Владивостоцький Державний Медичний Університет

Кафедра мікробіології, вірусології і імунології

РЕФЕРАТ

Діагностика стафілококових інфекцій

Виконав: Новак А. Л.

301 гр., л/ф

Владивосток, 1998.

Передмова

Незважаючи на те, що стафілококи належать до числа найбільш легковиявляються і розпізнаються мікроорганізмів, які не потребують складнихдіагностичних прийомів для їх виявлення, в практичній роботімікробіологи досі відчувають певні труднощі при встановленніїх причинного ролі в ряді різних захворювань. З одного боку,присутність патогенних стафілококів, що виявляється в досліджуваномуматеріалі, не завжди є переконливим доказом їхетіологічного значення. З іншого, зважаючи на велику різноманітністьпроявів біологічної активності цих мікробів, що залежить від різних, незавжди піддаються обліку факторів, широку їх мінливість під впливомлікарських речовин і самого макроорганізму, досить складно буваєвизначити їх потенційну патогенність. Нарешті, третя причина пов'язана зтим, що стафілококи є представниками нормальної мікрофлори згрупи умовно патогенних мікроорганізмів і, разом з непатогенних,патогенні представники мешкають в організмі людей, поширюючись прице дуже нерівномірно на різні ділянки людського тіла.

Якщо виділення патогенного стафілокока, з крові хворих людей ірізних порожнин, які прийнято вважати стерильними, у переважнійбільшості випадків може бути доказом його ролі як збудникахвороби, то присутність стафілококів на слизових зіва, носа і т. д. навітьпри явному хворобливому стані їх вимагає великої обережностідослідника у висновках про етіологію даних захворювань.

Тому, природно, не може бути загальних рекомендацій, як придіагностиці різних стафілококових інфекцій, так і примікробіологічних дослідженнях ділянок тіла людини і різних об'єктівзовнішнього середовища. Широкий обмін думками між мікробіологами науковихустанов і практичних лабораторій, здійснюваний на з'їздах іконференціях, присвячених проблемам стафілококових інфекцій, а також приособистих контактах, здавалося б, повинен був привести до певних поглядівна різні методи дослідження, пропоновані для виділення іідентифікації стафілококів. Однак, велика кількість запитів, що надходять злабораторій СЕС і лікувальних установ, свідчить про явнітруднощі, які виникають у дослідників при вирішенні різнихпитань мікробіологічної діагностики стафілококів, а в рядімікробіологічних установ існують ще деякі застарілі методи іприйоми, що призводять до неправильних оцінок і навіть прикрих непорозумінь.

Важливою умовою ефективності лабораторної діагностики єпоєднане визначення якісних і кількісних критеріїв зміступатогенних стафілококів в досліджуваному матеріалі. Виходячи з цього, я вважаюза необхідне викласти ряд методів основних мікробіологічних досліджень,найбільш простих і доступних для кожної практичної та наукової лабораторії,якими ми користуємося протягом багатьох років.

ОСНОВНІ ПРИНЦИПИ виявлення та ідентифікація патогенних стафілококів

Попередня діагностика стафілококів може грунтуватися набактеріоскопічне вивченні препаратів - мазків, пофарбованих за Грамом.
Патогенні стафілококи, крім гроздевідного розташування, характеризуютьсяправильної сферичної формою клітин. Виявлення стафілококів,знаходяться всередині клітин, дозволяє дати відповідь про наявність стафілококовоїінфекції. У більшості ж випадків для точного встановлення патогенностівиявлених стафілококів потрібно виділити ці мікроорганізми в чистійкультури шляхом посіву досліджуваного матеріалу на щільні живильні середовища.

В даний час асортимент диференціальних, елективних інакопичувальних середовищ, запропонованих для виділення патогенних стафілококів,досить значний і продовжує розширюватися. Багато дослідників на основізнання основних біохімічних характеристик і поживних потребпатогенних стафілококів при конструюванні середовищ прагнуть підвищити їхвисеваемость і забезпечити можливість здійснювати їх кількісний облік,отримати надійний спосіб відрізняти потенційно хвороботворні стафілококивід сапрофітів.

