Цей файл взят из коллекции Medinfo http://www.doktor.ru/medinfo http://medinfo.home.ml.org

E-mail: [email protected] or [email protected] or [email protected]

FidoNet 2:5030/434 Andrey Novicov

Пишемо реферати на замовлення - e-mail: [email protected]

У Medinfo для вас найбільша російська колекція медичних рефератів, історій хвороби, літератури, навчальних програм, тестів.

Заходьте на http://www.doktor.ru - Російський медичний сервер для всіх!

ВСТУП

Якщо Х1Х століття по-праву увійшов в історію світової цивілізують-ції, як Століття Фізики, то стрімко що завершується ХХ століття, в якому нам пощастило жити, цілком ймовірно , уго-това місце Століття Біології, а може бути і Века Генетики.

Дійсно, за неповних 100 років після вторинного відкриття законів Г. Менделя генетика пройшла тріумфальний шлях від на-турфілософского розуміння законів спадковості і мінливий-с - , через експериментальне накопичення фактів формальної генетики до молекулярно-біологічному розуміння сутності ге-ну, його структури і функції. Від теоретичних побудов про гені як абстрактної одиниці спадковості до розуміння його матеріальної природи як фрагмента молекули ДНК, що кодує амінокислотних структуру білка, до клонування індивідуаль-них генів, створення докладних генетичних карт людини і тварин, ідентифікації генів, мутації яких пов'язані з тяжкими спадковими недугами, розробки методів биотех-нології та генної інженерії, що дозволяють направлено отримувати організми із заданими спадковими ознаками, а також проводити спрямовану корекцію мутантних генів людини, тобто генотерапію спадкових захворювань. Молекулярна ге-нетіка значно поглибила наші уявлення про сутність життя, еволюції живої природи, структурно-функціональних ме-ханізмах регуляції індивідуального розвитку. Завдяки її успіхам започатковано розв'язання глобальних проблем людства, свя-занних з охороною його генофонду.

Природно, що можливість маніпуляції з індивідуаль-ними генами людини і тварин ще недостатня для розумі-ня функції всього геному, його організації в цілому , взаємо-дії його частин у забезпеченні всього різноманіття механізми мов онтогенезу, тобто розвитку однієї клітини до цілого орга-нізма. Якщо додати до цього, що в геномі будь-якого виду за-писана не лише програма індивідуального розвитку, але зако-ліквідувати і вся еволюція виду, тобто його філогенез, стано-вітся зрозумілим наскільки логічною і методично своєчасної з'явилася Міжнародна наукова програма "Геном людини" . На-ряду з аналогічними програмами для інших видів (лаборатор-ні миші, нематоди) програма Геном людини, розпочата близько

10 років тому, вже до 2 000 році дозволить повністю розшифрують-ти первинну структуру ДНК, тобто ідентифікувати всі гени людини, їх регуляторні елементи. Захватиающая Одіссея про спадковість, якої і є ця програма, безмірний-но розширить наші уявлення про структуру та функції геному, його еволюції, відкриє горизонти настільки захоплюючого, а, віз-можна, і не менш небезпечного спрямованого впливу людини на геном рослин, тварин і , що особливо ризиковано, на свій власний геном. Важливо усвідомити, що це не завтрешній день фундаментальної науки, не віддалені абстракції, але день сьогоднішній. Він уже настав і став реальним незалежно від нас, і, якщо не бути до нього готовим концептуально і методи-но, то пройде крім нас.

Предлгаемая вашій увазі книга, дійсно, являє собою введення в молекулярну генетику спадкових хвороб і розрахована на досить широку аудиторію медиків і біологів. Для більшості з вже складався-шіхся фахівців у цих областях - це реальна можливість для самоосвіти, якої, на жаль, з роками ми так часто пре-небрегаем, заплутавшись у повсякденних турботах. Для студентів біофаку і особливо для студентів-медиків - ця книга цілком може розглядатися як навчальний посібник по молеку-лярні основ медичної генетики. Однак, і для перших і для других, на глибоке переконання авторів, багато років віддавши-ших впровадження досягнень молекулярної біології в медіцінскуюя практику, книга може служити в якості довідкового керів-ництва з молекулярної генетики людини. Дійсно, ні одна клінічна дисципліна (за винятком, може бути, служби організації охорони здоров'я) не мислима сьогодні без знань і певних навичок з молекулярної генетики. Ні один біолог, зайнятий питаннями спадковості, мінливий-с-, онтогенезу чи еволюції незалежно від конкретного біо-логічного об'єкта, не може ігнорувати людину, як од-ного з поки не багатьох біологічних видів з повністю розшифрованої структурою геному. Швидко набирає сили мо-лекулярная медицина, викладання азів якої все ще явно недостатньо для майбутніх лікарів, насправді являє собою принципово новий якісний рівень у розумінні питань етіології, патогенезу, а, отже, і лікування багатьох хвороб, як спадкової моногенних, так і муль-тіфакторіальной природи.

