зміст

1. ВСТУП 3

2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 6

3. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

3.1. Матеріал дослідження 29

3.2. Методи дослідження 29

4. РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

4.1. Кількісне вміст гемоглобіну та основних білків мембран еритроцитів людини. 34

4.2. Взаємне варіювання кількісної показності окремих білків еритроцитів людини. 36

4.3. Обговорення 39

5. ВИСНОВОК 40

6. ВИСНОВКИ 41

7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 42

Введення

Мембрана еритроцита протягом довгого часу представляласядослідникам лише оболонкою, що відокремлює гемоглобін від плазми. Рольмембрани в функціонуванні цієї високо спеціалізованої клітини,здавалося, обмежується лише здатністю бути проникною для газівкрові. Проте успіхи, досягнуті в мембранології за останні роки і,Зокрема, вивченні мембрани еритроцита ссавців за допомогоюбіохімічних та біофізичних методів, примушують в даний час по -іншому поглянути на роль мембрани в роботі клітини. Сукупність наявних влітературі даних дозволяє зробити висновок про те, що плазматичнамембрана еритроцита - найважливіший елемент клітини; вона одночасно є імеханічної оболонкою з регульованими фізичними властивостями, і
"диспетчерської" клітки, що здійснює координацію роботи клітини взалежно від фізичних і хімічних сигналів, що надходять до неї ворганізмі. [9]
Найважливіші компоненти біологічних мембран - білки, які здійснюютьїх специфічні функції. Одні з них забезпечують транспорт певнихмолекул всередину клітини або з неї, інші є ферментами і каталізуютьасоційовані з мембраною реакції, третій здійснюють структурну зв'язокцитоскелету з позаклітинним матриксом або служать в якості рецепторів дляотримання і перетворення хімічних сигналів з навколишнього середовища.
Мембранні білки, що утворюють цитоскелет, з'єднуються один з однимспецифічним для кожного типу клітин чином і формують складнідинамічно взаємодіють між собою структури. Ці структури івідповідають безпосередньо за узгоджена поведінка частин клітин. [4]
Гемоглобін можна вважати свого роду модельним білком, структура, властивостіі функції якого найбільш повно вивчені в порівнянні з іншими білками наПротягом останніх 50 років. Десятки років досліджень гемоглобіну в багатьохлабораторіях світу призвели до значного прогресу в описі і розумінніфізичних, хімічних і біологічних аспектів його функціонування. [2]
Однак, незважаючи на це, у науковій літературі недостатньо докладно висвітленопитання про зв'язок гемоглобіну із структурними білками еритроцитарних мембран.
Вивчення структури мембрани еритроцита людини і перш за все входять доїх складу білків є актуальним, оскільки ряд спадковихпатологій (сфероцітарние анемії, міодистрофія, деякі захворюванняцентральної нервової системи) характеризуються різними порушеннями вбілкової компоненті еритроцитарної мембрани і як наслідок порушенням їїструктурно-функціональної організації. [7] Певні чинники середовища можутьзмінювати експресію генів, що відображається на життєдіяльності якокремих органів і систем, так і організму в цілому. Деякі авторирозглядають рівень гемоглобіну в крові як універсальний неспецифічнийпоказник адаптаційних процесів, процесів напруженості організму ввідповідь на різні зовнішні впливи. [1] Так, наслідком дії такихфакторів може з'явитися зменшення кількості гемоглобіну в крові абопорушення структурно-функціональної організації білкової компоненти мембранеритроцитів. Результатом таких змін служить ряд патологій, і, якнаслідок, - значне зниження адаптаційних можливостей людини.
Тому на сьогоднішній день актуально вивчення структури мембрансвязанногогемоглобіну, оцінка його кількісного змісту і взаємозв'язок зструктурними білками еритроцитарних мембран. У зв'язку з почавсясистематичним вивченням продуктів експресії генів людини в рамкахмолекулярно-анатомічного напрямку представляється вкрай важливимвстановлення кількості та основних властивостей поліпептидів, що входять до складумембрани еритроцита, і складання каталогу білків. Можливості цихдосліджень, а також пошуку первинного біохімічного дефекту приспадкових аномаліях істотно зросли після широкогопоширення методу двовимірного електрофорезу в поліакриламідному гелі
(ПААГ). [7]
Метою цього дослідження було вивчення кількісного змістумембранозв'язаних гемоглобіну еритроцитів людини та його зв'язку зструктурними білками.

