Кабардино-Балкарський Державний Університет

Навчально-методичний посібник для студентів III курсу педіатричного факультету

Лабораторні методи діагностики

(частина перша)

ДОСЛІДЖЕННЯ КРОВІ

Нальчик 2000

Мета заняття:

Оволодіння студентами методикою загального клінічного аналізу крові та клінічної оцінкою отриманих даних.

Порядок дослідження:

Морфологічне дослідження крові складається з:

- визначення кількості гемоглобіну,
- визначення кількості еритроцитів і
- лейкоцитів в 1 ММЗ крові,
- підрахунку лейкоцитарної формули,
- колірного показника, а також

- визначення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ).

Рідше приєднують підрахунок ретикулоцитів, тромбоцитів.

Для морфологічного дослідження достатньо тієї кількості крові, яку можна отримати з уколу в палець.

Техніка взяття крові

Дослідження крові слід завжди проводити в один той же час приоднакових умовах, до прийому їжі. Кров беруть з IV пальця лівої руки.
Перед уколом палець дезінфікують і знежирюють, протираючи його ватою,змоченою спиртом, а потімефіром або їх сумішшю. Прокол виробляють або стерилізованіскарифікатори, або голкою Франка зі змінними стерилізується лезами. Уколзазвичай проводиться у верхівку м'якоті перший фаланги на глибину 2,5 - 3 мм.
Отриману після уколу першу краплю знімають фільтрувальної папером абоватою, змоченою ефіром. Кров для дослідження беруть у певномупорядку: длявизначення ШОЕ, гемоглобіну, потім - для підрахунку лейкоцитів іеритроцитів; роблять мазки. Після взяття крові, м'якоть пальця обертаєтьсязмоченою ефіром або спиртом ватою і притискається до долоні для того, щобзупинити кровотечу.

Визначення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ)

Обладнання та реактиви:

1. Апарат Панченкова.

2. Капіляри Панченкова.

3. 5% розчин лімоннокіслого натрію (свіжоприготований).

4. Годинний скло.

5. Голка Франка або Скарифікатор.

6. Вата.

7. Спирт.

Апарат Панченкова складається з штатива з капілярами (12 шт.) Шириною 1 мм,на стінці яких нанесені поділки від 0 (зверху) до 100 (знизу). На рівні
0 є буква К (кров), а на середині піпетки, біля позначки 50 - буква Р
(реактив).

Хід дослідження:

У капіляр Панченкова набирають 5% розчин лімоннокіслого натрію до позначки 50
(буква Р) і видувають на годинне скло. З уколу пальця, тримаючи капіляргоризонтально, набирають кров до мітки 0 (Буква К). Потім видувають кров нагодинний скло з лімоннокіслим натрієм, після чого вдруге набирають кровдо позначки 0 і випускають додатково до першої порції.
Отже, на годинному скельце є співвідношення цитрату і крові,рівне 1:4, тобто чотири обсягу крові в один обсяг реактиву. Перемішуютькров кінцем капіляра, набирають її до позначки 0 і ставлять в апарат
Панченкова строго вертикально. Через годину відзначають число міліметрівстовпчика плазми.

Оцінка отриманих даних:

У нормі ШОЕ дорівнює для чоловіків 4-10 мм, для жінок 4-15 мм за годину.

Визначення вмісту гемоглобіну

Обладнання та реактиви:

1. Гемометр Салі.

2. Піпетка від гемометра Салі.

3. 0,1 N HCI.

4. Дистильована вода.

5. Піпетка.

6. Скляна паличка.

7. Голка Франка або Скарифікатор.

Для кількісного визначення гемоглобіну користуються зазвичайколориметричні способом. Принцип визначення полягає в перетвореннігемоглобіну крові в солянокислий гематін і порівнянні кольору отриманого знаявними в приладі стандартом. Приладом для визначення служить гемометр
Салі. Він складається з двох запаянихпробірок зі стандартною кольоровою рідиною 1% розчин солянокислим гематінав гліцерині), що містить 16,67 г% гемоглобіну (16,67 г на 100 мл крові).
Між ними розташована Градуйована пробірка, що має дві шкали. Одна --з поділками від 0 до 23 служить для визначення гемоглобіну в грамах на 100мл крові, тобто в грам відсотках; інша шкала з поділками від 0 до 140показує одиниці гемоглобіну (відсоток гемоглобіну).