На нашу думку, не тільки сучасний лікар і спеціа-лист-біолог, але й кожний освічена людина сьогодні повинен знати про тріумф Міжнародного Наукового Співтовариства у виконанні нии програми Геном людини, в результаті якої успішно розшифровуються всі гени людини, кожен з яких, будучи виділеним з організму і проклонірованним може виступати в якості лікувального препарату для генотерапіі. Про те, що вже сьогодні ідентифіковано на генетичних картах більше 5 000 структурних генів і понад 60 000 поки невідомих смислових і анонімних послідовностей ДНК. Про те, що всього за 5 років після перших успішних спроб введення чужорідних маркерних генів до клітин людини in vivo, число вже схвалених для клінічних випробувань програм з генної терапії спадщині-них захворювань досягла понад 100! Ці підсумки здаються особливо впечетляющий якщо врахувати, що згідно з даними Все-мирної Організації Охорони здоров'я близько 2,4% усіх новорож-денних на земній кулі страждає тими чи іншими спадковими порушеннями; близько 40% ранньої дитячої смертності і Інва-лідності з дитинства обумовлені спадкової патології - їй. Не можна не згадати про реальні досягнення молекулярної генетики в розшифровці спадкових факторів таких бичів людства як ішемія серця, атеросклероз, діабет, Онкол-ня та інфекційні захворювання. Чи адекватно сприймати що відбувається на наших очах революцію в біології і в медици-ні, вміти скористатися її плодами привабливими і уникнути небезпечних для людства спокус - ось що необхідно се-придатним і лікарям, і біологам, і представникам інших суміжних спеціальностей, і просто освіченій людині.

Саме ця мета, ця надзавдання, поставлене перед дан-ною монографією, заповнювати, на думку авторів, намітивши-шійся у вітчизняній науковій літературі прогалину в області мо-лекулярних аспектів медичної генетики і генетики людини.

Окремі огляди, монографії (Шишкін, Калінін, 1993), пере-водна література з молекулярної біології і навіть грунтовний-ні зведення, що підводять щорічні підсумки робіт за програмою

"Геном людини" досить фрагментарні і стосуються лише від-ділових аспектів проблем генодіагностікі і генотера-ПІІ. Розраховані переважно на фахівців з молекуляр-ної біології. Завдання даної монографії не тільки освітити сучасний стан справ в молекулярної діагностики та лікування-ванні спадкових хвороб методами генної терапії, але, головним чином, підготувати читачів, перш за все лікарів та біологів, до розуміння і сприйняття цієї методично і концеп-туально досить складною обасті генетики .

Для досягнення поставленої мети нам уявлялося ло-гічної розпочати виклад матеріалу з опису структури та сов-ремінних методів аналізу ДНК, з загальних уявлень про її КЛО-вання, секвенування, геномних бібліотека (Глава I).

Глава II повністю присвячена структурі геному людини, нової трактуванні поняття "ген", генним домами, варіабільним структурам геному. Генетичні карти, принципи їх побудови ня, функціональне та позиційне картування, молекулярні маркери, сучасні досягнення в розробці фізичних та хромосомних карт людини і в картуванні генів, ответствен-них за спадкові захворювання розглянуто в Главі III.

Глава IV цілком присвячена опису молекулярних методів де-текціі як вже відомих мутаційних змін у структурних генах, так і методів сканування передбачуваних мутацій оп-ределенних генів. Опис прямих методів ідентифікації му-Тацій доповнені непрямими методами, заснованими на молеку-лярні маркування мутантних генів. Всі ці методи, як прямі, так і непрямі, складають основу молекулярної ді-агностики моногенних спадкових хвороб, широко вико-зуются у генетиці людини при побудові генетичних карт, дослідженні проблем філогенезу, в популяційної гентіке і в геномної дактилоскопії, тобто для ідентифікації особистості .