Вживання рідких накопичувальних середовищ для первинного виділеннястафілококів недоцільно, тому що позбавляє дослідника можливостікількісної оцінки вмісту мікробів в обстежуваних об'єктах, а привипадкових забрудненнях сприяє помилкам. Особливо це відноситься до такихдослідженнями, як виявлення носійства патогенних стафілококів, дедоказом є лише масивний зростання, або визначенняетіологічну роль цих мікроорганізмів "при харчових отруєннях абозовнішніх запальних процесах. Якщо ж мова йде про дослідження крові,а також про тих небагатьох випадках, коли буває необхідно виявити навітьодиничні життєздатні особи цих мікробів, наприклад при контроліефективності дезінфекції, перевірці на стерильність або тітраціоннихпосівах, то в подібних випадках використання накопичувальних середовищ цілкомвиправдано.

З великого числа різноманітних поживних середовищ, випробуваних дляпервинного виділення стафілококів, у практиці виправдав,; 1 'себе деякі.
Звичайний поживний агар (рН 7,2 7,4), виготовлений шляхом додавання 2%агар-агару до мясопептонному бульйону або до тріптіческому перевари
Хоттінгера, може бути використаний при дослідженні ексудатів із закритихпорожнин. Стафілококи виростають через 18-24 год інкубації при 37 ° С у виглядігладких блискучих з рівними краями непрозорих і злегка опуклих колоній.
Характер пігменту виявляється краще після додаткового добовоговитримки чашок при кімнатній температурі (20 ° С) на світлі. Якщо вдосліджуваному матеріалі присутня стороння флора, то за зовнішнім виглядомколонії стафілококів можуть бути важко відрізняються.

Вживання кров'яного агару дає можливість, крім виявленняпігменту, визначити та гемолітичну активність стафілококів. При цьомунеобхідно пам'ятати, що гемолітична здатність, яка визначається на чашкахз кров'яним агаром, залежить від багатьох факторів - виду крові, їїконцентрації, наявності в ній антитоксинів, товщини шару середовища, змістувуглекислого газу в атмосфері культивування, густоти посіву, присутності іхарактеру супутньої флори і т. д.

При відборі колоній з кров'яного агару необхідно отвівать якгемолітичні, так і не дають гемолізу, особливо якщо дослідженняпроводиться на середовищі з людською або кінської кров'ю, а відсутністьгемолізу на таких середовищах не дозволяє зробити висновок про відсутність взагалігемолітичної активності. Тому використання кров'яного агару дляпервинного посіву доцільно тільки при обстеженні об'єктів, що немістять сторонньої мікрофлори, і бажано додавати в живильнесереду кров кролика або барана.

Якщо ж проводиться дослідження гною відкритих ран або відокремлюваного виразокабо нориць, то слід користуватися елективний-диференціальної середовищем длястафілококів - жовтковим-сольовим агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича.
Елективний цього середовища забезпечується високим вмістом хлористогонатрію, а доданий яєчний жовток дозволяє виявляти лецітовітеллазнуюактивність, яка є одним з показників патогенностістафілококів і в силу цього ЖСА більш чітко диференціює патогеннихпредставників, ніж кров'яний агар. Приготування ЖСА нескладно.

Заготовляють про запас і стерилізують в автоклаві при 120 ° С "протягом 20хв поживний агар (МПА або Хоттінгера) рН 7,2-7,4, що містить 10%кухонної солі. Перед вживанням сольовий живильний агар розтоплюють,остуджують до 45-50 ° С і додають до нього 20% за обсягом стерильною жовтковимсуспензії (1 жовток курячого яйця на 200 мл фізіологічного розчину). Длякращого емульсірованія бажано мати колби зі скляними намистом. Післяретельного перемішування середовище розливають по 20-25 мл в чашки, якіможуть зберігатися в холодильнику протягом кількох днів.

Слід виробляти масивний посів досліджуваного матеріалу на чашки з
ЖСА, а інкубацію вести протягом 2 діб при 35-37 ° С. стороння флорарізко пригнічується, стафілококи ж на ЖСА виростають практично у чистійкультурі. Безпосередньо під час перегляду чашок навколо колоній відзначаєтьсяосвіта райдужних віночків і каламутній зони - лецітовітеллазная реакція.
Такі колонії, не менше двох з кожного посіву, отвівают на скошений м'ясо -пептони агар для подальшої перевірки виросли культур в реакції плазмо -коагуляції.

