Зміст глутамінової кислоти в камерній вологи у хворих первинної відкритокутовій глаукомою
Glutamic acid concentration in aqueous humor of open angle glaucoma patients
By many authors glutamate renders neurotoxic effect on retinal ganglion cells. It is possible that glutamic acid
concentration increase in eye tissues with primary open angle glaucoma (POAG) plays an important role in optic nerve glaucoma atrophy pathogenesis.
Aqueous humor of 10 patients with POAG were taken during cataract extraction and examined. The quantities of glutamic acid were
determined by chromatographic method.
Glutamic acid concentration in aqueous humor of control group was 28.6 ± 1.6 mkg/ml and in group with POAG - 84.9 ± 28.7 mkg/ml.
The difference wasn't statistically reliable. Thus there is a tendency to glutamic acid concentration increase in eyes with POAG.
Р ЕЗУЛЬТАТИ досліджень останніх років суттєво вплинули на
уявлення про патогенез глаукоматозной атрофії зорового нерва - глаукоматозной оптичної нейропатії.
Було встановлено, що характерним проявом глаукоматозной оптичної нейропатії є апоптоз - загибель гангліозних
клітин сітківки. Quigley [6] вважає, що пошкоджений, можливо, внаслідок високого ВГД, аксон гангліозних клітини сітківки не несе достатньої
інформації, що призводить до активації механізмів природної загибелі клітини. Можливо, ці процеси активізуються недостатністю кровотоку в судинах
очі при підвищеному ВГД. Було показано, що одночасно з цим є значне збільшення вмісту глутамінової кислоти (глутамата) в
склоподібному тілі хворих первинної відкритокутовій глаукомою (ПОУГ). Глутамат є основним нейромедіатором центральної нервової системи і сітківки. У той же час підвищення
концентрації глутамата вище фізіологічного рівня несе в сітківці блокаду межнейрональной передачі нервових імпульсів і поєднується з селективним апоптозом
гангліозних клітин сітківки через нейротоксичної дії глутамата [5]. Brooks D.E. et al. [7] виявили в собачих очах з експериментально
викликаної глаукомою підвищений вміст вітреального глутамата, триптофану і низький вміст гліцину в порівнянні з контролем. На думку авторів, висока
концентрація глутамата токсична для гангліїв сітківки і доводить ішемічний механізм порушень, що відбуваються в клітинах сітківки.
Сама по собі ідея про нейротоксичної дії глутамата на нервову тканину, зокрема, на гангліозних клітини сітківки,
запозичена з неврологічної практики. Неврологи близько 20 років надають значення великим концентрацій даного трансмітера у розвитку такої патології,
як хвороба Альцгеймера, розсіяний склероз, деменція, аміотрофічний бічній склероз та інші [4]. Підвищений вміст глутамата в склоподібному тілі
хворих глаукомою, загибель гангліозних клітин сітківки під його впливом в дослідах на щурах дозволили EB Dreyer і співавт. [6] припустити, що цей
механізм їх загибелі має місце і при ПОУГ. Однак причина внутрішньоклітинного випуску глутамата не повністю зрозуміла. E.B. Dreyer і співавт. [6] вважають, що,
можливо, високий внутрішньоочний тиск призводить до виходу глутамата у внутрішньоклітинні простору, викликаючи загибель клітин, який токсичний для
гангліозних клітин. Другий імовірною причиною загибелі клітин, на думку авторів, є збій у ферментних системах, відповідальних за руйнування даного
нейромедіатора після виходу його з синапсів. Труднощі підтвердження цих поглядів полягає в тому, що дуже важко перевірити дані факти на «живому»
оці, однак безсумнівно, що великі концентрації гутамата токсичні для нервової тканини.
З огляду на вищесказане, метою нашого дослідження було виявлення глутамата у хворих ПОУГ.
Матеріали та методи дослідження
Дослідну групу склали 10 хворих ПОУГ (6 чоловіків, 4 жінки, середній вік - 74 роки), у яких забиралася камерна
волога під час екстракапсулярной екстракції катаракти з антіглаукоматозним компонентом. 8 хворих були з розвинутою стадією ПОУГ, 2 з далекозашедшей.
Контрольну групу склали хворі з старечої катарактою - 14 пацієнтів (11 чоловіків, 3 жінки, середній вік - 68 років). Основна і контрольна групи
були порівнянні за віком та супутніх соматичних захворювань.
В основу методу покладені описані Боде і Гирі методи кількісного визначення амінокислот у вигляді мідних похідних з
нінгідрідіном після хроматографічного їх поділу на папері у нашій модифікації [1].
1. Підготовка проби для аналізу. Проби камерної рідини об'ємом 0,1-0,2 мл зважують на
аналітичних вагах, упарюють насухо на водяній бані при 40 ° С в скляних мікрочашках, використовуючи плаваючий штатив. Сухий залишок розчиняють у 0,05 мл
дистильованої води.