докладного аналізу внутрішніх (ендогенних) чинників мутагени-неза, а також принципам популяційного аналізу мутацій присвячена Главі Y. Основні підходи, які використовуються при вивчений-ванні експресії генів у модельних безклітинних системах, на рівні окремих клітин і цілих організмів наведені у Главі

VI. Принципи молекулярної діагностики спадкових болез-ній і, зокрема, пренатальної діагностики, а також осо-сті виявлення гетерозиготною носійства в сім'ях виского ризику, викладені в Главі VII. Невелика за розміром, але важлива також і для розуміння принципів генної терапії

Глава VIII стосується штучного створення генетичних мо-делей спадкових захворювань, зокрема на базі трансгенних жівоних. Описано використовувані при цьому методи направленого перенесення чужорідних генів в еукарiотичнi системи. У Главі IX викладені основи генотерапіі спадщині-них захворювань, розглянуті методи доставки чужорідної ДНК в клітини людини in vitro і in vivo, переваги і не-статки існуючих векторних систем (фізичних, хі-чеських і біологічних), їх конструювання, преспектіви створення "ідеальних "векторних систем. Коротко розглянуті підсумки вже проведених випробувань за генотерапіі тих заболева-ний, для яких Програми клінічних випробувань вже схвалений-ни або знаходяться на стадії експерименту. У заключному розділі (Глава X) ми вважали за доцільне підвести некот-рие підсумки і більш докладно розглянути молекулярну діаг-ностіку трьох груп спадкових захворювань: (1) достатній-но повно вивчену групу лізосомних хвороб накопичення;

(2 ) хвороби експансії (переважно нейродегенеративні захворювання), які викликаються зовсім новим раніше невідомим типом так званих "динамічних" мутацій і (3) найбільш часті, соціально значущі спадкові захворювання, з пренатальної діагностики яких молекулярними методами вже накопичений досить великий досвід в нашій лабораторії і в інших медико-генетичних центрах Росії.

Отже, пропонована монографія розрахована на досить широке коло читачів, але, перш за все, на медиків та біолого-гов, а також фахівців суміжних професій. Нам хотілося б думати, що книга буде особливо корисною для студентів міді-цінських інститутів та академій, лікарів курсів підвищення Квалі-сифікацію, працівників медико-генетичних консультацій і цент-рів, а також для студетнов-біологів, багато з яких, як показує наш досвід, поповнюють ряди спеціалізованих діаг-ностіческіх лабораторій, медико-генетичних центрів і інсти-Тутов.

Розділ III

ГЕНЕТИЧНІ КАРТИ, позиційних КЛОНУВАННЯ.

розділі 3.1 Класифікація генетичних карт, оцінка зчеплення.

Генетичні карти визначають хромосомну приналежності-ність і взаємне розташування різних компонентів геному щодо один одного. Можливість побудови таких карт обумовлена двома фундаментальними характеристиками геному: лінійним характером локалізації генів в хромосомах (це визначав лінійністю молекули ДНК) і відносної ста-нестабільність розташування облігатних елементів геному У МЕЖАХ виду. При побудові генетичних карт використовують різні підходи. У першу чергу, до них належать аналіз генети-чеського зчеплення на основі визначення частот мейотіческой рекомбінації в інформативних родинах і вивчення особливостей успадкування ознак, зчеплених з маркерними хромосомними перебудовами. По-друге, дослідження експресії генів або пошук специфічних послідовностей ДНК у клітинних гинув-рідах, що містять лише частину генома людини - одну або кілька хромосом або їх фрагменти. У ряді випадків з цією метою використовують механічний сортінг цілих хромосом і навіть їх відносно невеликих участковв. Ці прийоми дозволяють прив'язати картіруемий ген до певної хромосомі і навіть до певного фрагменту хромосоми. За допомогою комплексу весь-ма тонких методів хромосомного аналізу, перш за все, мето-дів гібридизації in situ (див. Розділ I) вдається картіровать окремі гени на хромосомах людини часто з точністю до одного бенду. І, нарешті, методами молекулярного аналізу здійснюють фізичне картування послідовностей

ДНК, локалізованих в специфічних ділянках хромосом. Потім проводять ідентифікацію в цих послідовностях транскр-біруемих областей, тобто генів, з наступною ізоляцією і клонуванням відповідних їм повнорозмірних молекул Комплементарна ДНК. Кожен з розглянутих етапів аналізу структури гено-ма завершується побудовою карт генів, що розрізняються за оди-ніцам вимірювання відстаней між окремими елементами цих карт, масштабами, за насиченістю або ступеня деталізації на різних ділянках геному. Відповідно розрізняють карти зчеплення, генетичні карти, цитогенетичні карти інді-виділеного хромосом і фізичні або молекулярні карти оп-ределенних ділянок ДНК. Для повної молекулярної ідентіфіка-ції окремих елементів геному, тобто визначення їх гра-ниць, структури і нуклеотидної послідовності, необхідно поєднання всіх типів карт в місцях локалізації цих елементів-тов.

