Сучасні підходи до діагностики папіломавірусної інфекції геніталій у жінок

Сучасні підходи до діагностики папіломавірусної інфекції геніталій у жінок та їх значення для скринінгу раку шийки матки

C реді захворювань, що передаються статевим шляхом, особливе значення має папіломовірусна інфекція (ПВІ) геніталій, збудником якої є вірус папіломи людини (ВПЛ). Це пов'язано з трьома основними аспектами. По-перше, частота розповсюдження інфекції є високою. Число інфікованих у світі за останнє десятиріччя збільшилася більш ніж у 10 разів [1]. По-друге, ПВІ надзвичайно складна для діагностики, особливо її латентна форма, при якій, незважаючи на наявність вірусів, морфологічних змін у тканині не спостерігається [2]. У більш ніж 15% жінок виявлено ВПЛ у шийці матки, хоча клінічна симптоматика захворювання була відсутня [3]. По-третє, ВПЛ розглядається як етіологічний фактор в розвитку раку шийки матки [4]. У всьому світі рак шийки матки посідає друге місце серед злоякісних новоутворень у жінок [3, 4].
Діагностичні методи, спрямовані на виявлення ПВІ, могли б збільшити ефективність первинного та вторинного скринінгу раку шийки матки [5]. Особливу увагу викликають сучасні методи, спрямовані на діагностику латентної ПВІ і ранніх передракових уражень шийки матки.
ПВІ підрозділяють на клінічну, субклінічній і латентну форми [6]. Клінічна форма ПВІ є причиною відповідних симптомів у пацієнтів і видима "неозброєним оком". Проявом клінічної форми є генітальні бородавки (гострі, плоскі або ендофітний кондиломи) [1, 7].
Субклінічна форма не супроводжується симптомами, але може бути діагноcцірована при кольпоскопії або мікроскопічному дослідженні тканини [8, 9]. Морфологічні зміни шийки матки, що викликаються ВПЛ, являють собою спектр передракових уражень, які, у свою чергу, позначаються як цервикальная інтраепітеліальна неоплазія (cervical intraepithelial neoplasia - CIN) або дисплазія [10], здатна прогресувати в плоскоклітинний карциному. Класифікація, запропонована Національним інститутом з вивчення раку США (Bethesda system, 1988 р., переглянута в 1991 р.), підрозділяє плоскоклітинні інтраепітеліальних поразки (squamous intraepithelial lesions - SIL) на дві категорії: низької і високого ступеня тяжкості (low & high grade) [11]. Клітинні елементи, які важко піддаються класифікації, іменуються як атипові клітини плоского епітелію невизначеного значення (atypical squamous cell undetermined significance - ASCUS). Плоскоклітинні інтраепітеліальних ураження низького ступеня тяжкості об'єднують цитологічні зміни, що вказують на слабку дисплазію (CIN I) і ВПЛ-індуковані морфологічні зміни (койлоцітотіческая атипія) [11]. SIL високого ступеня тяжкості включають помірну дисплазію (CIN II), важку дисплазію і карциному in situ (CIN III). SIL високого ступеня тяжкості зустрічаються рідко [10]. Хоча SIL високого ступеня тяжкості частіше прогресують в рак в порівнянні з SIL низького ступеня тяжкості, вони можуть спонтанно регресувати, навіть якщо були викликані високоонкогенними серотипами ВПЛ (16,18 та іншими) [12]. Більш ніж у 25% жінок з SIL низького ступеня тяжкості спостерігається прогресія в SIL високої ступеня тяжкості протягом 4 років [2]. Отже, при субклінічній формі ПВІ важливо діагносціровать різні морфологічні зміни шийки матки.
Латентна форма не може бути діагносцірована кольпоскопічні, цитологічних та гістологічних [8, 9]. Проте присутність ВПЛ в біоптатів шийки матки при латентній формі інфекції можна визначити по наявності ДНК-вірусу [13]. Для цієї мети найчастіше застосовуються такі методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), Hybrid Capture (метод на основі гібридизації в розчині) [14, 15]. Ці методи дозволяють визначити серотип вірусу, що має значення для прогнозу подальшого розвитку захворювання.
Методи діагностики ПВІ можуть бути розділені на класичні, включаючи цитологічний метод, гістологічне дослідження біоптатів, кольпоскопію, визначення антитіл до ВПЛ і сучасні методи, що підрозділяються на неампліфікаціонние: (Southern blot, Dot blot, гібридизація in situ, ПЛР) і ампліфікаціонние: Hybrid Capture.
Найбільш значущими характеристиками діагностичного тесту для скринінгу є чутливість, прийнятність, легкість у виконанні, гарна відтворюваність, безпека у використанні і низька вартість [10]. У зв'язку з цим не всі перераховані методи отримали широке розповсюдження як в Росії, так і за кордоном.
Найбільш повно даним вимогам відповідає цитологічне дослідження.
Цитологічне дослідження. За кордоном використовується фарбування мазків по Папаніколау (Pap-мазки) [8]. Це дослідження дозволило істотно знизити рівень розвитку раку шийки матки, особливо в розвинених країнах [16, 17]. У нашій країні поширене фарбування мазків за методом Романовського - Гимзе [8]. Використання цього цитологічного аналізу в скринінгових цілях вимагає поглибленого вивчення.
Критерієм ПВІ при цитологічному дослідженні шеечной мазків є наявність у них койлоцітов (клітини з великою зоною просвітління навколо ядра) і діскератоцітов (клітини зі збільшеним темним пікнотіческім ядром з поверхневих зроговілому шарів багатошарового плоского епітелію) [9, 11].