Хід дослідження:

у градуйованому пробірку, що знаходиться в середньому прорізі, наливають допочатку шкали 0,1 N розчин соляної кислоти. Потім з місця уколу на м'якотіпальця піпеткою Салі набирають кров до позначки 0,02 мл (20 мм 3), насасивая їїротом через надіти на верхній кінець піпетки гумову трубочку зіскляним мундштуком. Кінчик піпетки обтирають від крові і опускають впробірку з соляною кислотою, обережно видуваючи вміст, щоб неутворилися пухирці повітря. Б'ючи пальцем по нижній частині пробірки,ретельно розмішують кров і залишають її на 5 хв. для освітисолянокислим гематіна. За цей час набирають кров для іншої частинианалізу. Після закінчення цього часу доливають в пробірку по крапляхдистильовану воду, розмішують скляною паличкою до тих пір, поки коліррозчину досліджуваної крові повністю зрівняється з кольором стандартноїрідини. Відзначають, на якому розподілі знаходиться в градуйованою пробірцінижній меніск розчину крові, що показує вміст гемоглобіну в м% абоодиницях (відсотках).

Оцінка отриманих даних:

У нормі вміст гемоглобіну в грам-відсотках у чоловіків коливається від
13,3 до 18 г%, у жінок - від 11,7 до 15,8 г% (в середньому 13,7); в одиницях
(відсотках) у чоловіків - від 80 до 108 од., у жінок - від 70 до 95 од.

Визначення кількості еритроцитів і лейкоцитів

Обладнання та реактиви:

1. змішувачі (меланжери) або пробірки для підрахунку еритроцитів і лейкоцитів.
2. 3% - розчин NaCl (для розведення еритроцитів) або рідина Гайема.
3. 3% розчин оцтової кислоти.
4. Рахункова камера.

Змішувачі представляють собою капілярну піпетку з розширенням-ампулою,містить намистинку, що сприяє змішання крові з розводящий рідиною.
Змішувачі, призначені для підрахунку еритроцитів, мають капілярівтоншого калібру і більше об'ємистій ампулою на них нанесені мітки одна
- 0,5 інша - перед входом в ампулу - 1.0, третій - біля виходу з ампули -
101.
При набору крові до позначки 0,5 вона виявиться розведеною в 200 разів, принабору до 1,0 - у 100 разів. Для розведення еритроцитів застосовують 3%розчин кухонної солі або рідина Гайема, в якій краще зберігаєтьсяформа еритроцитів. Змішувач для лейкоцитів має більш широкий просвіткапіляра і меншу за величиною ампулу. Нанесені три мітки: 0,5, 1,0 і 11.
Це дозволяє розвести кров у 10, або в 20 разів (найчастіше розводять у 20 раз).
Для розведення лейкоцитів використовують 3 - 50% розчин оцтової кислоти.
Оцтова кислота розчиняє еритроцити, що дозволяє вести підрахунок тількилейкоцитів.

Рахункова камера.

Для підрахунку формених елементів найбільш часто застосовується камера типу
Бюркера з вигравіруваним на ній сіткою Горяєва. Рахункова камера складається зтовстого предметного скла з особливим поглибленням. На дні поглиблення лічильноїкамери вигравіруваний сітка, у клітинах якої і підраховуються форменіелементи. По краях поглиблення є підвищення, куди накладаєтьсяпокривне скло. Між нижньою поверхнею цього скла і дном поглибленняутворюється замкнутий простір, який і являє собою лічильнукамеру. Глибина камери відповідає 0,1 мм. Рахункова камера типу Бюркерарозділена навпіл глибокою канавкою і має на кожній половині сітку
Горяєва, що дозволяє відразу вважати 2 краплі, не заповнюючи знову камери.
Сітка Горяєва має 225 великих квадратів (15х15), 25 з яких розділеніна малі, по 16 у кожному; є також порожні квадрати, зібрані в групипо 4 квадрата. Всього в сітці 100 великих порожніх квадратів, зібраних у 25груп (5X5). Кожна сторона маленького квадратика дорівнює 1/20 мм, а так яквисота камери становить 0,10 мм, то обсяг дорівнює 1/4000 ММЗ.

Хід дослідження:

Для підрахунку еритроцитів беруть змішувач для еритроцитів, надягаютьгумову трубочку, легким насасиваніем набирають кров з уколу до позначки
0,5. Надлишок крові видаляють фільтрувальної папером, після чого кінчикзмішувача занурюють у приготований заздалегідь флакон з 3% розчиномкухонної солі або розчином Гайема і Насмоктувати розчин, заповнюючи всюампулу до позначки 101. Негайно знімають гумову трубку, затискають змішувач подовжині між великим і вказівним або середнім пальцем і струшують впротягом 3 хвилин. Після цього заповнюють лічильну камеру, зливають
1-2 краплі і випускають наступну краплю на сітку.