Щоб уникнути помилок у визначенні жовтковим реакції, необхідно матина увазі, що іноді спостерігається помутніння середовища без веселкового обідка, вцьому випадку проба на лецітовітеллазу вважається негативною. Якщо жколонії, які виросли на ЖСА, не дають лецітовітеллазной реакції, тобто неоточені райдужним віночком, але є ріст стафілококів, то їх тежвважають підозрілими і також отвівают не менше двох з кожного такогопосіву на чашки з простим живильним агаром плямами діаметром 5-10 мм.
Після добового інкубації при 37 ° С отримані макроколоніі перевіряють вреакції плазмоагглютінаціі, для чого мікробну масу розмішують петлею насклі в краплях цитратно кролячій або людської плазми, розведеною 1
: 4. Освіта пластівців враховують протягом 30с-1 хв. За наявностіплазмоагглютінаціі такі штами вважають підозрілими і отвівают наскошений агар для подальшого вивчення в коагулазной реакції. При такомувідборі число пропускаються штамів патогенних стафілококів людськогопоходження невелика, культури же, виділені від тварин, потрібноперевіряти у реакції плазмокоагуляціі.

Коагулазная проба є основною ознакою, що визначаєхвороботворності стафілококів, тому її постановка вимагає до себемаксимальної уваги. Для виявлення коагулазной активності устафілококів, виділених від людей, можна користуватися як цілісної кров'ю,так і плазмою кроликів або людини. Можна використовувати також кров абоплазму, взяту безпосередньо від людини. Консервована плазма абокров, що використовуються для переливання, непридатні для реакції, тому що до нихчасто додаються консерванти, які перешкоджають життєдіяльностістафілококів, прояву коагулазной активності. Не слід застосовуватикров тварин або людей, що переносять стафілококові захворювання, уособливості затяжні, так як вона може виявитися нестерильний і міститиантікоагулазу. Під час роботи зі стафілококами, виділеними від рогатої худоби,можна користуватися бичачої кров'ю.

асептичного взяту кров стабілізують за допомогою 1-4% цитрату або 0,1%оксалата. Для отримання плазми нітратну кров центріфугіруют абовідстоюють на холоді. Але, як уже говорилося, можна користуватися і цілісноїкров'ю. Потім кров розводять стерильним фізіологічним розчином успіввідношенні 1: 3 або 1: 5 і розливають по 0,2-0,3 мл в стерильніпробірки, які перед стерилізацією повинні бути ретельно вимиті, тому щозалишки хімічних речовин можуть впливати на результат плазмокоагуляціі.

Випробовувані агарових культури стафілококів вносять петлею на плазму ідобре перемішують. Бульйонні культури вносять піпеткою в обсязі 0,1 мл Вкожному досвіді необхідно ставити контроль з культурами свідомо патогеннихстафілококів, що дають коагулазную реакцію, і штамами коагулазоотріцатель -них мікроорганізмів. Крім того, частина пробірок з розлитої плазмою слідзалишати не засіяної мікробами і витримувати в термостаті протягомусього терміну досвіду. У разі настання коагуляції хоча б в одній з нихвесь досвід потрібно переставити з новою порцією крові. Пробірки з досліджуванимикультурами витримують в термостаті при 37 ° С протягом доби. Облікрезультатів проводиться обов'язково двічі: через 2-3 год і 24 ч. враховуютьзгортання плазми та освіта згустків. Зазвичай культури, активнопродукують коагулазу, дають позитивну реакцію вже через 2-3 год а якщовони володіють і вираженою фібринолітичної активністю, то спочаткуутворилися згустки можуть піддатися розплавлюванню до кінця доби.
Слабокоагулірующіе штами можуть давати позитивну реакцію в пізністроки-до кінця доби. Досліди, що дали сумнівний результат, необхідноповторити.

Деякі дослідники, отримавши негативний або сумнівнийрезультат, залишають пробірки на столі. Цього робити не можна, тому щозгортання плазми в більш пізні терміни може носити не специфічнийхарактер і його не слід брати до уваги.