Першим кроком на шляху побудови генетичних карт є-ється формування груп зчеплення генів, що контролюють різні спадкові ознаки, і дослідження їх взаємо-ного розташування в цих групах. На наступному етапі визна-ділячи відповідність між генетичними групами зчеплення та цитогенетичних ідентифікованим хромосомами або їх фрагментами. Цитогенетичні ідентифікацію хромосом прово-дят з використанням методів диференціальної забарвлення

(див.розділ 3.2). У міру появи все більшого числа лока-лізованних ознак ефективність побудови генетичних карт значно зростає, тому що збільшується кількість маркованих ділянок хромосом і, таким чином, з'являючись-ється можливість комбінованого використання різних експериментальних підходів для більш докладного досліджень-ня цих ділянок.

Принципова схема картування невідомих генів, представлена на мал.3.1, включає наступні етапи. 1. Ви-яснень групи зчеплення; 2. Пошук найближчих фланкуючі маркерів; 3. Визначення фізичної області (ДНК-послідовно-ності), що включає шуканий ген; 4. Клонування набору фрагментів ДНК, що перекривають досліджувану область; 5. Виокрем-ня з цього набору клонів, що містять транскрібіруемие

ДНК-послідовності, імовірно відповідні гену чи його фрагментом; 6. Аналіз специфічних мРНК і КЛО-вання Комплементарна ДНК-послідовності; 7. Секвенування та ідентифікація самого гена (Wicking, Williamson, 1991).

Розглянемо докладніше цю схему.

Побудова карт зчеплення засноване на вивченні про-процесів розбіжності і рекомбінації гомологічних хромосом у мейозі. Генетичні ознаки, локалізовані в різних хро-мосомах, не зчеплені один з одним, тобто передаються від батьків дітям незалежно, і частота їх рекомбінації (Q) складає 0.5. Це обумовлено випадковим характером розходження гомологічних хромосом у мейозі під час редук-Ціон поділу. Гени, локалізовані в одній хромосомі, рекомбінують за рахунок Кросинговер, тобто за рахунок обміну ділянками гомологічних хромосом у процесі їх спарювання в мейозі (Ріс.3.2). При цьому порядок генів не порушується, але серед нащадків можуть з'явитися нові комбінації батьківських алелей. Імовірність Кросинговер між двома генами за-висить від відстані між ними. Чим ближче ге?? и розташовані один до одного, тобто чим більше вони зчеплені, тим ця ве-роятность менше.

Оцінку зчеплення між генами проводять на підставі статистичного аналізу сегрегації ознак в сім'ях з розгалуженими родоводом. Найчастіше при цьому використовують метод максимальної правдоподібності (Kao, 1983), тобто підраховують десятковий логарифм шансів - lod (log of the odds), де шанси (odds) виражаються як відношення Веро-ності спостерігається родоводу за умови, що два гени зчеплені ( 0 3, гени локалізують вироб-ником в одній хромосомі, причому максимально правдоподібна оцінка відповідає максимальному значенню lod. При значен-пах lod <-2 гени не зчеплені, тобто локалізовані в раз-них хромосомах або на різних кінцях однієї хромосоми. Ста-тістіческую обробку родоводів зазвичай проводять за допомогою комп'ютерних програм, найвідоміші з яких прог-Рамі LIPED, CRIMAP і LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;

Terwilliger, Ott, 1994). На генетичних картах зчеплення відстань між генами визначається в сантіморганах (см).

1 см відповідає 1% рекомбінації. Загальна довжина геному людино в цих одиницях складає близько 3300 см. Сопостав-додаючи цю величину з розміром гаплоїдного набору молекул ДНК, можна зробити висновок, що 1 см приблизно еквівалентний 1 мільйону пар нуклеотидів. Такі розрахунки, однак, досить приблизні, тому що частоти рекомбінації, а значить і реальна довжина одного см, можуть сильно варіювати в раз-особистих частинах геному. Існують, так звані, гарячі точки рекомбінації, також як і райони геному, де рекомбі-нація пригнічена (центромерние і теломерна ділянки хро-мосом, блоки конститутивного гетерохроматину та ін.) Через Вестн також, що частота рекомбінації у чоловіків менше, ніж у жінок, так що загальна довжина чоловічого геному, виміряна в одиницях рекомбінації, становить лише 3000 см. Таким обра-зом, генетична відстань може дати лише вельми оріен-тіровочную інформацію про фізичний (реальному) відстані, що виражається в парах нуклеотидів.