Проте не слід забувати про наступні істотних недоліки цитологічного дослідження: 1) аналіз дозволяє діагносціровать тільки клінічну і субклінічної форми інфекції; 2) Існує можливість появи помилково негативні результати при наявності плоскоклітинний інтраепітеліальних уражень високого ступеня тяжкості (у мазок потрапляють частіше всього поверхневі клітини плоского епітелію, а койлоцітоатіпія може спостерігатися в більш глибоких шарах багатошарового плоского епітелію); 3) чутливість цитологічних методів для виявлення уражень шийки матки варіює від 50 до 80%, що може бути частково компенсовано повторенням тесту через короткі проміжки часу [6, 10].
Кольпоскопія. При визначенні в цитологічному мазку діскаріотіческіх клітин необхідно кольпоскопічне дослідження з метою підтвердження або виключення існування передракових уражень [11].
Гострі кондиломи мають характерну кольпоскопічні картину. Поразка є білясті епітеліальні освіти з пальцеобразнимі виростамі, що додають їм неправильну форму. Найбільш важливим діагностичним критерієм служить наявність правильної капілярної мережі в виростах, яка виявляється після обробки місця ураження 3% розчином оцтової кислоти [6, 9].
Кольпоскопія розглядається як найбільш чутливий клінічний метод визначення субклінічній форми ПВІ [11]. При субклінічній формі ПВІ шийки матки атипова зона трансформації характеризується такими кольпоскопічні картинами, як ацетил-білі поразки, мозаїка, пунктація або лейкоплакія [9]. Субклінічна форма ПВІ може бути диференційована від інтраепітеліальної неоплазії за наступними критеріями: ураження можуть мати блискучий білий колір, зморщену поверхню, маленькі межкапіллярние відстані, чітку межу між вогнищем ураження та прилеглими тканинами, атипові судини [9, 11]. Проте навіть для досвідченого кольпоскопіста диференціальна діагностика субклінічній формою ПВІ та CIN I може бути скрутній. Прийнято вважати, що однією з ознак плоских кондилом є нерівномірне поглинання епітелієм водного розчину Люголя, що відрізняє його від атипові епітелію, що не містить глікоген [1].
За даними G. Gross і R. Barrasso [11], кольпоскопію можна розглядати не як діагностичний метод, а як дослідження, що дозволяє оцінити розміри ураження і його локалізацію на межі плоского і циліндричного епітелію, рідше використовувати діагностичну Конізація і виключити інвазивний рак. Крім того, кольпоскопія використовується для проведення діагностичних біопсій в області стику багатошарового плоского і циліндричного епітелію, тобто у найбільш важкодоступних для огляду місцях шийки матки.
Проведення кольпоскопічні орієнтованої біопсії дозволяє збільшити точність діагностики передракових станів шийки матки на 25% [11].
Гістологічне дослідження. При гістологічному дослідженні ураження шийки матки рідко бувають однорідними і можуть спостерігатися всі ступені диспластичних змін [11]. Субклінічна форма ПВІ супроводжується такими морфологічними особливостями, як акантоз, гіперплазія клітин базального і парабазальних шару багатошарового плоского епітелію, пара-або гіперкератоз, клітинні елементи з койлоцітотіческой атипія [9]. Дані критерії характеризуються різноманітністю щодо діагностики субклінічній форми ПВІ. Про це свідчать дані про відсутність єдиної думки при дослідженні біоптірованной тканини [7].
При виникненні морфологічних ознак малігнізації встановлено, що зміни, характерні для ПВІ, зменшуються (наприклад, койлоцитоз, продукція капсидних антигену), у той час як патологія ДНК (анеуплоідія) і кількість патологічних мітозів наростає [11].
Визначення антитіл ВПЛ. Виявлення того факту, що вірус папіломи бика (який можна зберегти в культурі тканини) має спільні антигенні властивості з ВПЛ, привело до можливості використання широкого спектру антитіл для підтвердження присутності вірусних протеїнів у мазках і біоптатів шийки матки [17].
Дослідження, проведені в останні роки, дозволили визначити антитіла до певних серотипами ВПЛ, а також серореактівние області всередині відповідних протеїнів [18]. При клінічній формі ПВІ були виявлені антитіла до ВПЛ типу 11 у сироватках пацієнтів з генітальними бородавками і папіломами гортані. Для ВПЛ типів 6, 11, 16, 18 і 33, що вражають статеві органи, були ідентифіковані серореактівние області всередині L1 і L2 протеїнів [17, 19]. Крім того, виявлялися серореактівние області в протеїнах Е4 і Е7 ВПЛ [19].
Виявлення ДНК ВПЛ (молекулярно-біологічні методи). У наші дні в основному використовують два основних тесту: ПЛР і метод Hybrid Capture [16, 20]. Технологія методу Hybrid Capture була розроблена фірмою "Digene" (США), тому його іноді називають "Digene в мире". Він полягає в ДНК гібридизації в розчині з наступною сорбції на полістероловой планшеті [20]. З застосуванням цих тестів стало можливим визначення більш ніж 70 різних типів ВПЛ, але для клініки перспективним є виявлення тільки канцерогенних типів [3]. Застарілі тести, такі як Southern blot і Dot blot, використовуються вкрай рідко [21].
Оцінка клінічного застосування скринінгових діагностичних методів Дослідження Кількість пацієнтів з диспластичними змінами шийки матки/загальне число пацієнтів Метод % Чутливості тесту Показання мазків J. Cox і співавт. (1995) [23]

