, вмісту вуглекислого газу в атмосфері
культивування, густоти посіву, присутності і характеру супутньої флори і
т. д.
При відборі
колоній з кров'яного агару необхідно отвівать як гемолітичні, так і не
дають гемолізу, особливо якщо дослідження проводиться на середовищі з людською
або кінської кров'ю, а відсутність гемолізу на таких середовищах не дозволяє
укласти про відсутність взагалі гемолітичної активності. Тому використання
кров'яного агару для первинного посіву доцільно тільки при обстеженні
об'єктів, що не містять сторонньої мікрофлори, і бажано додавати в
живильне середовище кров кролика або барана.
Якщо ж
проводиться дослідження гною відкритих ран або відокремлюваного виразок або нориць, то
слід користуватися елективний-диференціальної середовищем для стафілококів --
жовтковим-сольовим агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича. Елективний цього середовища
забезпечується високим вмістом хлористого натрію, а доданий яєчний
жовток дозволяє виявляти лецітовітеллазную активність, яка є одним
з показників патогенності стафілококів і в силу цього ЖСА більш чітко диференціює
патогенних представників, ніж кров'яний агар. Приготування ЖСА нескладно.
Заготовляють про запас і стерилізують в автоклаві при 120 ° С "протягом 20 хв
поживний агар (МПА або Хоттінгера) рН 7,2-7,4, що містить 10% кухонної
солі. Перед вживанням сольовий живильний агар розтоплюють, остуджують до
45-50 ° С і додають до нього 20% за обсягом стерильною жовтковим суспензії (1 жовток
курячого яйця на 200 мл фізіологічного розчину). Для кращого емульсірованія
бажано мати колби зі скляними намистом. Після ретельного перемішування
середовище розливають по 20-25 мл в чашки, які можуть зберігатися в холодильнику в
протягом декількох днів. Слід проводити масивний посів досліджуваного
матеріалу на чашки з ЖСА, а інкубацію вести протягом 2 діб при 35-37 ° С.
Стороння флора різко пригнічується, стафілококи ж на ЖСА виростають
практично в чистій культурі. Безпосередньо під час перегляду чашок навколо
колоній відзначається освіта райдужних віночків і каламутній зони --
лецітовітеллазная реакція. Такі колонії, не менше двох з кожного посіву,
отвівают на скошений м'ясо-пептони агар для подальшої перевірки виросли
культур у реакції плазмо-коагуляції.
Щоб уникнути
помилок у визначенні жовтковим реакції, необхідно мати на увазі, що іноді
спостерігається помутніння середовища без веселкового обідка, в цьому випадку проба на
лецітовітеллазу вважається негативною. Якщо ж колонії, що виросли на ЖСА, не
дають лецітовітеллазной реакції, тобто не оточені райдужним віночком, але є
ріст стафілококів, то їх теж вважають підозрілими і також отвівают НЕ
менше двох з кожного такого посіву на чашки з простим живильним агаром
плямами діаметром 5-10 мм. Після добового інкубації при 37 ° С отримані
макроколоніі перевіряють у реакції плазмоагглютінаціі, для чого мікробну масу
розмішують петлею на склі у краплях цитратно кролячій або людської
плазми, розведеною 1: 4. Освіта пластівців враховують протягом 30с-1 хв.
За наявності плазмоагглютінаціі такі штами вважають підозрілими і отвівают
на скошений агар для подальшого вивчення в коагулазной реакції.
При такому
відборі число пропускаються штамів патогенних стафілококів людського
походження невелика, культури же, виділені від тварин, потрібно
перевіряти у реакції плазмокоагуляціі. Коагулазная проба є основним
ознакою, що визначає хвороботворності стафілококів, тому її постановка
вимагає до себе максимальної уваги. Для виявлення коагулазной активності у
стафілококів, виділених від людей, можна користуватися як цілісної кров'ю, так
і плазмою кроликів або людини. Можна використовувати також кров або плазму, взя
результатів проводиться обов'язково двічі: через 2-3 год і 24 ч. враховують
згортання плазми та освіта згустків. Зазвичай культури, активно
продукують коагулазу, дають позитивну реакцію вже через 2-3 год а якщо вони
володіють і вираженою фібринолітичної активністю, то спочатку
утворилися згустки можуть піддатися розплавлюванню до кінця доби.
Слабокоагулірующіе штами можуть давати позитивну реакцію в пізні строки-до
кінця доби. Досліди, що дали сумнівний результат, необхідно повторити.