Стафілококи, що дають позитивну коагулазную пробу, повиннірозглядатися як потенційно патогенні, незалежно від наявності абовідсутності у них гемолітичних властивостей і характеру пігменту, їх відносять доувазі St. aureus і надалі піддають фаготіпізаціі і перевірці начутливість до антибіотиків.

Поглиблене вивчення стафілококів показало, що основна ознака па -тогенності - коагулазная реакція може піддаватися мінливості привпливі різних факторів (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падерін,
1966), тому в ряді випадків, при виділенні коагулазонегатівнихстафілококів у монокультурі з патологічних вогнищ, доцільновивчити у них інші ознаки потенційної хвороботворності і перш за все
- Здатність ферментувати маніт в анаеробних умовах. Відомо, щосеред коагулазоотріцательних частина культур має здатність розщеплюватиманіт в анаеробних умовах (8,4%-за даними А. А. Акатова і М. Л.
Хатеневер, 1974).

Визначення ферментації маніту в анаеробних умовах технічно дужепросто і здійснюється шляхом посіву уколом досліджуваних культур в пробіркиз високим стовпчиком напіврідкого агару Хоттннгера, що містить 1% маніту і
0,004% індикатора бромкрезолпурпура або бромтімолблау (рН == 7,2). Цюсереду перед посівом «регенерують», тобто кип'ятять на водяній бані, швидкоохолоджують, а після посіву заливають шаром стерильного вазелінової олії.
Посіви інкубують при 37 ° С протягом 5 днів. Однак у значній кількостівипадків результати можуть бути враховані вже через добу.

Поряд з реакцією плазмокоагуляціі, велике значення набула ще одинважлива здатність стафілококів, що характеризує їх потенційнупатогенність,-дезоксірібонуклеазная активність. Багато дослідниківповідомляють про високу кореляції цієї ознаки з коагулазной активністю ітоксигенних досліджуваних культур; відзначають, що стафілококи, виділені зпатологічного матеріалу, як правило, мають ДНК-Азою. Коагула -зопозітівние штами, отримані від носіїв, можуть не мати цьогоферменту, і звичайно відсутність дезоксірібонуклеазной активності поєднується знизькою біохімічної здатністю і атоксігенностью таких культурстафілококів.

За спостереженнями деяких дослідників, серед коагулазонегатівнихштамів стафілококів, але володіли іншими ознаками патогенності,виділених у ряді випадків від хворих з різними гнійними інфекціями,дезоксірібонуклеазную активність виявляли від 10 до 29% таких культур (І.
І. Панишева і співроб., 1967; Franklin і співавт., 1966; Lierd і Golde, 1970).

В даний час цей тест може служити надійним диференціальнихознакою між патогенними та непатогенних стафілококами і в той же часможе допомогти в диференціації ступеня патогенності коагулазопозітівнихштамів і, безумовно, приверне увагу до коагулазонегатівним, алещо володіє цим ферментом культур стафілококів і у ряді випадків дозволитьвіднести останні до хвороботворним форм з більшою впевненістю.

Методика визначення дезоксірібонуклеазной активності нескладна, воснову її покладено метод Джеффріса. Готують про запас 2% МПА (рН-8, 6),що містить ДНК (2 мг/мл середовища), розливають по флаконах та стерилізують текучимпарою протягом 30 хв. Перед розливом в чашки до середовища додають CaCIa (0,8мг/мл). На підсушену середу засівають добові культури стафілококів.
Після інкубації протягом 18-20 год при 37 °, на поверхню середовища наливають INрозчин НС1 і через 7-10 хв враховують зони просвітління, які оцінюютьхрестами (Н. Б. Мордвинова і співавт., 1967).

Нами запропоновано більш економічний метод для виявлення ДНК-ази умікроорганізмів. Цей спосіб, крім зменшення в 2 рази витрати ДНК накожен досвід, дозволяє використовувати більш дешеву нізкополімернуюНУК?? еіновую кислоту, що виготовляються Олайнскім заводом хімічних реактивів.
Запропонована методика широко апробована на кафедрі мікробіології ЛСГМІ іза якістю результатів не поступається загальноприйнятою. Тому ми наводимо їїдокладний опис.