Для підрахунку лейкоцитів кров з місця уколу набирають до позначки 0,5, потімрозводять 3% розчином оцтової кислоти до позначки 11. Енергійно струшуютьпротягом 3 хвилин, після чого зливають
1-2 краплі і заповнюють лічильну камеру. При роботі з пробіркамидля підрахунку еритроцитів, наливають 4 мл 3% розчину кухонної солі аборідини Гайема і в неї випускають 0,02 мл. крові,відміряні піпеткою від гемометра Салі. Для підрахунку білих кров'янихелементів в пробірку наливають 0,4 мл 3 - 5% розчинуоцтової кислоти і 0,02 мл крові. Енергійно струшують пробірки, потім врідина опускають піпетку з гемометра Салі і,набравши вміст, заповнюють лічильну камеру.

Заповнення лічильних камер:

Добре вимите і витерті шліфоване покривне скло накладають навиступаючі бічні краї. М'якоттю великих пальців покривне склопритирають, рухаючи вгору і вниз, весь час щільно притискаючи, поки нез'являться, так звані, Ньютонови кільця. Перед заповненням камери зновуенергійно струшують змішувачі. випускають 2 краплі на фільтрувальнийпапір, а третій заповнюють щілину між камерою і покривним склом.
Рідина по капілярності засмоктується між ними і заповнює простірнад сіткою. Рідина при заповненні камери не повинна затікати в жолобки,якщо це стукає, то її видаляють фільтрувальної папером.

Підрахунок еритроцитів. Підрахунок проводять через 1-2 хвилини (колиеритроцити осядуть на дно камери), користуючись об'єктивом 40Х і окуляром 7X,або об'єктивом 8Х і окуляром 15Х.

Щоб не збитися з рахунку, дотримуються певноїпослідовності рахунку: пересуваючи з квадрата в квадрат згоризонталі один ряд зліва направо, наступний - справа наліво. Вважають,крім що знаходяться всередині квадрата, всі еритроцити, що лежать на двох лініях,наприклад, на лівій і верхній, і пропускають все що лежать праворуч і знизу.
Вважати еритроцити треба в 5 великих квадратах, тобто в 80 маленьких.

Щоб уникнути неточності, внаслідок не цілком рівномірногорозподілу крові в камері, вибирають для підрахунку не 5 сусідніхквадратів, а просуваються по всій сітці.

Кількість еритроцитів в 1 ММЗ (шукане) обчислюють таким чином:одиницею рахунку завжди, при кожній підрахунку, в будь-якій сітці служить малийквадрат. Обсяг його, як було зазначено, дорівнює 1/4000 мм 3. Злічивши еритроцитив 5 великих квадратах (80 малих квадратів), ділять цю кількість на 80 імножать на 200 (ступінь розведення крові) та на 4000 (щоб отриматикількістьклітин у всьому кубічному міліметрі); практично, отже,отримане число множать на 10000 (додають чотири нулі).
Приклад: У 80 маленьких квадратах підраховано 480 еритроцитів.
Отже, кількість еритроцитів в 1 ММЗ крові одно:

480 * 4000 * 200

------------ = 4 800 000 < p> 80
Підрахунок лейкоцитів. Для отримання достатньо точного результату припідрахунку лейкоцитів необхідно порахувати не менше 100 великих квадратів
(= 1600 малих). Кількість лейкоцитів в 1 мм 3 отримують у такий спосіб:число, перелічене в3100 великих квадратах, ділять на 1600 (призводять до 1малому квадрату) і множать на 20 (ступінь розведення) і на 4000;практично, скорочуючи постійні цифри формули, кількість переліченілейкоцитів (при розведенні в 20 разів) множать на 50.
Приклад: у 100 великих квадратах злічило 120 лейкоцитів.
Отже, кількість лейкоцитів в 1 ММЗ одно

120 * 4000 * 20

-----------= 6000

1600

Оцінка отриманих даних:

Нормальна кількість еритроцитів в 1 ММЗ від 4500000 до 5000000. У нормісередня кількість лейкоцитів в 1 мм 3 від 5000 до 9000 (крайні межі 4000
- 9000).

Обчислення колірного показника:

Знаючи число еритроцитів у крові і вміст у ній гемоглобіну, можнавирахувати якою мірою насичений кожен еритроцит. Колірний показниквідповідає максимальному вмісту гемоглобіну в одному нормальномуеритроциті, величина його умовно приймається за одиницю.

Для обчислення колірного показника користуються такою формулою:

знайдене кількість Нв знайдене число еритроцит.

----- -------------------: ------------------------- нормальна кількість Нв нормальне число еритроцит.

