Функціональна остеопонтіна роль у розвитку та реконструкції кісткової тканини.

З наведеного в попередній статті ( "Структура і деякі властивості білка остеопонтіна ") аналізу літературних даних випливає, що остеопонтін (OP) є секреторний фосфорілірованним сіалопротеіном, володіє широким спектром тканинної локалізації та біологічної активності. Залежно від характеру сплайсингу і посттрансляційної модифікації, OP здатний вступати в різні білок-білкові взаємодії і зв'язуватися з різними лігандами на поверхні позаклітинної матриксу, опосередковуючи адгезію і міграцію клітин. Однак, описані дослідження можливих функцій OP в ізольованих клітинах можуть служити лише як модель. Доказ біологічного значення білок-білкових взаємодій, наприклад, через демонстрацію солокалізаціі залучених компонентів, дійсно тільки коли передбачувані учасники знаходяться в тканини. Для вивчення можливої ролі остеопонтіна в процесах реконструкції кістки були підготовлені ультратонкі зрізи, використані в ході імуногістохімічних досліджень локалізації OP.

Було показано, що OP сильно збагачена поверхню кістки, звернена до "світлої" зоні остеокластів. У цій області зміст OP більш ніж у десять разів більше, порівняно з іншими ділянками кісткової тканини, за винятком поверхонь, звернених до остеобластами. Останнє спостереження було цілком очікувано, так як OP секретується остеобластами. На відміну від цього, практично не спостерігалося наявності OP на ділянках кісткового матриксу, звернених до гофрованої поверхні остеокластів, тобто там, де і має місце резорбція (Мал. 1).

Рис. 1. Схема резорбції кістки.

Найнижчий рівень присутності OP відзначався в центральній частині кістки. Отже, так як OP селективно розташований в зоні прикріплення, він швидше всього залучений до зв'язування остеокластів (Cheng S. et. al 2001). Цікаво відзначити, що інші білки, присутні в кісткової тканини і здатні пов'язувати клітини (фібронектину і BSP), не містяться у великих кількостях в описаних вище ділянках локалізації OP.

Для підтвердження ролі OP як якоря для початкового прикріплення остеокластів до поверхні кістки, за допомогою імунохімічної фарбування був локалізована avb3-рецептор, що міститься на плазматичною мембрані з боку "світлої" області остеокластів, тобто навпроти місця розташування OP. Це є суттєвим доказом зв'язування OP з цим типом рецепторів. У той же час, при проведенні даних досліджень були виявлені добре диференційовані, охарактеризовані остеокласти, які можуть становити більш пізню стадію диференціювання, ніж приєдналися спочатку нерезорбірующіе остеокласти. Таким чином, отримані результати не давали однозначної відповіді на питання про те, чи є OP первинним лігандом для зв'язування остеокластів (Denhardt, DT and Noda M., 1998).

Як показали подальші дослідження, у що володіють обмеженою активністю остеокластів хворих остеопетрозом щурів існує лише невелика розвиток гофрованої поверхні. Однак, при цьому ступінь адгезії остеокластів зберігається. Також у цьому випадку був показаний нормальний рівень присутності avb3-рецептора переважно в районі "світлої" області остеокластів. На наступних стадіях досліджень, з використанням приготованих кріомікротомних зрізів, було показано відсутність будь-яких інших типів інтегрінових рецепторів на їх плазматичної мембрані. Так, не було виявлено ні b1, ні b5 видів ланцюгів інтегринів. Це підтверджує особливу роль OP і avb3-інтегринів в розвитку і приєднання даного типу клітин. Цікаво, що avb3-інтегринів швидше за все специфічний для остеокластів, тому що дослідження виявили вкрай низький рівень накопичення цього типу інтегринів в остеобластів. Таким чином, узагальнені дані показують, що остеокласти, по крайней мере, добре диференційовані, приєднуються до кістки "світлої" зоною і зв'язуються через avb3-інтегринів з локалізованими на мінералізованою кістковому матриксі OP. Додатковим доказом ролі OP у приєднанні остеокластів через RGD-залежне зв'язування з avb3-інтегринів є і встановлений факт пригнічення резорбції кістки RGD-пептидом, а також містять у первинній структурі сайт RGD поліпептидом ехістатін (Denhardt DT and Noda M., 1998).

Подальші дослідження були проведені за допомогою in situ гібридизації та електронної мікроскопії. На підтримку ролі OP в резорбції кістки говорив високий рівень накопичення мРНК OP в остеобластів в області метафіза, де активність остеокластів найбільш яскраво виражена при зростанні кістки. Більш того, присутність мРНК OP часто спостерігається в остеобластів, локалізованих поруч з остеокластів. При цьому в самих остеокластів присутності OP мРНК не відзначалося. Цікаво, що іммуномеченний OP НЕ детектувала в секреторних везикул, розташованих з боку світлої зони мають секреторні дисфункції остеокластів з хворих остеопетрозом щурів. Ці спостереження показують, що остеокласти, по крайней мірою, на стадії диференціації, не є суттєвим джерелом OP, локалізованого на поверхні кістки. Було б також цікаво розглянути вплив зв'язування OP з avb3-інтегринів на процес диференціації остеокластів на ранніх стадіях (Denhardt DT and Noda M., 1998).

Представляється досить імовірним, що при зв'язуванні через avb3-інтегринів з мінералізованою поверхнею кістки, мононуклеарні попередник остеокластів отримує регуляторний сигнал, що призводить до його поляризації і диференціювання. Швидше за все, остеокластів приєднується за допомогою "світлої" зони до області взаємодії. При подальшому розвитку поляризації з'являється регіон рифлення і зони резорбції (див. Рис. 1). На підтримку цієї версії свідчить і сильний розвиток "світлої" області остеокластів з нормальним рівнем avb3-інтегринів і OP у щурів, хворих остеопетрозом. У той же час, гофрована поверхня не розвивається задовільно, як і можна очікувати, виходячи з обмеженою здатності до резорбції остеокластів при цьому захворюванні.