літературний огляд

В силу своєї спеціалізації (перенесення кисню від легенів до тканин)еритроцит за механічними властивостями є унікальною клітиною, так як ввідміну від інших клітин постійно піддається вираженим деформуючимвпливів в кровоносній руслі. [9]
Для нормального функціонування еритроцит повинен протягом щодотривалого періоду часу зберігати свою цілісність і бути добредеформуються; остання властивість важливо перш за все для нормальноїмікроциркуляції. У свою чергу деформуємість визначається низкоюфакторів, основні з яких - форма клітини і еластичність мембрани.
Зараз можна вважати доведеним, що ці властивості мембрани еритроцита іклітини в цілому обумовлені наявністю білкової мембранної структури,іменованої мембранним скелетом клітини і розташованої на внутрішній сторонімембрани. [9] плазматичну мембрану еритроцитів слід розглядати яквідкриту динамічну структуру, здатну специфічно і неспецифічнопов'язувати білки плазми крові і цитоплазмі еритроцитів. [6] Дослідникинамагаються з'ясувати механізми метаболічного регулювання білковихвзаємодій компонентів мембранного скелету між собою, а також зінтегральними білками мембрани, що має підвести до розуміння природитаких процесів, як зміна форми і деформованості, робота транспортнихсистем, зміна іонної проникності мембрани. У цьому огляді зробленаспроба узагальнити і осмислити наявні дані з цього питання.
Сучасні уявлення про структуру та функції мембранного скелетуеритроцитів людини та інших ссавців склалися в основному заостанні 25 - 30 років. За цей період опубліковано ряд докладних оглядів.
Наявність сітчастої структури, що вистилає внутрішню поверхню мембраниеритроцита, було виявлено безпосередньо за допомогою електронноїмікроскопії після обробки клітин неіонних детергентом тритоном Х-100.
Мембранний скелет видно у вигляді двомірної мережі філаментів, довжина якихзалежить від особливостей приготування препарату для мікроскопії. Білковікомпоненти мембранного скелета були ідентифіковані за допомогоюелектрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфатунатрію (ДДС).
Класичною роботою по електрофоретичної розділення білків мембраниеритроцитів людини є робота Фейрбанкса і співавторів, в якійавтори запропонували номенклатуру поліпептидних смуг, що виявляються всолюбілізірованних за допомогою ДДС мембрані; цієї номенклатурою користуються вНині більшість дослідників. При одночасному електрофорезісолюбілізірованних білків еритроцитарної мембрани в ПААГ у присутності ДДСвиявляється 20 смуг, однак Фейрбанкс зі співавторами виділили 7 основнихсмуг, які були пронумеровані від катода до анода. У наступні рокибули внесені лише незначні уточнення у цю номенклатуру. [9]
У зв'язку зі способом розташування макромолекул в мембрані еритроцита білкиділять на периферичні (внутрішні) та інтегральні. Інтегральніутримуються в мембрані. До їх складу входять глікопротеїни і протеоліпіди.
Опції інтегральних білків різноманітні: вони можуть виступати в ролігідролітичних ферментів, рецепторів клітинної поверхні, окислювально -відновлювальних компонентів транспортної системи електронів і в якостіспецифічних білків входить до складу цитоскелету, який представляєсобою двовимірну мережа, поєднану безпосередньо з мембраною еритроцитачерез взаємодію з інтегральними білками. Також до периферичних білківвідноситься ряд еритроцитарних ферментів.