Для приготування робочого розчину ДНК, навіску нуклеїнової кислоти зрозрахунку 10 мг/мл поміщають у дистильовану воду, додають 0,5 мл 0,2%
(або 0,8%) розчину NaOH на кожні 10 мл води. Для кращого розчинення ДНКсуміш або нагрівають до кипіння на водяній бані при постійному перемішуванніскляною паличкою, або залишають на ніч при 37 ° С в термостаті. Дорозплавленого і охолоджені до 50 ° С МПА додають робочий розчин ДНК зрозрахунку 1 мг/мл (на 9 мл МПА-1 мл розчину ДНК), перемішують, розливаютьпо10л (л в пробірки, стерилізують текучим парою протягом 30 хв або вавтоклаві при 0,5 атмосфери протягом 20 хв. Термін зберігання-1-2 міс.

При постановці досвіду стовпчики агару з ДНК розтоплюють, на водяній банідодають 0,1 мл офіцинальними стерильного 10% розчину СаСЬ, перемішують івиливають на шар добре підсушеного поживного агару в чашки Петрі ізнову підсушують. Добова агарових культуру засівають маленькими бляшками
(діаметр дорівнює 2-2,5 мм) або штампом-реплікатор не більше 20-25 бляшок, ууникнути злиття зон деполімеризації ДНК. Після 18-20-годинної інкубаціїповерхню агару заливають 5 мл розчину IN НС1 і через 3-5 хв враховуютьзони просвітління. Реакції оцінюють в хрестах.

При цьому слід врахувати, що інтенсивність зони деполімеризації нащільною середовищі не завжди збігається з кількістю продукції цього ферменту удосліджуваних стафілококів в рідких середовищах.

Для виявлення Фібринолізин використовують кілька вдосконаленийметод Крісті за співроб.

середу Крісті-Чепмена має наступний склад: м'ясний екстракт-0, 45 г,пептони-0, 75 г, хлористий натрій-1, 2 г, агар-2, 75 г, вода-130 мл, рН середовища
== 7,0. Стерилізується в автоклаві і зберігається запас.

Перед досвідом середу розтоплюють, остуджують до 50 ° С і додають 15-20%стерильною цитратно людської плазми. Суміш прогрівається на водяній баніпри 65-70 ° С протягом 2 - 5 хвилин до появи ясної каламуті, а потім розливаєтьсяв чашки. Випробовувані культури засівають «плямами» по 15-20 на чашку.

Посіви інкубують при 37 ° С. Враховуєтьсяосвіта зон просвітління навколо колонії спочатку через 14 год, потімчерез 24 і 48 годин, тому що реакція у різних культур тече неоднаковошвидко і в деяких штамів вона розвивається в більш пізні терміни.

фібринолітичний тест ми вважаємо вельми придатним для визначенняпотенційної хвороботворності стафілококів, але оцінюємо тільки вкомплексі з іншими ознаками активності.

Гіалуронідазная активність визначається за методом Мак-Клину вмодифікації М. Ш. Могильовського і Л. С. Коган (1949).

Розчин гіалуронат що дає в присутності 2 N оцтової кислоти типовийзгусток, розливається по 0,5 мл в стерильні пробірки. Додається 0,5 млдобової культури стафілокока в пептонов воді. Контролю служать:гіалуропат + дистильована вода і гіалуропат + незасіяні середу. Сумішіструшують і витримують при 37 ° С 15-20 хв. Потім в кожну пробіркудодається по дві краплі 2 N розчину оцтової кислоти і струшується. Уконтролю повинен утворитися слизовий грудочку. У досвіді при наявностігіалуронідази він відсутній, що свідчить про деполімеризаціїгіалуронової кислоти мікробним ферментом.

Для вивчення токсигенних стафілококів зручно користуватися методом,запропонованим Ілеком і Леві (1950), що дозволяє визначити типи гемолізинів.

З цією метою готуються чашки з живильним агаром, що містить 5% відмитих фізіологічним розчином еритроцитів барана, кролика й людини.

На поверхню живильного середовища за діаметром поміщають стерильну смужку фільтрувального паперу, змочену альфа-антитоксичної сироваткою.
Відступивши 1-2 мл від краю смужки, перпендикулярно до неї засівають штрихами досліджувані культури. Посіви інкубують при 37 ° С протягом доби, після чого враховують результати.