розділі 3.2 Соматична гібридизація, цитогенетичний аналіз, картування анонімних послідовно-ності ДНК.

До початку 70-их років побудова генетичних карт людино просувалася дуже повільними темпами. Невеликий раз-мер сімей, тривалий період одного покоління, обмежене число інформативних родоводів і відсутність методів ефекти-тивного цитогенетичного аналізу всіх пар хромосом затруд-ло цілеспрямоване картування генів людини. Достатній-але сказати, що 1-й ген людини - ген кольоровий сліпоти був картірован на Х-хромосомі в 1911р., А 1-й аутосомним ген-тільки у 1968р. До 1973р. на хромосомах людини було карти-рова всього 64 гена, а до 1994 на генетичних картах чоло-століття було локалізовано вже понад 60 000 маркерних послідовностей ДНК, у тому числі близько 5 000 структурних генів - Ріс.3.3. Настільки стрімкий прогрес в картірова-ванні генів людини пов'язаний з появою нових технологій в цитогенетики, в клітинних культурах і особливо в молекуляр-ної генетики.

Техніка соматичної гібридизації, то є можливість експериментального конструювання здатних до розмноження міжвидових клітинних гібридів , стала одним з найбільш потужних інструментів для знаходження зв'язків між групами зчеплення та цитогенетичних ідентифікованим хромосомами і навіть їх окремими сегментами. Гібридні клони отримують пу-тем штучного злиття культивованих соматичних кле-ток різних видів, зокрема, клітин людини і різних гризунів - китайського хом'ячка, миші, щури (Шия, 1985).

Культивування таких соматичних гібридів, як виявилося, супроводжується втратою хромосом людини. Так були отримані панелі гібридних клітинних клонів, що містять всього одну або кілька хромосом людини і повний набір хромосом іншого виду. Виявлення людських білків, специфічні-чеських мРНК або послідовностей ДНК в таких клонах поз-воля однозначно визначити хромосомну приналежність відповідних генів. У такий спосіб вдалося локалізувати більш 250 аутосомним генів людини (Kao, 1983).

Подальший прогрес в області генетичного картірова-вання значною мірою асоціюється з діяльністю багатьох науково-дослідних центрів і лабораторій по створенню банків клітинних культур, що представляють найбільш цікаві та обширні родоводи. Так, у Центрі по Вивченню

поліморфізму Людини (CEPH) (Париж, Франція) була створена унікальна колекція перевіваемих клітинних культур від усіх членів сімей, багатоступінчасті родоводи яких насчіти-вають багато десятки і навіть сотні індивідуумів (CEPH - сім'ї)

(Todd, 1992; Weissenbach et al, 1992). Перевіваемие лінії кле-ток отримували з первинних культур, трансфорірованних вірусом

Епштейн-Барра, після чого такі лімфобластозние клітини ста-новятся "безсмертними", тобто можуть необмежено довго підтримуватися в умовах культивування. CEPH-родини представляють собою ідеальні системи для генетичного ана-лізу спадкових ознак. У результаті дослідження цих клітинних ліній визначено генотипи членів CEPH-сімей одночасно за тисячами поліморфних локусів і побудовані відповідні генетичні карти. Крім того, спільними зусиллями багатьох лабораторій світу були створені Банки Клеточ-них Культур, в яких підтримуються колекції лімфоб-ластозних ліній клітин, отриманих від членів найбільш інфор-нормативну сімей, в яких спостерігається сегрегація за различ-вим спадковим ознаками, в тому числі по моногенних за-болеваніям. Матеріал цих ліній у вигляді клітинних клонів або зразків ДНК використовується, зокрема, для аналізу зчепл-ня сегрегуються генів з відомими генетичними маркерами або з знову описаними поліморфними локусами. Таким чином, у багатьох випадках при картуванні генів людини вдається подолати обмеження, пов'язані з нестачею великих ін-Формативний родоводів.