Метод фракціонування мембранних білків одновимірним електрофорезом в ПААГу присутності ДДС дозволили розділити білки мембрани щодо їхелектрофоретичної рухливості, і отриманим фракціям білків були даніномера в міру зменшення їх молекулярної маси.
Смуги 1 і 2 включають окремі (- і (-субодиниці спектріна.
Спектрін - основний білок цитоскелету еритроцитів. Спектрін утворюєдвовимірну мережу, до якої кріпляться Актинові олігомери. Молекула спектрінає ((-гетеродімер. За даними електронної мікроскопії,гетеродімери мають форму зігнутих фібрил довжиною близько 100 нм. Вони можутьприймати різні конфігурації. Кожна ланцюг молекули спектріна міститьбільше 2000 амінокислотних залишків і складається з лінійно розташованихструктурних доменів. Доменна структура була встановлена за допомогою аналізупептидних фрагментів субодиниць. Вторинна структура (- і (-субодиницьсхожа і є (-спіральні ділянки, розділенічутливими до протеолізу (-структурами. Димер спектріна асоціюютьсяз (-ланцюгом іншої димеру "голова до голови". Ніколи не зустрічаються (- (- або
(- (-зв'язку. Між димеру і тетрамерамі існують зворотні переходи,які залежать від умов середовища. При 37 (З спектрін екстрагується змембран еритроцитів у формі димеру, при 4 (С - у формі тетрамера. При 30 і
40 (С в розчині між димеру і тетрамерамі встановлюється рівновага.
Так як у звичайних умовах отримання спектрін екстрагується у формітетрамера, вважали, що in vivo спектрін знаходиться в тій же формі.
Електронно-мікроскопічний аналіз свідчить про те, що такіолігомери утворюються в результаті асоціації 3-7 димерів спектріна.
Вважають, що в еритроцитах присутні як олігомери, так і тетрамери,які утворюють двовимірну мережа цитоскелету. Молекула спектрінапіддається множинного фосфорилюванню, ступінь якого не впливає наформу еритроцитів. [5]
Смуги 2.1, 2.2, 2.3 Представлені різними формами периферичногобілка анкіріна. Дані електронної мікроскопії свідчать про те, щомережа спектріна розташована на певній відстані від мембрани і, по -Мабуть, взаємодіє інтегральними білками мембрани. Латеральнарухливість інтегральних білків залежить від присутності спектріна: цепідтверджує наявність такої взаємодії. Під час обробки мембранхімотрипсин був виділений білковий фрагмент з мовляв. масою 72 kD, якийінгібувати взаємодія спектріна з еритроцитарної мембраною, збідненійспектріном. Білок був названий анкіріном, від грецького ankyra, що значитьзаякорюють. Інша група дослідників назвала його сіндеіном, відгрецького syndeo, що значить зв'язуватися разом. Молекула анкіріна (мол.маса 200 kD) має сферичну форму і складається з двох доменів:нейтрального і фосфорілірованний. Фосфорілірованним доменом анкірінвзаємодіє з (-субодиницею спектріна на відстані 20 нм від С-кінцямолекули. Нейтральний домен анкіріна здійснює зв'язок з білком смуги 3.
[5,6]
Білок смуги 3 Білок 3 (аніонтранспортний білок) - один з основнихінтегральних білків еритроцитарної мембрани - є глікопротеїдів змол. масою 90 kD. Показано, що цей білок бере участь у забезпеченніаніонного транспорту, у зв'язуванні цітоскелетного каркасу з мембраною,цитоплазматичних білків гемоглобіну і гліцеральдегід-3 -фосфатдегідрогенази. Не всі молекули білка 3 взаємодіють з анкіріном.
Якби всі молекули білка 3 були пов'язані з анкіріном і, отже, звсій спектріновой мережею, це виключило б можливість латеральнихпереміщень самого білка, освіти кластерів і транспортних функцій.