Нормально локалізовані і диференційовані остеокласти секретують тартрат-стійку кислу фосфатазу (TRAP), присутність якої було встановлено за допомогою імунного фарбування золотом (Ihara H. et. al, 2001). TRAP найбільш збагачена гофрована поверхню, але вона практично не виявляється у світлій зоні (див. Рис. 1). Це узгоджується з ранніми даними про секреції цього ферменту остеокластів. При цьому виникло питання про можливу роль цієї фосфатази поза клітиною. Згодом, були проведені пошуки можливих субстратів цього ферменту серед доступних фосфопротеінов клітинного матриксу. Було показано, що TRAP може дефосфоріліровать in vitro три кісткових білка: OP, BSP і остеонектін. При вивченні наслідків дефосфорілірованія OP було виявлено, що дефосфорілірованний OP не здатний підтримувати зв'язування остеокластів. Це спостереження може свідчити про потенційний механізмі від'єднання клітин при переході до наступної стадії резорбції. На цій стадії число вже дефосфорілірованних і, отже, не здатних підтримувати зв'язування молекул OP складає велику частину загальної кількості цього білка. Отже, сумарний взаємодія остеокластів і OP виявляється занадто слабким, щоб вони залишалися у зв'язаному стані. Таким чином, отримані за останні час факти переконливо доводять, що OP є одним з важливих білків, залучених до резорбцію кістки (Ishijima M. et al., 2001).

Представляється можливим, що OP, як і інші білки, може мати більш ніж одну функцію в кісткової тканини (Boskey A. et al., 2000). Так, раніше за допомогою імуногістохімічного фарбування тканин було показано, що OP накопичується у мінералізованою фронту кістки. Цікаво відзначити, що хоча OP і BSP і мають схожі загальні властивості, при проведенні аналогічного дослідження зразок зрізу з фарбуванням BSP суттєво відрізнявся: цей білок не показав такого розподілу. Можливо, що локалізований на даній ділянці OP служить для регулювання процесу мінералізації. Отримані раніше групою Goldberg з співр. (Hunter G., Kyle C., Goldberg H., 1994) результати показали, що OP може пригнічувати ріст кристалів гідроксиапатиту в модельних системах. Цікаво, що дефосфорілірованний лужної фосфатазою OP не інгібує формування гідроксиапатиту в цих системах in vitro. Дане спостереження дозволяє зробити висновок про потенційно різних ролях дефосфорілірованного OP c інтактним в процесі перетворення кістки. Можливо, що OP дійсно має кілька функцій: як у регуляції мінералізації скелета, так і в розробці вже сформованого кісткового матриксу.

Цікаво, що дослідження ролі OP в реконструкції кістки, проведені на модельних тварин (миші OP-), показали принципову можливість використання рекомбінантного OP для активізації процесів резорбції і відновлення кісткової тканини (Ishijima M. et al., 2001), що вкрай важливо при лікуванні травм або спадково обумовлених порушень розвитку кістки. До жаль, цілий ряд питань, пов'язаних зі структурно-функціональними аспектами дослідження OP, залишаються невивченими. Це, перш за все, стосується механізмів внутрішньоклітинної регуляції біосинтезу різних ізоформ даного білка і молекулярних основ їх функціонування.

Слід особливо підкреслити, що вивчення структури і функцій OP, його локалізації представляє важливий етап у дослідженні процесів остеогенезу. Отримана при цьому інформація може реально допомогти при лікуванні захворювань, що супроводжуються такими явищами як остеопенія і остеомаляція (Остеосаркома, остеопороз, остеопетроз) через використання спеціальних конкурентних аналогів OP або, навпаки, модуляторів експресії гена OP.

Список літератури:  Cheng S., Lai C., Blystone S., Avioli L. Bone mineralization and      osteoblast differentiation are negatively modulated by integrin avb3.// J.      Bone Miner Res., 2001., V. 16., P. 277-288.  Denhardt, D.T., and Noda, M. Osteopontin expression and function:      role in bone remodeling.// J. Cell. Biochem. Suppl., 1998, V.30, V. 92-102.        Ihara H, Denhardt DT, Furuya K, Yamashita T, Muguruma Y, Tsuji K,      Hruska KA, Higashio K, Enomoto S, Nifuji A, Rittling SR, Noda M.      Parathyroid hormone-induced bone resorption does not occur in the absence      of osteopontin.// J. Biol. Chem., 2001, V. 276, P. 13065 - 13071.  Ishijima M, Rittling S, Yamashita T, Tsuji K, Kurosawa H, Nifuji      A, Denhardt D, Noda M. Enhancement of osteoclastic bone resorption and      suppression of osteoblastic bone formation in response to reduced      mechanical stress do not occur in the absence of osteopontin.// J. Exp.      Med., 2001, V. 193, P. 399 - 404.  Boskey A, Spevak L, Tan M, Doty SB, Butler WT.Dentin sialoprotein      (DSP) has limited effects on in vitro apatite formation and growth.//      Calcif. Tissue Int., 2000, V. 67., P. 472 - 478.  Hunter G., Kyle C., Goldberg H. Modulation of crystal formation by      bone phosphoproteins: structural specificity of the osteopontin-mediated      inhibition of hydrixyapatite formation// Biochemistry J., 1994., V. 300.,      P. 723 - 728.