15/217 Кольпоскопія

100

ASCUS Рар-мазок

73 Гібридизація

93 Рар + Гібридизація

100

T. Wright і співавт. (1995) [14]

50/398 Кольпоскопія

100

ASCUS або SIL Рар-мазок

80 Гібридизація

78 Рар + Гібридизація

K. Hatch і співавт. (1995) [24]

126/311 Кольпоскопія

100

SIL Рар-мазок

75 Гібридизація

74 Рар + Гібридизація

91 S. Hall і співавт. (1996) [25]

15/75 Кольпоскопія

100 ASCUS або SIL Рар-мазок

87 Гібридизація

93 Рар + Гібридизація

100 A. Ferenczy і співавт. (1996) [15]

47/364 Кольпоскопія

100 ASCUS або SIL Рар-мазок

87 Гібридизація

77 Рар + Гібридизація

ДНК ВПЛ може бути визначена після збільшення числа генів вірусної послідовності шляхом ПЛР [20]. Метод, заснований на ПЛР, в даний час є найбільш широко застосовуваним і виявляє від 10 до 100 копій генома ВПЛ. Однією з умов, що визначає ефективність даного методу, є підбір оптимальних нуклеотидних праймерів, що пов'язано з певними труднощами в нашій країні. Продукти ПЛР визначаються з тіпоспеціфіческімі зондами, використанням Dot blot гібридизації, Southern blot гібридизації або тифу (твердофазного імуноферментного аналізу) на поліестеролових планшетах [20].
Чутливість методів, заснованих на ПЦР (наприклад, назад транскріптазная полімеразна реакція), настільки велика, що дозволяє визначити Е6 і Е7 онкогенні транскрипти ВПЛ типу 16 навіть у тих зіскрібків шийки матки, в яких не визначалися диспластичні зміни епітелію [22].
Сучасна, так звана сендвіч-гібридизація в розчині на основі ІФА (імуноферментний аналіз) стає все більш доступною (тест Hybrid Capture). Цей тест здатний розрізнити наявність ВПЛ серотипів "низького ризику" та "високого ризику" малігнізації [14]. Гібридизація in situ може проводитися з збільшити або без такого числа генів вірусної ДНК. Даний метод дозволяє визначити місце вірусного генома в інфікованих клітинах і топографічну локалізацію вірусу [14, 21]. Однак подібні біологічні тест-системи є дорогими.
Представлені діагностичні методи мають як очевидні переваги, так і недоліки. Виходячи з цього, найбільш адекватними для скринінгу є три тести: цитологічний, кольпоскопічні і ВПЛ-тестування методом гібридизації [10]. Багато авторів рекомендують комбінувати дані методи в залежності від клінічної ситуації [5, 10]. ВПЛ-тестування саме по собі може розглядатися як альтернативний тест при встановленні стратегії первинного скринінгу [10]. J. Cox і співавт. [23] пропонують використовувати ВПЛ-тестування в комбінації з цитологічним тестом при первинному скринінгу з метою зниження ризику втрати поразок типу SIL високого ступеня тяжкості і раку. Таким чином, концепція первинного скринінгу полягає в наступному:
• використання тільки цитологічної діагностики для жінок молодше 30 років,
• ВПЛ-тестування і цитологічне дослідження шеечной мазків у жінок старше 30 років.
Така політика визначається тим фактом, що у жінок молодше 30 років більше 70% уражень, викликаних ВПЛ, регресують спонтанно, тоді як у жінок середнього віку, у зв'язку з персистенцією вірусу, поразки регресують значно рідше [10].
При проведенні вторинного скринінгу, крім цитологічного дослідження, особливу роль відіграє кольпоскопія. Це пов'язано з можливістю кольпоскопічного визначення різних стадій субклінічній ПВІ, у тому числі поразок SIL низького ступеня тяжкості. При цьому застосування ВПЛ-тестування дозволяє ідентифікувати жінок з SIL низького ступеня тяжкості, які мають ризик розвитку уражень більш високого ступеня тяжкості [10, 21].