Зв'язок спектріна з мембраною здійснюється, ймовірно, не тільки черезанкірін, але також за допомогою додаткових взаємодій. Наявні насьогоднішній день дані свідчать про те, що білок 4.1 забезпечуєзв'язок спектріна з інтегральним білком мембрани. [5] Всі перерахованідодаткові взаємодії носять слабкий характер і, мабуть, граютьдругорядну роль у порівнянні із взаємодією спектрін-анкірін-білок
3.
Білок смуги 4.1 Необхідний для нормальної стабілізації мембрани,закріплює зв'язок спектріна з актином. На електрофореграмме даний білокрозділяється на дві смуги: 4.1а (Mr = 80 kD) і 4.1b (Mr = 78 kD). Перехід 4.1ав 4.1b здійснюється за допомогою деамідірованія. Це глобулярні білок змол. масою 80 kD, що становить близько 5% від білкової маси цитоскелетуеритроцитів. Його ізоформи подібні за амінокислотним складом. Обидві ізоформиздатні взаємодіяти з спектріном. Кожна з них міститься вкількості приблизно 100 000 молекул на 1 клітину. [5]
Білок смуги 4.2 Паллідін - це олігомер (Mr = 72 kD), в клітціприсутній у дімерной і трімерной формах з Mr = 185 kD. З'єднується зцитоплазматичних доменом білка смуги 3, анкіріном, спектріном і білкомсмуги 4.1. [14]
Білок смуги 4.5 В його склад входять інтегральні білки - переносникинуклеозидів і глюкози через еритроцитарної мембрану. Основна частина білківсмуги 4.5 представлена транспортерами глюкози (Mr = 55 kD). [14]
Білок смуги 4.9 Центральний компонент цитоскелету з Mr = 48 kD. Цей білоквиділений у вигляді тримера з Mr = 145 kD. Стабілізує взаємодії спектріназ актином і впливає на ступінь його полімеризації. Це фосфопротеін. Білокприсутній в еритроцитах в кількостях, приблизно рівних кількостіспектріна. Про функції цього білка практично нічого не відомо. Можливо,він бере участь у зміцненні цітоскелетного каркаса (мережіцитоскелету). Показано, що очищений поліпептид смуги 4.9 можевзаємодіяти з Актинові нитками, знижуючи швидкість полімеризації актинуі, можливо, стабілізуючи короткі Актинові нитки в еритроцитах. [5]
Смуга 5 Актин - представлений в еритроцитах (-ізоформи і за фізико -хімічними властивостями схожий з актином м'язів. Так якфункціональною формою актину є його полімер, спочатку намагалисяз'ясувати, чи є в еритроцитах філаментний актин. Електронно -мікроскопічні дослідження показали, що актин присутній уеритроцитах у вигляді філаментів, що містять від 12 до 17 мономерів актину. [5]
Виділені мембрани еритроцитів, а також комплекс спектріна, актину і білка
4.1 здатні індукувати полімеризацію мономірні актину, подібноолігомеру актину. Обробка цітохалазіном У пригнічує полімеризацію. Такяк типовий фібрилярний актин не виявляється в нативних еритроцитах, а вдослідах in virto можна індукувати освіта довгих філаментів,пов'язаних з мембраною, слід, очевидно, припустити, що веритроцитах існують якісь механізми, що обмежують зростання філаментів,подібно до того, як це робить цітохалазін В. Актинові олігомери зв'язуютьсяз N-кінцем молекули спектріна латерально. Кожен тетрамер спектріна маєдва сайти зв'язування для Актинові олігомерів. Спектрін може зв'язуватися з
Ф-актином по всій довжині Актинові нитки, і ці зв'язки, мабуть, істотнідля утворення цітоскелетной мережі. Важлива роль у взаємодії актину іспектріна належить білку смуги 4.1, який пов'язується зі спектріном втих же ділянках, що і актин. Зв'язок спектріна з актином у відсутність білка
4.1 слабка і значно посилюється в його присутності, томувзаємодія спектріна і актину називають 4.1-залежним. Комплекси білка
4.1, спектріна і актину володіють набагато більшою стійкістю додисоціації при седиментації в сахарозі, ніж комплекси актину і спектріна.