2. Отримання одновимірних хроматограм камерної рідини очі. 20 мкл
отриманих розчинів порціями по 5 мкл за допомогою автоматичної піпетки наносять на хроматографічних папір марки «швидка» розміром 2 x 27 см.
Хроматографірованіе проводять низхідним методом два рази в одному напрямку спочатку в суміші розчинників I, потім два рази на суміші II. Суміш I:
н-бутиловий спирт, крижана оцтова кислота, дистильована вода (4: 1: 5). Суміш II: н-бутиловий спирт, крижана оцтова кислота, дистильована вода
(40: 15: 5). Після кожного пропускання розчинника папір висушують на повітрі і знову поміщають в хроматографічних камеру. Час проходження
розчинника в одному напрямку 7 годин. Висушену хроматограм занурюють на кілька секунд в 0,5% розчин нінгідріна в ацетоні, просушують протягом
декількох хвилин на повітрі і підігрівають 10 хвилин в сушильній шафі при 50 ° С для розвитку забарвлення. Плями амінокислот стають більш чіткими через добу,
тому визначення кількісного вмісту амінокислот слід проводити на наступний день.
3. Кількісне визначення глутамінової кислоти в камерній рідини очі.
Фіолетові плями, відповідні глутамінової кислоті, вирізують, розрізають на дрібні шматочки і поміщають в мікропробіркі, що містять 0,25 мл спиртового
розчину сульфату міді. Фіолетова забарвлення переходить в оранжево-червону в результаті утворення мідного похідного амінокислот з нінгідріном.
Екстракцію продовжують протягом однієї години при кімнатній температурі. Інтенсивність забарвлення вимірюють на фотоелектроколориметр Humalyzer 2000 при
довжині хвилі 505 нм в мікрокюветах проти контрольної проби на папір. Розрахунки за змістом амінокислоти проводять по каліброване графіком, отриманим з
стандартними розчинами глутамінової кислоти.
4. Побудова калібрувального графіка. Готують розчини глутамінової кислоти 0,001 М, 0,00075 М,
0,0005 М, 0,000375 М, 0,00025 М. На папір наносять по 20 мкл розчинів. Розрахунок проводять за формулою:
А = (С x 5 x 10-2)/V
А - концентрація глутамінової кислоти в камерній вологи (мкг/мл); C - зміст глутамінової кислоти, знайденої по
каліброване графіком (мкг/мл); V - об'єм проб (мл).
Результати дослідження та обговорення
Зміст глутамата камерної вологи в контрольній групі склало 28,6 ± 1,6 мкг/мл, при ПОУГ - 84,9 ± 28,7 мкг/мл (різниця
статистично недостовірна, p> 0,05).
Хоча нами і не отримано статистично достовірних відмінностей у змісті глутамата у хворих ПОУГ і віковий катарактою, однак
є явна тенденція до більш високої концентрації даного нейромедіатора в камерної вологи хворих ПОУГ. У 5 з 10 хворих ПОУГ зміст глутамата в
камерної вологи було значно вище, ніж в контрольній групі і коливалася в межах від 37,6 мкг/мл до 260,3 мкг/мл.
У хворих старечої катарактою найвища концентрація глутамінової кислоти склала всього 33 мкг/мл.
Участь деяких нейромедіаторів в регуляції офтальмотонуса показано в роботах А.В. Мягкова [2,3], який довів вплив
опіоїдних пептидів на підвищення ВГД, впливаючи електричними коливаннями і хімічними подразниками на мигдалеподібної комплекс. В результаті отриманих
даних не можна не погодитися з гіпотезою посилення апоптозу гангліозних клітин сітківки при ПОУГ внаслідок накопичення в них глутамінової кислоти. Однак
ця гіпотеза вимагає подальшого вивчення.
Проведені дослідження вперше дозволили виявити глутамінової кислоти в камерній вологи у хворих ПОУГ. Зміст
глутамата у хворих ПОУГ вище, ніж в контрольній групі.
Література:
1. Медичні лабораторні технології і діагностика: Медичні лабораторні технології. Довідник у 2 томах/Под ред. А.М.
Карпіщенко// мікрометодом визначення вільних амінокислот у сироватці крові за допомогою хроматографії на папері. Т.2. - С-Петербург, «Інтермедіка», 1999. - С.
106-109
2. Мягков А. В. Вплив пунктурних впливів на офтальмогіпертензію, викликану електричної та хімічної стимуляцією
мигдалеподібного комплексу: Авореф. дисс. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук. - Казань, 1997 - 21 с.
3. Мягков А.В. Участь опіоїдних пептидів в центральній регуляції внутрішньоочного тиску та гідродинаміки очі// Тез.
Доповідей 7с'езда офтальмологів Росії. - М., 2000 .- С.175-176.
4. Пляхін І.В. Біохімічні основи поновлювані клітинної смерті.// Міжрегіональний збірник наук. Трудів/Біохімія на рубежі
XXI століття. - 2000 .- Рязань. - С.173-177.
