Нові методи іммунодіагностікі та критерії їх оцінки

Зміст:

Введення

Ідеологія лабораторного аналізу в медицині заснована на розуміннібудь-якого захворювання як реакції цілого організму. Патологічна змінафункції будь-якого органа, тканини, групи клітин викликає відхилення віднормальних показників у роботі інших органів, тканин, систем. Поряд знеспецифічним, тобто властивим для багатьох видів патології проявомтаких зрушень, в більшості випадків спостерігаються особливі, характерні лишедля даного захворювання зміни внутрішнього середовища організму. Приінфекційних захворюваннях - це, перш за все, поява у внутрішнійсередовищі організму збудника або його продуктів (токсини, антигени і т.д.) іімунна відповідь на збудник.

У зв'язку з цим іммунодіагностіка інфекційних захворювань може бутирозділена на дві частини. По-перше, це визначення зміни функціональноїактивності різних компонентів імунної системи, характерних дляздорового організму: зміна кількості лімфоцитів різних популяцій,їх співвідношення, активності клітин системи мононуклеарних фагоцитів,концентрації імуноглобулінів і т.п. По-друге, це специфічнерозпізнавання маркерів збудника і реагують з ним комплементарнихструктур (перш за все антитіл) на основі їх взаємодії з мікробнимиантигенами.

У більш широкому сенсі специфічне розпізнавання можливо не тількиз допомогою антитіл, але також і інших комплементарних структур, що реагуютьз мікробними продуктами - різними рецепторами клітинної поверхні,лектинами, ділянками молекул нуклеїнових кислот і т. п. В тій чи іншій міріці підходи знайшли технологічне здійснення в різні способи. Однаклише методи аналізу на основі реакції з ділянками нуклеїнових кислот знайшлидосить широке застосування в клінічній практиці (генное зондування)і будуть описані більш докладно. Оцінка стану імунної системи приінфекційному процесі може включати в себе наступні методи: визначеннякількості і співвідношень Т-і В-клітин, субпопуляцій лімфоцитів упериферичної крові, активності лімфоцитів в реакції бласттрансформаціі,визначення активності макрофагального ланки (хемотаксис, рухливість,фагоцитоз), визначення концентрації імуноглобулінів М, G, А і Е,співвідношення концентрацій ізотипи IgG, визначення концентрації лімфокінів,монокини, інтерферонів, стану місцевого імунітету (лізоцим,секреторний IgА) і загальних неспецифічних гуморальних чинників (система,комплементу, пропердін, трансферрина, церулоплазмін), концентраціїтимічного гормонів і др.Находят застосування і методи комплексної оцінкиреактогенності імунної системи по, так званим, реакцій негайноготипу та реакції гіперчутливості уповільненого типу (шкірні проби прибактеріальних інфекціях і мікозах, туберкулінова проба). Вельмиперепектівна оцінка субпопуляційного складу лімфоцитів за специфічнимиповерхневим маркерами, особливо при використанні імунофлуоресцентногометодів автоматичного сортування клітин. Всі перераховані вище методидозволяють оцінити динаміку змін станів імунної системи приінфекційному процесі, а при провокаційних тестах - виявити специфічнуреактивність імунної відповіді. Застосування такого роду діагностичнихпроцедур демонструє індивідуальну реакцію імунної системи пацієнта напротягом інфекційного процесу, дозволяє оцінити ефективність застосовуванихметодів лікування і прогнозувати результат захворювання. Проте лише в деякихвипадках ці методи дозволяють визначити вид інфекційного агента. Змінаспіввідношення популяцій і субпопуляцій лімфоцитів відбувається при різнихвидах інфекційних захворювань, особливо при хронічному перебігу інфекції.
Так само часто змінюється концентрація неспецифічних гуморальнихкомпонентів імунної системи. Відомо, що при деяких паразитарнихзахворюваннях різко підвищений рівень IgЕ в крові. При гострих запальнихпроцесах, що викликаються бактеріями, зростає концентрація С-реактивного білка вкрові, тоді як при схожих клінічних формах вірусної інфекції такізміни не спостерігаються. Провокаційні методи можуть виявитисенсибілізацію до якого-небудь інфекційного агента, однак це може бутирезультатом зміни загальної реактивності організму. Імунодефіцитнийстан, викликаний інфекцією, тобто синдром вторинного імунодефіциту,є широко поширеним явищем. З іншого боку, при інфекції,викликається ретровірусами ВІЛ-1, ВІЛ-2, НTLV-1, НТLV-2 спостерігаютьсярізноманітні структурні зміни імунної системи, що супроводжуютьсямножинними асоційованими інфекційними захворюваннями протозойні,бактеріальної та вірусної природи.