Виникає питання про те, які чинники впливають на полімеризаціюеритроцитарного актину. Відносно низька концентрація актину веритроцитах не може, ймовірно, мати вирішального впливу на довжинуфіламентів. Припустимо, що на полімеризацію актину можуть впливати такіактінсвязивающіе білки, як спектрін і білок 4.1. Виявилося, що ці білкиздатні регулювати швидкість полімеризації актину, скорочуючи лаг-фазу,зменшуючи швидкість елонгації і не викликаючи при цьому ніяких змін впослідовності етапів полімеризації. Спектрін і білок 4.1 викликаютьнуклеація глобулярні актину в умовах, коли концентрація актину нижчекритичною і спонтанна полімеризація не відбувається. Таким чином, можнапередпокласти, що спектрін і білок 4.1 представляють собою комплекс білків,блокуючих повільний кінець Актинові нитки на відміну від більшості
"замикаючих" білків, що взаємодіють з швидким кінцем. Проте пізніше булиотримані дані, що суперечать цьому припущенням. Шен зі співавторамивиділили фрагменти цитоскелету еритроцитів при обробці розчинами знизької іонної силою при 37 (С. [5] Електронно-мікроскопічні дослідженняотриманих фрагментів показали, що частина з них містить філаменти актину,уздовж яких кластерами розташовуються спектріновие молекули. При інкубаціїцих препаратів з глобулярні актином (при концентрації актину в розчинівище критичної) відбувалося зростання Актинові ниток на обох кінцях. Тсукітазі співавторами вивчали полімеризацію актину на мембранах еритроцитів,закріплених на електронно-мікроскопічних сектах. При інкубації цихпрепаратів з глобулярні актином на внутрішній поверхні мембран,містять цітоскелетние білки спостерігалося зростання Актинові філаментів. [5]
При концентраціях глобулярні актину, близьких до критичних, зростанняспостерігався тільки на повільному кінці, а при подальшому збільшенніконцентрації - на обох кінцях нитки. Під час обробки мембран "кепірующім"білком з мол. масою 45 kD, що зв'язуються з швидким кінцем Актиновімікрофіламентів, зростання спостерігалося тільки на повільному кінці. Дані Шена і
Тсукіти приводять до висновку про те, що в еритроцитах актин існує у виглядіфіламентів з вільними кінцями. Отже, спектрін і білок 4.1 НЕє кепірующімі білками, проте безсумнівно впливають на стан актинув еритроцитах, стабілізуючи Актинові філаменти.
Білок смуги 6 Гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (ГАФД), молекулярнамаса становить 35 kD. Розташована на цитоплазматичної доменіаніонтранспортного білка, у складі мультіферментного комплексу. Данийбілок є ферментом гліколізу і бере участь у регуляціїокислення гемоглобіну. [14]
Смуга 7 Основною складовою поліпептид - тропоміозін. Довгий часзалишалася невідомою природа білка зони 7. Було показано, що цей білокзв'язується з антитілами до тропоміозіну, виділеного з м'язового шлункакурчати. Молекулярна маса білка співпадала з молекулярною масоютропоміозінов, виділених з мозкових тканин, з макрофагів і кров'янихплатівок. Тропоміозін еритроцитів - димер з мовляв. масою 60 kD, що складаєтьсяз двох субодиниць з мовляв. масою 29 і 27 kD і зв'язується з м'язовимактином (Ф-актином) при співвідношенні: 1 молекула тропоміозіна на 6-7мономерів актину. Так як в еритроцитах філаменти актину містять до 15-17мономерів, вони можуть пов'язувати два молекули тропоміозіна. [5]
Смуга 8 Представлено пептидного частиною ферменту глутатіон-S-трансферази
(Mr = 23 kD). Взаємозв'язок білка смуги 8 з мембраною є кальцій --залежною.