Альфа-гемоліз проявляється у вигляді повного просвітління середовища навколо штриха культури і нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою. Він виявляється на середовищах з кролячими і баранячими еритроцитами

Бета-гемоліз на агарі з баранячою кров'ю дає часткове просвітлення, зона якого має буро-пурпуровий відтінок. Це «тепло-холодового» токсин і краще виявляється після додаткового добового витримки чашок в холодильнику при температурі +4 ° С по характерному пошаровому баранячих гемолізу еритроцитів і не централізується альфа-антитоксичної сироваткою. На кролячих еритроцитах він не активний. Дельта-гемолізини визначається по вузькій смужці гемолізу баранячих та кролячих еритроцитів, не нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою. Однак освіта дельта-гемолі-зина на цих чашках може бути замаскована дією альфа-токсину і тому його слід перевіряти на середовищах з еритроцитами людини або коня. Таким чином, для визначення всіх 3 типів гемолізинів досить використовувати еритроцити барана і людини або коня.

Для визначення вірулентності стафілококів існують кількарізних методів зараження білих мишей.

Найбільш простим є введення 0,1 мл добової бульйонно культуривипробуваного стафілокока у хвостову вену. Облік загибелі тваринздійснюється протягом 10 діб, реєструють наявність абсцесів в нирках.

Зручно користуватися способом Badenski і співроб. (1958), Добовабульйонна культура центріфугіруется при 3000 об/хв - 30 хв. Отриманийосад ресуспендіруется в половинному обсязі декантата і в кількості 0,05мл вводиться 6 мишам позаду очного яблука в окологлазнічную клітковину.
Культуру, яка викликає загибель половини і більше заражених мишей протягом 6днів, вважають вірулентної.

При цих методах зараження вірулентної культурою у тварин розвиваєтьсягромад септичний процес з переважним ураженням нирок. Основназагибель мишеі відбувається на 3-5-й день після зараження.

Інші способи зараження білих мишей (внутрішньочеревно і інтраназальний)вимагають в десятки разів більшою заражає дози, максимум загибелі мишей припадає на 1-2-едобу, що характеризує переважно токсичний компонент процесу (С.
А. Анатолій, І. І. Антоновская, 1967).

У той же час ряд дослідників віддають перевагу більш простомутехнічно внутрішньоочеревинному способом зараження мишей, який одночаснодозволяє вивчати клітинні і гуморальні механізми розвитку інфекції.

Зіставлення вірулентності стафілококів для білих мишей з окремимифакторами їх патогенності показало, що вірулентність штамів, за данимивеликої кількості дослідників, корелює з рівнем альфа-Гемотоксини. ЩоЩодо інших ознак патогенності та їх кореляції з вірулентністю, тоотримані суперечливі відомості. Так, за даними С. А. Анатолія (1969),вірулентність штамів корелює з продукцією бета-гемолізини,летального фактора, лецітовітеллази, гіалуронідази і коагулазу. А. К.
Акатов (1968) не зазначає кореляції вірулентності з коагулазной,леціговітел-лазня, фібринолітичної активністю, не встановленакореляція з дельта-токсигенних.

Для порівняння вірулентності стафілококових культур можна використовуватиїх здатність викликати дермонекротіческую реакцію у кролів.

Готують 4-мільярдну суспензії добової агарового культури стафілокока вфізіологічному розчині, а з отриманої густоти роблять розведення, щоботримати 2 - та 1-мільярдні суспензії. З кожного розведення в об'ємі 0,1 мл,що становить 100, 200, 400 мільйонів мікробних тіл, вводять кролику ввистріженную або депілірованную напередодні шкіру. На одному кролика можнаодночасно поставити до 8 внутрішньошкірних проб. Щодня відзначаютьпрояви дермонекротіческой реакції, а остаточно на 4-у добу. Замінімальну дермонекротіческую дозу приймають то найменшу кількістькультури, яке дає некроз на 4-у добу (Г. В. Вигодчіков, 1963).

Список використаної літератури

1. А. М. Смирнова, А. А. Трояшкін, Е. М. Падерін: мікробіологія та профілактика стафілококових інфекцій - «Медицина», 1977.

2. Стафілококові інфекції: російський Сб науч. тр. - С.-П., 1991.

3.Лекція по темі.

5. Методична розробка кафедри.