Найбільш значущими для специфічної діагностики інфекційногопроцесу стали методи імунохімічної аналізу (immunoassay) длявизначення антигенів і антитіл.

Умовно методи імунохімічної аналізу можна розділити на чотиривеликі групи.

До 1-ї групи належать прямі (безпосередні) методи визначенняреакції антиген-антитіло. Що утворюється при цьому комплекс антиген-антитілоідентифікується візуально, або за допомогою простих оптичних пристроїв. Дотаких методів відносяться преципітації в розчині (у тому числі - реакціїтурбодиметрія і нефелометрія), в гелі, на полімерній плівці,аглютинація бактеріальних клітин, найпростіших, пряма реакція аглютинаціїеритроцитів антитілами, вірусами.

До 2-ої групи відносяться реакції пасивної аглютинації, тобтоаглютинації часток, з поверхнею яких пов'язані антигени або антитіла.
Такі препарати і отримали назву діагностикумів. До цих методів відносятьсяреакції пасивної гемаглютинації (РНГА) та непрямої геммагглютінаціі
(РНГА), латексагглютінаціі, коагглютінаціі, аглютинації часток бентоніту,желатинових капсул, часток сефарози та ін

К З-ї групи відносяться індикаторні методи, засновані навикористання різного роду міток для виявлення реакції антиген-антитіло.
Найбільш поширені імуноферментний, імунофлюоресцентний,радіоімунологічний аналіз.

У 4-у групу можна виділити одне з, що бурхливо розвиваються напрямківлабораторного аналізу - іммуносенсори.

Всі перераховані методи застосовуються не тільки при діагностиціінфекційних та неінфекційних захворювань людини, а й у ветеринарії,рослинництві, для контролю забруднення навколишнього середовища і т. п.

Імуноферментна АНАЛІЗ

Основною відмінною рисою імуноферментного аналізу (ІФА) єте, що; як індикаторної молекули, що дозволяє слідкувати заімунним комплексом, використовується молекула ферменту. У зв'язку з тим щофермент має унікальну властивість модифіковані не одну, як у звичайниххімічних реакціях, а велика кількість молекул субстрату, тобто маєсвого роду підсилює властивістю, чутливість імуноферментнихметодик може бути дуже висока. У деяких випадках, як показуютьчисленні порівняльні дослідження, вона вища чутливостіімунофлуоресцентного і радіоімунологічний методів.

Історія створення імуноферментних методик починається з моменту, колибіохіміки почали ковалентно іммобілізовивать ( «пришивати») молекулиферментів до молекул білків і, зокрема, до молекул імуноглобулінів.
Але знадобилося п'ять років для створення методики імуноферментногоаналізу саме в тому вигляді, в якому ми використовуємо його в даний час.
Принципи цього методу наступні:

- комплекс антиген - антитіло можна виявити, якщо ввести до складуодного з учасників імунної реакції (ковалентно «пришити») одну абокілька молекул ферменту. Причому ця процедура на проміжних (впроцесі «прішівкі») і фінальній стадії (кон'югат антигену або антитіла зферментом) не повинна змінювати імунні (властивості фермент-міченогоучасника імунної реакції;зручно виявляти імунний комплекс, використовуючи здатність ферментурозщеплювати субстрат, який при ферментативної модифікації змінює свійколір. У цьому випадку для виявлення комплексу антиген - антитіло зазвичайвикористовують спектрофотометрії;

- ммунний комплекс можна виявляти за допомогою імуноферментного аналізуяк у розчині, так і при адсорбції (або ковалентного іммобілізації) натвердому носії. Розрізняють два принципово різних типу ІФА --гомогенний і гетерогенний (твердофазних) імуноферментний аналіз.

Гомогенний імуноферментний аналіз (Гіфа) - найбільш простий уметодичному відношенні вид ІФА. При його постановці один з учасниківімунної реакції (звичайно це низькомолекулярний антиген) метітся ферментомта за ходом формування комплексу антиген-антитіло стежать, реєструючизміна активності ферменту.
Таке порушення ферментативної активності може виникати або за рахунокпросторового роз'єднання ферменту і субстрату, або за рахунокконформаційних змін в молекулі ферменту, що супроводжують формуванняімунного комплексу. Гіфа має ряд істотних переваг перед іншимиімунохімічний методами. По-перше, висока експресія (весь аналіз здопомогою Гіфа, займає хвилини і навіть частки хвилин).