У 1985 р. було показано, що ще одним компонентом цитоскелетуеритроцитів є міозин. За допомогою моноклональних антитіл до важкоїланцюга міозину Фаулер виявив в еритроцитах поліпептид, який був виділенийі охарактеризовано. Білок складається з важкої ланцюга з мовляв. масою 200 kD і здвох легких ланцюгів з мовляв. масами 26 і 19,5 kD. У розчинах з низькою іонноїсилою він утворює біполярні філаменти і володіє АТФазной активністю. Уеритроцитах міозин присутній приблизно в кількості 6000 молекул на 1клітку, тобто на 1 молекулу міозину, як і в інших клітинах, доводитьсяблизько 80 мономерів актину. [5]
Білки, що утворять цитоскелет еритроцитів, неунікальни. Вони або їмподібні білки є в багатьох інших клітинах. Переважна їхлокалізація - поблизу мембран. Ймовірно також, що розглянуті білки можутьбути поліфункціональні і використовуватися в структурних комплексах різногофункціонального призначення. [5]
Смугу 9 на електрофореграмме становить білок Глобино, який єчастиною мембрансвязанного гемоглобіну. Як вже говорилося вище,цитоплазматичний домен білка смуги 3, що включає близько 380амінокислотних залишків, локалізована в цитоплазмі і відіграє важливу роль упідтриманні форми еритроцита і його метаболізмі. N-концеваяпослідовність цитоплазматичного домену багата амінокислотнимизалишками кислого характеру. На цій ділянці знаходяться центри зв'язуваннягідролітичних ферментів - гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази,альдолази, каталази, гемоглобіну і геміхрома. Таким чином,цитоплазматичний домен аніонтранспортного білка і є місцемлокалізації мембрансвязанного гемоглобіну, про структуру, властивості ідеякі аспекти функціонування якого буде сказано нижче.
Гемоглобін Гемоглобін - білок еритроцитів, червоних кров'яних клітин,переносить молекулярний кисень від легенів до тканин в організмаххребетних тварин. Гемоглобін можна вважати свого роду модельнимбілком, структура, властивості та функції якого найбільш повно вивчені попорівнянні з іншими білками протягом останніх 50 років. Американськийфізик Хопфілд назвав його атомом водню сучасної біохімії, маючи на увазі,що вивчення гемоглобіну зіграло в біохімії ту ж роль, що й вивченняатома водню у фізиці. Гемоглобін називають також почесним ферментом,оскільки дослідження його структури в статиці і динаміці дозволилизначно просунутися в розумінні механізмів функціонування ферментів.
Структура цього глобулярні білка відома в деталях головним чиномзавдяки роботам англійського біофізика Макса Перутца, який отримавперший рентгеноструктурні дані ще наприкінці 40-х років нашого століття. Заці дослідження він був удостоєний Нобелівської премії.
Структура гемоглобіну Молекула гемоглобіну складається з чотирьох субодиниць:двох (і двох (- і відповідно містить чотири поліпептидні ланцюжкадвох сортів. Кожна (-ланцюжок містить 141, а (-ланцюжок - 146амінокислотних залишків. Таким чином, вся молекула гемоглобіну включає
574 амінокислоти. Хоча амінокислотні послідовності (- і (-ланцюжківрізні, вони мають практично однакові третинні просторовіструктури. Власне кажучи, наведені вище деталі структури відносятьсяне до гемоглобіну, а до його білкової компоненті - глобіну. Кожна субодиницягемоглобіну містить одну небілкової (так назвав простетичної) групу
- Гем. Гем являє собою комплекс Fe (II) з протопорфірину. Структурагема представлена на рис.1, а. [2]
Атом заліза може утворити шість координаційних зв'язків. Чотири зв'язкунаправлені до атомів азоту піррольних кілець, що залишилися два зв'язку -