Практично визначення колірного показника виробляють шляхом діленнявідсотка (одиниць) гемоглобіну на подвоєні дві перші цифри числаеритроцитів. Якщо ж кількість еритроцитів менше 1000000, то відсоток Нвділиться на подвоєну першу цифру числа еритроцитів.

Приготування мазків:

Мазок крові роблять зазвичай слідом за наповненням обох змішувачів. Витираютьпалець і користуються свежевиступівшей краплею крові. Кров беруть на предметнескло, яке має бути ретельно знежирена. Потім шліфованимпредметним склом,або товстим покривним склом, що ставлять на перше предметне склопід кутом 45 'в безпосередній близькості від краплі крові, щоб вонарозтікалася тонким шаром по ширині шліфованого скла, роблять на ньомумазок. Добре зроблений мазок жовтуватого кольору, просвічує. Слідом зацим мазок фіксують.
Фіксація мазка робиться для того, щоб ущільнити протоплазму форменихелементів крові і зробити мазок більш стійким. Висохлий на повітрі мазокзанурюється для фіксації в банку з метиловим спиртом на 1 - 3 хв., або всуміш Нікіфорова, що складається з рівних частин етилового спирту та ефіру, на
10-20 хвилин. Після закінчення фіксації мазки виймають пінцетом і ставлять ввертикальному положенні на фільтрувальний папір для висушування.
0крашіваніе мазка здійснюється, як правило, за допомогою суміші декількохфарб. Найбільш широко застосовується фарбування мазка за Романовським - Гимзе.
Перед вживанням фарбу розводять дистильованою водою з розрахунку 1 - 2краплі на 1 мл води. Мазки укладають на містки з скляних паличок,що спираються на краю кювети, і заливають барвником у максимальномукількості, яка може втриматися на склі. Тривалість забарвлення
30 хвилин. Після фарбування барвник змивають струменем води, а мазки ставлятьвертикально на фільтрувальний папір для просушування.

Забарвлення ретикулоцитів:

1. Предметні скла (знежирені).

2. 1% розчин брілліанткрезілблау (спиртової).

3. Шліфувальне предметне скло.

4. Чашка Петрі.

5. Фільтрувальний папір.

6. Скляна паличка.

7. Иммерсионное масло.

Методика фарбування:

На знежирене абсолютно чисте предметне скло наносять скляноюпаличкою краплю 1% алкогольного розчину фарби брілліанткрезілблау.
Шліфувальні предметним скломцю краплю розмазують так само, як при готуванні звичайногомазка крові. Після підсихання барвника на нього наносять краплюкрові і роблять тонкий мазок, який відразу поміщають у вологу камеру
(чашка Петрі із вкладеним у неї шматочком мокрій фільтрувального паперу).
Через 3-5 хвилин мазок виймають, висушують на повітрі і досліджують підмікроскопом з іммерсіей.
Під мікроскопом еритроцити при цій забарвленням жовтувато-зеленуватого кольору; вокремих же еритроцитах помічається синясіточка, іноді мізерна і ніжна, іноді рясна, зерниста --це і є ретикулоцити.

Підрахунок ретикулоцитів проводиться так:

підраховують в полі зору 1000 еритроцитів і відзначають скільки серед нихретикулоцитів. Знайдене кількість ділять на 10. Нормальний вмістретикулоцитів в крові 0,2 - 1,0%.

Підрахунок лейкоцитарної формули:

лейкоцитарної формулою називають процентне співвідношенняокремих форм лейкоцитів крові. Для більш точного її обчислення необхіднопереглянути не менше 200 лейкоцитів. Так як різні види лейкоцитіврозподіляються по мазку нерівномірно,необхідно дотримуватися таких правил: проводити підрахунок поверхньому та нижньому краю мазка, пересуваючи мазок по зигзагоподібної лінії.
Вважають три поля по самому краю в горизонтальному напрямку, потім - триполя, прямуючи до середини мазка, і т. і. Отже, у кожному зчотирьох ділянок налічують 50 клітин, а всього - 200. Для підрахункулейкоцитарної формули використовують спеціальний клавішний лічильник, на кожномуклавіші якого відзначається початкова 6yква назви лейкоцитів. Результатипідрахунку лейкоцитарної формули записуються у вигляді лейкограми, яка має внормі приблизно такий вигляд:

| нейтрофіли |
| Кiльк. | базо-ф | еозином-фил | юні | палички-яд | сегменті-яд | лімфо-ц | моно-ц |
| Лейкоцит | мули | и | | ерние | ерние | іти | іти |
| ів | | | | | | | |
| 8000 | 1% | 4% | 0 | 4% | 60% | 25% | 6% |