Клінічне застосування скринінгових діагностичних методів може бути розглянуто на основі п'яти досліджень, проведених в США в 1995 -- 1996 рр.. [21]. Для дослідження були відібрані пацієнтки з атипові клітини плоского епітелію невизначеного значення (ASCUS) або плоскоклітинний інтраепітеліальних поразками (SIL) низького ступеня тяжкості, підтвердженими цитологічних. Узагальнені результати дослідження представлені в таблиці. Особливу увагу було звернуто на чутливість тестів при CIN, які підтверджувалися кольпоскопічні.
Як видно з таблиці, чутливість Рар-мазків еквівалентна чутливості гібридизації в розчині. При цьому одні дослідження показують перевагу Рар-мазків, інші - методу гібридизації. У всіх дослідженнях комбінація Рар-тесту і гібридизації в розчині була ефективніше, ніж використання кожного методу окремо. Їх комбінована чутливість була більше 95%, що досить важливо для скринінгу раку шийки матки. Хоча кольпоскопія є найбільш чутливим методом, для визначення диспластичних поразок потрібно на 30% більше повторних кольпоскопічні досліджень, ніж при інших методах [14, 15, 23 - 25].
Таким чином, доступність ампліфікаціонних методів діагностики ВПЛ дозволила оцінити потенційну роль ВПЛ-тестування в клінічній практиці. Ця оцінка полягає в можливості прогнозування процесу перебігу ПВІ внаслідок ідентифікації низько-і високоонкогенними серотипів ВПЛ.
Сучасні підходи до діагностики папіломавірусної інфекції геніталій засновані на комбінації класичних методів: цитологічного і кольпоскопічного досліджень і сучасного ВПЛ-тестування методом гібридизації в розчині, що дозволяє істотно збільшитьь ефективність первинного та вторинного скринінгу раку шийки матки.

Література:

1. Роговская С.І. Папіломовірусна інфекція геніталій. Клініка і лікування. Захворювання шийки матки. Клінічні лекції. М. 1997; 46-51.
2. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Human Papillomaviruses. Vol. 64. Lyon: IARC, 1995.
3. Franco EL, Villa LL, Richardson H, Rohan TE, Ferenczy A. Epidemiology of Cervical Human Papillomavirus Infection. In: Franco E. & Mosonego J., editors. New Developments in Cervical Cancer Screening and prevention. Oxford: Blackwell Science. 1997:14-22.
4. Critchlow CW, Koutsky LA. Epidemiology of human papillomavirus infection. In: Mindel A., editor. Genital warts. Human papillomavirus infection. London. Edward Arnold. 1995:53-81.
5. De Wolf CJM.: Organization and Resalts of Cervical Canser Screening in Europe Over the Past 20 Years. In: Franco E. & Mosonego J., editors. New Developments in Cervical Cancer Screening and prevention. Oxford: Blackwell Science. 1997:209-19.
6. Краснопольський В.І., Радзінський В.Е., Буянова С.Н., Манухін І.Б., Кондріков Н.І. Патологія піхви і шийки матки. М.: Медицина, 1997,128-35.
7. Головіна Л.І. Кольпоскопічне і цитологічна оцінка плоских кондилом та їх зв'язку з інтраепітеліальної неоплазією шийки матки. Дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук - С-П. 1994.
8. Прилепська В.Н. Вікові особливості шийки матки. Сучасні методи діагностики патології шийки матки. Акуш. і гін.1998; 6:51-4.
9. Прилепська В.Н., Роговская С.І., Межевітінова Е.А. Кольпоскопія. Практичний посібник. М. 1997.
10. Coutlee F, Mayrand MH, Provencher D. The future of HPV testing in clinical laboratories and applied virology research. J. Cl & Diagn Virol 1997; 8:123-41.
11. Gross GE. & Barrasso R. Humman Papilloma Virus Infection. A Clinical Atlas.1997