Рис.1. Структура гема (а), структура активного центру дезоксігемоглобіна
(б), структура активного центру оксигемоглобіну (в).

перпендикулярно до площини порфіринового кільця по обидва боки його. Гемирозташовані поблизу поверхні білкової глобули в спеціальних кишенях,утворених складками поліпептидних ланцюжків глобіну. Гемоглобін принормальному функціонуванні може знаходитися в одній з трьох форм:феррогемоглобін (зазвичай званий дезоксігемоглобіном або простогемоглобіном), оксигемоглобіну і феррігемоглобін (званий такожметгемоглобін). У феррогемоглобіне залізо знаходиться в закісной формі
Fe (II), один з двох зв'язків, перпендикулярних до площини порфіриновогокільця, спрямована до атому азоту гістідінового залишку, а друга зв'язоквільна (рис.1, б). Крім цього гістідінового залишку, званогопроксимальних (сусіднім), по інший бік порфіринового кільця і набільшій відстані від нього знаходиться інший гістідіновий залишок --дистальний гістидин, не пов'язаний безпосередньо з атомом заліза.
Взаємодія молекулярного кисню з вільним гемом призводить донеоборотного окислення атома заліза гема [Fe (II) (Fе (III); гем (Гемін]. Удезоксігемоглобіне Глобин охороняє залізо гема від окислення.
Реакція оксигенації оборотне приєднання кисню (оксигенація),дозволяє гемоглобіну виконувати свою основну функцію переносника,забезпечується можливістю утворити міцні п'яту і шостукоординаційні зв'язки і перенести електрон на кисень не від заліза (тоє окислитися Fe2 +), а від імідазольного кільця проксимального гістидину.
Це схематично зображено на рис.1, б. Замість молекулярного киснюзалізо гема може приєднати окис вуглецю СО (чадний газ). Навітьневеликі концентрації СО призводять до порушення кіслородпереносящей функціїгемоглобіну та отруєння чадним газом.
Вище було сказано, що одна молекула гемоглобіну містить чотирисубодиниці і, отже чотири гему, кожен з яких може оборотноприєднати одну молекулу кисню. Тому реакцію оксигенації можнарозділити на чотири стадії:
Hb + O2 (HbO2 (1a)
НbO2 + O2 (Hb (O2) 2 (1б)
Hb (O2) 2 + O2 (Hb (O2) 3 (1в)
Hb (O2) 3 + O2 (Hb (O2) 4 (1г)
Перш ніж розглянути цю головну функціональну реакцію гемоглобінубільш детально, необхідно сказати кілька слів про м'язовому гемоглобіні --міоглобін. Цей барвний білок м'язів являє собоюкомплекс гема з "чвертку" глобіну. Він містить одну молекулу гема іодну поліпептидних ланцюжок, склад і структура якої подібні до складу іструктурі (-субодиниці гемоглобіну. Як і для гемоглобіну, найважливішоюфункцією міоглобіну є оборотне приєднання молекулярногокисню. Цю функцію характеризує так звана крива оксигенації,зв'язує ступінь насичення гемоглобіну киснем (у відсотках) зпарціальним тиском останнього, рО2 (мм Hg). Типові криві оксигенаціїгемоглобіну і міоглобіну (за умови досягнення хімічної рівноваги)наведені на рис.2, а, б. Для міоглобіну крива є гіперболою, як іповинно бути у випадку одностадійной хімічної реакції за умовидосягнення хімічної рівноваги:

Mb + O2 (MbO2 (2) де Mb - міоглобін.

Рис. 2 Криві оксигенації міоглобіну (а) і гемоглобіну (б) < p>
Зовсім інша картина виникає у випадку гемоглобіну. Кривадисоціації має S-подібну форму. Без кисню молекули гемоглобінумають низьку спорідненість до кисню і рівновага реакції (1а) зрушеновліво. Потім крива стає крутіше і при високих значеннях рО2практично зливається з кривою дисоціації міоглобіну. [2]

Рис. 3. Логарифмічні анаморфози кривих оксигенації міоглобіну (a) ігемоглобіну (б)

М. Перутц пише, що розподіл молекул кисню по молекулгемоглобіну слід біблійній притчі: "Кожному, у кого є, дай ще, і унього буде надлишок; у того ж, у кого немає, забери те небагато, що у ньогозалишилося ". Це змушує припустити, що між гемамі однієї молекулигемоглобіну існує певний зв'язок, завдяки якій приєднаннякисню до одного гему впливає на приєднання кисню до іншого гемутієї ж молекули. Це явище було відомо задовго до робіт Перутца івстановлення структури гемоглобіну та механізму його реакції з киснем.
Воно отримало назву гем-гем взаємодії. Фізіологічний сенс гем-гемвзаємодії очевидний. Сігмоідная форма кривої дисоціації створюєумови максимальної віддачі кисню при перенесенні гемоглобіну від легень звисоким значенням pO2 до тканин з низьким значенням pO2. Для людинизначення pO2 артеріальної і венозної крові в нормальних умовах (Т 37 (С,pH 7,4) рівні відповідно 100 і 40 ммHg. При цьому (рис.2, б) гемоглобінвіддає тканинам 23% зв'язаного кисню (ступінь оксигенації змінюється від 98до 75%). При відсутності гем-гем взаємодії для одногемового міоглобіну
(рис.2, а) ця величина не перевищує 5%. Міоглобін тому служить непереносником, а депо кисню і віддає його м'язової тканини лише при різкійгіпоксії, коли насичення тканини киснем падає до неприпустимо низькогозначення. [2]
Логарифмічна анаморфоза кривої дисоціації гемоглобіну людинипредставлена на рис.3, б. У цьому випадку початок кривої являє собоюпряму під кутом 45 (до координатним осях, як і для міоглобіну: першамолекули кисню з'єднуються в основному з молекулами гемоглобіну, ще немістять кисню, і геми таким чином оксігеніруются незалежно. Цесвідчать про те, що гем-гем взаємодія обумовлене не простонаявністю декількох гемов в молекулі, а тим, що після оксигенації одногогема змінюються умови оксигенації інших гемов тієї ж молекули. Потімнахил кривої збільшується. Тангенс кута максимального нахилу отримавназву коефіцієнта Хілла (n), який відображає ступінь кооперативностіпроцесу. Для міоглобіну n = 1, а для гемоглобіну людини (в нормі) n (3.
Поблизу області повного насичення гемоглобіну киснем нахил кривої зновустає рівним 45 ((більшість молекул гемоглобіну або не містятьвільних гемов, або мають лише один гем, здатний приєднатикисень).
Механізм кооперативності У 1963 році Моно, Шанже і Джекоб виявили, щоактивність деяких ферментів змінюється стрибком між двома значеннями привпливі на білок деяких низькомолекулярних агентів, які не берутьучасті безпосередньо в каталітичному акті. Такі ферменти отрималиназва аллостеріческіх, а саме явище - аллостеріі. Передбачається, щоці ферменти можуть перебувати в різних станах, перемикання міжякими здійснюється при приєднанні специфічного низькомолекулярноголіганда (необов'язково поблизу активного центру). У 1965 році Моно, Вайман і
Шанже зрозуміли, що гемоглобін, не будучи ферментом, належить до того жкласу білків. На той час уже було відомо, що структури глобулоксигемоглобіну і гемоглобіну різні, і автори припустили, щостану з різними значеннями констант оксигенації відповідають різнимпросторовим структурам білка. Для гемоглобіну постулюється наявністьдвох таких станів: R (від англ. relaxed) і Т (від англ. tense). Стан
R характеризується високим, а Т - низьку спорідненість до О2 (сильніше і слабшезв'язують молекулярний кисень відповідно). В рамках цієї концепціївважається, що як в R-, так і в Т-стані спорідненість до киснюсубодиниць однієї глобули (тобто є всіх чотирьох гемов однієї глобули)однаково. Цей постулат дозволяє побудувати порівняно простуматематичну модель кооперативних властивостей гемоглобіну: КR, КТ і L
(константи рівноваги реакцій асоціації в станах R, Т і ставленнячисла молекул гемоглобіну в станах Т і R відповідно). На рис.2, бясно, що КТ