Деякі
дослідники, отримавши негативний або сумнівний результат, залишають
пробірки на столі. Цього робити не можна, тому що згортання плазми в більш
пізні терміни може носити не специфічний характер і його не слід приймати
до уваги. Стафілококи, що дають позитивну коагулазную пробу, повинні
розглядатися як потенційно патогенні, незалежно від наявності або
відсутності у них гемолітичних властивостей і характеру пігменту, їх відносять до виду
St. aureus і надалі піддають фаготіпізаціі і перевірці на
чутливість до антибіотиків. Поглиблене вивчення стафілококів показало,
що основна ознака па-тогенності - коагулазная реакція може піддаватися мінливості
при дії різних факторів (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падерін,
1966), тому в ряді випадків, при виділенні коагулазонегатівних стафілококів
в монокультурі з патологічних вогнищ, доцільно вивчити у них інші
ознаки потенційної хвороботворності і перш за все - здатність
ферментувати маніт в анаеробних умовах.
Відомо, що
серед коагулазоотріцательних частина культур має здатність розщеплювати
маніт в анаеробних умовах (8,4%-за даними А. А. Акатова і М. Л. Хатеневер,
1974). Визначення ферментації маніту в анаеробних умовах технічно дуже
просто і здійснюється шляхом посіву уколом досліджуваних культур в пробірки з
високим стовпчиком напіврідкого агару Хоттннгера, що містить 1% маніту і 0,004%
індикатора бромкрезолпурпура або бромтімолблау (рН == 7,2). Це середовище перед
посівом "регенерують", тобто кип'ятять на водяній бані, швидко
охолоджують, а після посіву заливають шаром стерильного вазелінової олії. Посіви
інкубують при 37 ° С протягом 5 днів. Однак у значній кількості випадків
результати можуть бути враховані вже через добу. Поряд з реакцією
плазмокоагуляціі, велике значення набула ще одна важлива здатність
стафілококів, що характеризує їх потенційну патогенність,
-дезоксірібонуклеазная активність.
Багато
дослідники повідомляють про високу кореляції цієї ознаки з коагулазной
активністю і токсигенних досліджуваних культур; відзначають, що стафілококи,
виділені з патологічного матеріалу, як правило, мають ДНК-Азою.
Коагула-зопозітівние штами, отримані від носіїв, можуть не мати цього
ферменту, і звичайно відсутність дезоксірібонуклеазной активності поєднується з
низькою біохімічної здатністю і атоксігенностью таких культур
стафілококів. За спостереженнями деяких дослідників, серед
коагулазонегатівних штамів стафілококів, але володіли іншими ознаками
патогенності, виділених у ряді випадків від хворих з різними гнійними
інфекціями, дезоксірібонуклеазную активність виявляли від 10 до 29% таких
культур (І. І. Панишева і співроб., 1967; Franklin і співавт., 1966; Lierd і Golde,
1970).
В даний
час цей тест може служити надійним диференціальних ознакою між
патогенними та непатогенних стафілококами і в той же час може допомогти в
диференціації ступеня патогенності коагулазопозітівних штамів і, безумовно,
приверне увагу до коагулазонегатівним, але що володіє цим ферментом
культурах стафілококів і у ряді випадків дозволить віднести останні до
хвороботворним форм з більшою впевненістю. Методика визначення дезоксірібонуклеазной
активності нескладна, в основу її покладено метод Джеффріса. Готують про запас 2% МПА
(рН-8, 6), що містить ДНК (2 мг/мл середовища), розливають по флаконах та стерилізують
текучим парою протягом 30 хв. Перед розливом в чашки до середовища додають CaCIa
(0,8 мг/мл). На подс деполімеризації ДНК. Після 18-20-годинної інкубації
поверхню агару заливають 5 мл розчину IN НС1 і через 3-5 хв враховують зони
прояснення. Реакції оцінюють в хрестах.