Нарешті, на початку 70-х років з'явилася реальна можли-ність точної ідентифікації не тільки всіх хромосом у Каріо-тип людини, але і їх окремих сегментів. Це пов'язано з появою методів диференціального фарбування препаратів метафазних хромосом, які, по суті, зробили революцію в цитогенетики і хромосомологіі. Для отримання диференціали-ною забарвлення хромосомні препарати фарбують деякими флю-орохромамі, або, після відповідної протеолітичної про-ництва або нагрівання, - барвником Гимзе. При цьому на хро-мосомах виявляється характерна поперечна смугастість, так звані бенди, розташування яких специфічно для кожної хромосоми. На метафазних хромосомах малому ступені спіраліза-ції ідентифікується близько 750 таких смуг, на прометафазних хромосомах 2 500 - 3 000. Отже, величина невеликих бендів на прометафазних хромосомах приблизно відповідає 1 см на цитогенетичних картах або 1 мільйона пар основ на фізичних картах. Такі орієнтовні розрахунки, як уже згадувалося, виявляються корисними при зіставленні масштабів різних генетичних карт.

Відповідно до офіційно затвердженої номенклатурі

(ISCN, 1971) кожна хромосома людини після диференціальної забарвлення може бути розділена на сегменти, нумерація яких починається від центромерного району вгору (коротке плече - р), або вниз (довге плече - q) (Ріс.3.4). Смуги в кожному сегменті також пронумеровані в аналогічному порядку. Великі смуги часто підрозділяються на кілька частин, відповідної більш дрібним бенду, що виявляються тільки при ок-Раск малоспіралізованних прометафазних хромосом. Запис по-розкладання гена на цитогенетичної карті включає номер хро-мосоми, плече, а також номер сегмента, бенду і його суб'еді-ницы. Наприклад, запис 7q21.1 означає, що ген локалізована в субодиницею 1, 1-го бенду 2-го сегменту довгого плеча хромосоми 7.

Така детальна запис особливо зручна при використанні-ванні для цитогенетичного картування методу гібридизації in situ (см.Главу I), що дозволяє локалізувати ген з точністю до одного бенду і навіть його субодиниці. Основу данно-го методу, як вже зазначалося становить гібридизація ге-Автономній ДНК цілих хромосом на різних стадіях їх спіралізаціі з попередньо міченими специфічними ДНК-зондами.

Джерелом останніх можуть служити геномні послідовник-ності ДНК, зчеплені з картіруемим геном, або Комплементарна ДНК-овие послідовності. В даний час з тканеспеціфіческіх бібліотек генів виділено близько 20 000 анонімних послідовно-ності Комплементарна ДНК, що представляють більше 10 000 різних генів людини (Sikela, Auffray, 1993). Ці Комплементарна ДНК становлять при-мірно 10-15% всіх кодують послідовностей геному. Ме-тодом гібридизації in situ вже ідентифіковано більше 2000 генів, для багатьох з яких поки що не знайдено зчеплення з по-ліморфнимі маркерами (Poduslo et al., 1991). Такі кодують-щие послідовності присутні на карті генів людини, але їх поки що немає на картах зчеплення.

Розділ 3.3 Генетичні індексні маркери.

Як ми вже зазначали раніше, успішна локалізація неіз-Вестн спадкового ознаки (гена) значною сте-пені визначається присутністю на карті фланкуючі марці-рів, що знаходяться на відносно невеликій відстані по обидві сторони від гена. В якості генетичних маркерів специфічні-чеських ділянок хромосом можуть бути використані будь-які лока-лізованние в цих ділянках елементи генома з високим рівнем легко ідентифікованої популяційної мінливості або полі-морфізма. Відбір зчеплених з картіруемим ознакою генети-чеських маркерів виробляють за результатами спільного аналі-за їх сегрегації в інформативних родинах.

Значні успіхи в геномної картуванні були связа-ни з використанням як генетичних маркерів широко поширеною в багатьох популяціях мінливості по ізо-ферментної спектру різних білків. Виявилося, що багато ферментів у різних індивідів, у різних тканинах та на різних стадіях онтогенезу можуть знаходитися в різних ізоформах.

Такі варіанти одного і того ж білка звичайно не відрізняються за специфічної активності, але мають змінену електрофени-ретіческую рухливість. Популяційний аналіз ізоферментів виявив існування поліморфізму для дуже багатьох белко-вих систем, контрольованих різними генами, локалізованими в багатьох хромосомах. Таким чином, для цих хромосом були знайдені генетичні маркери, за допомогою яких були ідентифікувати відповідні групи зчеплення.