Мікроскопічна картина крові:

Еритроцити - Без'ядерна клітка, фарбуються кислими фарбами в рожевийколір і має форму кілька сплощене кола з вдавлення в центрі.
Діаметр в середньому близько 8 мікрон.
Лейкоцити розрізняються серед еритроцитів за їх більшою величиною, за наявністюядра і за характером забарвлення. Розрізняють лейкоцити: базофільні,еозинофільні, нейтрофільні, лімфоцити і моноцити.
Перші три види об'єднуються в групу гранулоцитів, тобто клітин упротоплазмі яких є зернистість.
базофіли - клітини розміром 12 - l4 мікрон, з ядром невизначеної форми.
Протоплазма містить численні великі зерна, забарвлюється вфіолетовий колір. Кількість клітин не перевищує 0,5-1%.
Еозинофіли - клітини розміром 12 - 15 ", мають сегментоване ядро у виглядідвох грушовидних сегментів, з'єднаних між собою тонким містком.
Найбільш характерною ознакою еозінофіла є зернистість протоплазмияскраво-червоного кольору. Кількість еозинофілів в нормі від 1 до 4%.
Нейтрофіли - круглі клітини, середня величина 9 - 12 мікрон.
Протоплазма рожевуватим з дрібною зернистістю червонувато -фіолетового кольору. Ядро складається з 2-х, 4-х і більше сегментів, з'єднанихміж собою тоненькими містками, фарбується основними фарбами у синьо -фіолетовий колір. Сегментоядерние нейтрофіли становлять від 50 до 68%. Уменш зрілих клітинах ядровитягнуто у вигляді палички, так звані палички-ядерні нейтрофіли 1-4%.
Ще рідше, близько 1%, зустрічаються нейтрофіли зкруглим ядром - юні форми. Збільшення числа палички-ядерних, появаюних, аж до миелоцитов, носить назву зсуву вліво, аборегенеративного зсуву. Зрушенням в право називається зміна формулилейкоцитів у бік збільшення більш зрілих клітин.
Лімфоцити - клітини розміром 7 - 9 мікрон. Лімфоцити бувають малі, середніі шірокопротоплазменние. Ядро кругле або овальне, синьо-фіолетового кольору;іноді воно має з одного боку гостре поглиблення. Протоплазма блакитна,нерідко розрізняються яскраво-червоні зерна. Навколо ядра залишається безбарвний абобільш блідий обідок. У нормі лімфоцити складають 25 - 38%.
Моноцити - найбільша клітина нормальної периферичної крові. Діаметр
12-20 мікрон з великим овальним ядром, ниркоподібним або підковоподібноїформи. Забарвлення ядра світліше, ніж у нейтрофілів і лімфоцитів, протоплазмасіро-блакитного кольору з дрібної азурофільной зернистістю. Моноцити складають
6-8% всіх лейкоцитів крові.

Визначення тривалості кровотечі з Дуке

0борудованіе і реактиви:

1. Голка Франка або Скарифікатор.
2. Фільтрувальний папір.
3. Секундомір.

Хід дослідження:

голкою Франка роблять укол глибиною 3 мм в м'якоть пальця або мочку вуха.
Мимовільно що виступає кров знімається кожні 15-30 секундфільтрувальної папером. Через 1-3 хвилини знята фільтрувальної паперомкрапля стає маленькою, потім папір зовсім не фарбується. Проміжокчасу від моменту появи першої краплі крові до припинення фарбуванняфільтрувального паперу позначається як тривалість кровотечі.

Оцінка отриманих даних:

Нормальна тривалість кровотечі 2 - 4 хвилини.

Визначення часу згортання крові за способом Бюркера

Обладнання та реактиви:

1. Годинний скло.

2. Чашка Петрі з вологою фільтрувальної папером на дні.

3. Тонка скляна паличка або голка.

4. Голка Франка або Скарифікатор.

5. Дистильована вода.

6. Секундомір

Хід дослідження:

На годинне скло наносять одну краплю прокип'яченої дистильованої води.
Голкою Франка роблять укол у м'якоть пальця, першу краплю знімають, а другананосять на годинне скло, помішують тонкою скляною паличкою. Часвзяття крові відзначають за секундоміром. Годинний скло поміщають в чашку
Петрі. Найкраще проводити дослідження при температурі 25'C. Кожніпівхвилини тонкою скляною паличкою або голкою торкаються до краплі крові відцентру до периферії до тих пір, поки за паличкою не потягнуться перший ниточкифібрину, після чого зазначають час появи їх.

Оцінка отриманих даних:

У здорових людей час згортання за методом Бюркера одно 5-6 хвилин.