При цьому
слід врахувати, що інтенсивність зони деполімеризації на щільному середовищі не
завжди збігається з кількістю продукції цього ферменту у досліджуваних
стафілококів в рідких середовищах. Для виявлення Фібринолізин використовують
декілька удосконалений метод Крісті за співроб. Середа Крісті-Чепмена має
наступний склад: м'ясний екстракт-0, 45 г, пептони-0, 75 г, хлористий натрій-1, 2
г, агар-2, 75 г, вода-130 мл, рН середовища == 7,0. Стерилізується в автоклаві і
зберігається про запас. Перед досвідом середу розтоплюють, остуджують до 50 ° С і
додають 15-20% стерильною цитратно людської плазми. Суміш прогрівається в
водяній бані при 65-70 ° С протягом 2 - 5 хвилин до появи ясної каламуті, а потім
розливається в чашки. Випробовувані культури засівають "плямами" по 15-20
на чашку. Посіви інкубують при 37 ° С. Враховується освіта зон просвітління
навколо колонії спочатку через 14 год, потім через 24 і 48 годин, тому що реакція
у різних культур тече неоднаково швидко і в деяких штамів вона розвивається в
більш пізні терміни. Фібринолітичний тест ми вважаємо вельми придатним для
визначення потенційної хвороботворності стафілококів, але оцінюємо тільки в
комплексі з іншими ознаками активності. Гіалуронідазная активність
визначається за методом Мак-Клину в модифікації М. Ш. Могильовського і Л. С. Коган
(1949). Розчин гіалуронат що дає в присутності 2 N оцтової кислоти типовий
згусток, розливається по 0,5 мл в стерильні пробірки. Додається 0,5 мл
добової культури стафілокока в пептонов воді. Контролю служать: гіалуропат
+ Дистильована вода і гіалуропат + незасіяні середу. Суміші перемішувати;
витримуються при 37 ° С 15-20 хв. Потім в кожну пробірку додається по дві
краплі 2 N розчину оцтової кислоти і струшується. У контролю повинен
утворитися слизовий грудочку. У досвіді при наявності гіалуронідази він
відсутній, що свідчить про деполімеризації гіалуронової кислоти
мікробним ферментом.
Для вивчення
токсигенних стафілококів зручно користуватися методом, запропонованим Ілеком і
Леві (1950), що дозволяє визначити типи гемолізинів. З цією метою готуються
чашки з живильним агаром, що містить 5% відмитих фізіологічним розчином
еритроцитів барана, кролика й людини. На поверхню живильного середовища по
діаметру поміщають стерильну смужку фільтрувального паперу, змочену
альфа-антитоксичної сироваткою. Відступивши 1-2 мл від краю смужки,
перпендикулярно до неї засівають штрихами досліджувані культури. Посіви
інкубують при 37 ° С протягом доби, після чого враховують результати.
Альфа-гемоліз проявляється у вигляді повного просвітління середовища навколо штриха
культури і нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою. Він виявляється на
середовищах з кролячими і баранячими еритроцитами Бета-гемоліз на агарі з баранячою
кров'ю дає часткове просвітлення, зона якого має буро-пурпурний
відтінок. Це "тепло-холодового" токсин і краще виявляється після
додаткового добового витримки чашок в холодильнику при температурі +4
° С по характерному пошаровому баранячих гемолізу еритроцитів і не централізується
альфа-антитоксичної сироваткою. На кролячих еритроцитах він не активний.
Дельта-гемолізини визначається по вузькій смужці гемолізу баранячих та кролячих
еритроцитів, не нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою.
Однак
освіта дельта-гемолі-зина на цих чашках може бути замаскована
дією альфа-токсину і тому його слід перевіряти на середовищах з
еритроцитами людини або коня. Таким чином, для визначення всіх 3 типів
гемолізинів досить використовувати еритроцити барана і людини або коня.
Для визначення вірулентності стафілококів існують кілька різних
методів зараження білих мишей. Найбільш простим є введення 0,1 мл
добової бульйонно культуривипробуваного стафілокока у хвостову вену. Облік
загибелі тварин здійснюється протягом 10 діб, реєструю
дельта-токсигенних. Для порівняння вірулентності стафілококових культур
можна використовувати їх здатність викликати дермонекротіческую реакцію у
кроликів. Готують 4-мільярдну суспензії добової агарового культури стафілокока
в фізіологічному розчині, а з отриманої густоти роблять розведення, щоб
отримати 2 - та 1-мільярдні суспензії. З кожного розведення в об'ємі 0,1 мл, що
складає 100, 200, 400 мільйонів мікробних тіл, вводять кролику в вистріженную
або депілірованную напередодні шкіру. На одному кролика можна одночасно поставити
до 8 внутрішньошкірних проб. Щодня відзначають прояви дермонекротіческой
реакції, а остаточно на 4-у добу. За мінімальну дермонекротіческую дозу
беруть то найменша кількість культури, яке дає некроз на 4-у добу
(Г. В. Вигодчіков, 1963).
Список
літератури
А. М. Смирнова,
А. А. Трояшкін, Е. М. Падерін: мікробіологія та профілактика стафілококових
інфекцій - "Медицина", 1977.
Стафілококові
інфекції: російський Сб науч. тр. - С.-П., 1991.
А. М. Смирнова:
питання імунології та мікробіології стафілококових і стрептококових інфекцій
- Ленинград, 1975.
Лекція по темі.
Методична розробка кафедри.