Удосконалення молекулярних методів аналізу специфічні-чеських послідовностей ДНК привело до виявлення велико-го числа високоізменчівих ділянок геному - поліморфних сай-тов рестрикції, Гіперваріативна міні-та мікросателітної послідовностей (см.Главу II) Ця мінливість також би-ла використана для маркування ділянок хромосом з метою встановлення більш точного взаиморасположения локусів. Нікополі-ре після виявлення поліморфних сайтів рестрикції були опубліковані теоретичні розрахунки, згідно з яким від 10 до 20 таких локусів, розташованих рівномірно на кожній хро-мосоме на відстані близько 20 см один від одного, достатньо для визначення хромосомної приналежності генів, від-відповідальних за будь-який тип спадкової мінливості

(Botstein et al, 1980). За цими оцінками близько 200 таких ін-дексних маркерів дозволять побудувати карти зчеплення для всіх відомих генів на підставі аналізу сегрегації відповідними-чих ознак в сім'ях з більшою кількістю мутантів. Для визна-поділу порядку розташування генів на хромосомах і оцінки генетичних відстаней між ними досить близько 400 рав-номерний розподілених поліморфних маркерів.

Ідентифікація в геномі людини великого числа полі-морфних сайтів рестрикції та розробка простих методів ана-лізу індивідуальної мінливості за цими локусами істотно підвищили можливості локалізації невідомих ознак на геномних картах. Вже до 1989р. були картіровани більше 2000 клонованих послідовностей ДНК, що виявляють полі-морфізм по довжині рестрикційних фрагментів (ПДРФ) у відмінності-них популяціях (Kidd et al., 1989). Понад 1000 з них типи-рова в CEPH-колекціях родоводів. Значною мірою це анонімні послідовності, зв'язок яких з специфічні-ними генами не встановлена. Їх найменування найчастіше відповідають назвою відібраного з бібліотеки генів КЛО-ну. Надалі була розроблена стандартна генетична номенклатура для позначення використовуються як марке-рів сегментів ДНК з невідомою функцією. Перша буква D, що значить ДНК, потім номер хромосоми, далі S для унікальний-них і Z для повторюваних послідовностей і врешті-но-мер, що ідентифікує даний зонд в певному районі ДНК.

Застосування поліморфних сайтів рестрикції в як ге-нетіческіх маркерів має два обмеження: порівняно низ-кая інформативність (частота гетерозигот не може перевищує

50% - див Глави II, Y) і нерівномірний розподіл

ПДРФ-сайтів з хромосомами. Цих недоліків практично ли-шени Гіперваріативна STR-сайти (ді-, три-і тетрануклеа-тідние повтори). Використання мікро-і мінісателлітних послідовностей ДНК як індексних генетичних марке-рів відкрило нову еру в побудові карт зчеплення геному людино. В даний час робота з ідентифікації високопо-ліморфних маркерів, що перекривають весь геном і рівномірно розподілених по хромосомам практично завершенаа

(Weissenbach et al., 1992; Reed et al., 1994). Ця система побудована на базі дінуклеотідних (CA) n повторів.

(CA) n * (GT) n являють собою найбільш частий клас простих повторів, виявлених в геномі людини (за исклю-ченіем An * Tn мультімеров) . Такі повтори присутні при-мірно в 1% колоній з геномних бібліотек, сконструйованих на базі фрагментів довжиною 300 - 500 п.о., які утворюються після перетравлення геномної ДНК ендонуклеази Alu1. Більше

90% з них виявляються поліморфними за кількістю копій в класти-ре, причому в 70% локусів присутні більше трьох алелей. В

1992р. групі французьких учених під керівництвом Жана

Вайссенбаха вдалося розробити систему ідентифікації з по-міццю ПЛР індивідуальної мінливості в місцях локалізації

(CA) n повторів і на цій основі створити геномної карту з

814 високополіморфних індексних маркерів із середнім відстані-ням між ними близько 5 см, що одержала назву

Genethon-колекції мікросателітної маркерів (Weissenbach et al., 1992). Для цього були просеквеніровани більше 12 000 фрагментів ДНК, виділених з геномної Alu1-бібліотеки шляхом її скринінгу poly (dC-dA) * poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймери для ампліфікації підбирали з послідовностей ДНК, навколишнього повтори, використовуючи для цього комп'ютерні програми.

Для подальшого аналізу було відібрано близько 3 000

(CA) n-сайтів та проведена специфічна ампліфікація цих ділянок у чотирьох неспоріднених CEPH-індивідуумів. На сле-ступному етапі була визначена хромосомна приналежність по-лутара тисяч найбільш інформативних маркерів шляхом їх Іден-тіфікаціі в панелі з 18 соматичних гібридних клонів, що містять різні набори хромосом людини. Детальна мапа зчеплення індексних маркерів побудована за результатами їх ге-нотіпірованія в колекції 8 найбільших CEPH-родоводів.

Запропонована система маркерів перекриває всі хромосоми, а сумарна відстань між ними відповідає приблизно 90% усього генома людини.

До 1994р. число індексних STR-маркерів було збільшено до

2 066, а середній інтервал між сусідніми локусами зменшений до 2,9 см (Gyapay et al., 1994). Останнім часом перспектив-ви широкомасштабного картування всього генома людини ста-ли ще більш значні. Групою англійських авторів під ру-Ководство Дж.Тодда була розроблена система автоматичного скрінірованія 254 дінуклеотідних маркерів, що перекривають весь геном людини з середньою відстанню між сусідніми маркерами близько 13 см. 80% цих повторів було відібрано з

Genethon-колекції маркерів, решта - з інших Істочна-ков (Genome Data Base, Baltimore). Ампліфікація всіх 254 по-ліморфних сайтів проводили в 39 мультиплексний ПЦР (МПЦР), причому використовуються для цих цілей олігопраймери були мечени чотирма типами флюорохромами, так що аллели навіть однаково-го молекулярної ваги можна було розрізнити на електрофорег-Рамі за кольором. У кожній з 39 МПЦР скрініровалі 7 - 9

STR-сайтів якоїсь певної хромосоми. Такі МПЦР-набоя-ри були розроблені для всіх 22 аутосом і для Х-хромосоми.

Реєстрація алелей всіх STR проводилася автоматичним сканерів з використанням комп'ютерної програми Genotyper.

Т?? тілько за допомогою одного автоматичного сканера вдається проаналізувати за цією схемою більше 2.5 тисяч генотипів в день! (Reed et al., 1994). Така система вже сьогодні відкривають-і самі широкі можливості не тільки для генетичного картування і створення докладних карт зчеплення практично будь-яких моногенних захворювань, але, що особливо важливо, вона робить реальною розробку стратегії картування генів, мутації яких привертають до мультифакторіальної забо-Леваном, таким як діабет, гіпертонія, інфаркт міокарда, психози та багато іншого.

розділ 3.4 Хромосом-специфічні бібліотеки генів, пульсуючий гель-електрофорез.

Використовуючи настільки простору систему молекулярних маркерів і проводячи аналіз зчеплення на колекціях клітинних культур або на матеріалі інформативних родоводів можна досить швидко прив'язати будь-який ознака, особливо моногенних, не тільки до певної хромосомі, але навіть до одного бенду, оп-рідшали найближчі фланкуючі маркери і перейти не-посередньо до позиційному клонування з метою виділення та ідентифікації самого гена. У зв'язку з цим важливе значення в картуванні генів належить молекулярно-цитогенетичним підходам, що є принципово важливою ланкою для успішний-ного поєднання карт зчеплення і фізичних карт цілих хро-мосом і їх фрагментів.

Точність цитогенетичного картування визначається ступенем спіралізаціі хромосом , характером використаної мітки і роздільною здатністю мікроскопічного устатку-вання. При картуванні на стандартних метафазних хромосомах і використанні радіоактивно мічених зондів точність карти-вання обмежується одним великим бендом або навіть сегм-те хромосоми і становить близько 5-10 мільйонів п.о. При використанні біотіновой мітки на прометафазних хромосомах точність картування зростає в середньому в 5-10 разів (до 1 мільйона п.о.), а при роботі із спеціально виготовленими і розтягнутими інтерфазних хромосомами може доходити до 50 тисяч п.о. (Boehringer Mannheim Mannual , 1992). Тим не менш, навіть за такої роздільної здатності цитогенетичне кар-тирование дає лише дуже орієнтовні результати і Оби-чно розглядається як 1-й етап фізичного картування.

Значно більш точні результати досягаються на 2-му етапі - етапі фізичного (рестрикційних) картування.

Середня відстань між стандартними сайтами впізнавання на рестрикційних картах коливається в межах від 10 до 20 кб.

З-за розбіжностей майже на два порядки масштабів цітогенеті-чеського і молекулярного картування пряме зіставлення цих типів фізичних карт практично неможливо.

Одним із способів подолання цих труднощів є конструювання хромосом-специфічних бібліотек генів. Як уже згадувалося (см.Глава I, 1.5) для приготування таких бібліотек використовують набори клітинних ліній соматичних ги-брід з окремими хромосомами людини або хромосоми, ме-ханіческі відібрані шляхом проточною цитометрії. Для некот-яких видів молекулярного клонування зручніше