Рис. Варіанти гомогенного імуноферментного аналізу (А-ефект роз'єднанняферменту (Ф) та субстрату (С) за рахунок стеріческіх перешкод привзаємодії антигену (Аг) і антитіла (Ат); Б-ефект зміниконформації ферменту при формуванні комплексу антиген-антитіло.

По-друге, метод має одну стадію і не вимагає трудомістких іщо вимагають часу етапів промивки. І нарешті, по-третє, метод вимагаємінімальних обсягів (8-50 мкл) і кількостей біологічного або клінічногозразка. Однак у методу Гіфа є один дуже суттєвий недолік --на його основі можна створювати діагностичні тест-системи тільки длянизькомолекулярних антигенів. Тільки, в цьому випадку антитіло, взаємодіючиз антигеном, може ефективно екранувати або модифіковані пов'язану зцим антигеном молекулу ферменту. Саме у зв'язку з цим, (незважаючи напростоту і очевидні переваги перед іншими методами, наоснові Гіфа були створені діагностикуми для виявлення тільки гормонів,пептидів, лікарських і наркотичних речовин і деякихнизькомолекулярних білків.

Гетерогенний (твердофазних) імуноферментний аналіз (ТФІФА або ЕLISА)в останні роки особливо широко використовується в біології та медицині. Як ідля інших твердофазних методів аналізу, характерною особливістю ТФІФАє те, що в процесі проведення аналізу один з учасників реакціїантиген - антитіло мобілізують на твердому носії. Цю фіксаціюантигену або антитіл можна здійснювати або шляхом їх ковалентного
«Прішівкі» до полімерної або скляній матриці, або шляхом їх фізичноїадсорбції на твердому носії за рахунок досить міцних силелектростатичного і ван дер Ваальсових взаємодії. Ідеяіммобілізації імунного комплексу важлива для аналізу багатокомпонентнихсумішей макромолекул, коли в системі повинні залишатися тільки ті компонентисуміші, які володіють потрібними імунохімічний властивостями. Саметвердофазним методики дозволяють позбутися від баластних, що не увійшли доімунний комплекс антигенів простий промиванням.

Необхідно відзначити, що у своїй фізико-хімічну основу твердофазних
ІФА дуже схожий з твердофазним РІА. Відмінність стосується лише індикаторнихмолекул - у ТФІФА це фермент, в твердофазним РІА це радіоактивніізотопи. Решта ж принципи аналізу повністю збігаються - в обохметодах використовується тверда матриця, на якій адсорбується імуннийкомплекс, і ідентичний спосіб видалення з системи не увійшли в комплекскомпонентів діагностикумів.

В даний час вже опубліковані огляди, детально аналізуютьсхеми проведення діагностичних досліджень з використанням методутвердофазного ІФА.

Для виявлення в біологічних і клінічних зразках бактеріальних івірусних антигенів особливо часто застосовується так званий сендвіч-методабо модифікований сендвіч-метод. При використанні цих методик натверду підкладку (зазвичай полістирол) сорбуються послідовно первинніантитіла, які виявляються антиген і вторинні антитіла. У разі подвійногосендвіч-методу ферментна мітка вводиться до складу вторинних антитіл, ввипадку модифікованого подвійного сендвіч-методу вторинні антитіла
(немечение) «проявляються» антивидових міченими ферментомімуноглобулінами. Особлива популярність останньої різновиди ТФІФАпояснюється тим, що для виконання методики немає необхідностісинтезувати специфічні для кожного конкретного антигену кон'югати
(мічені ферментом антитіла).

В останні роки були розроблені методики ТФІФА, що використовують уяк «виявляють» кон'югатів молекулярні комплекси ферментів з білком
А золотистого стафілокока. Як відомо, це білок взаємодіє звисокою константою зв'язування з важкої ланцюгом (Fс-фрагментами)імуноглобулінів. Це дозволяє побудувати діагностичні системи, де - вяк «проявляє» агента використовуються не антивидових антитіла, абілок А. У цьому випадку, однак, виникають деякі труднощі, пов'язані знеспецифічної білка А, який взаємодіє з Fс-фрагментами будь-якихантитіл. Якщо використовувати звичайну сендвіч-методику, замінивши лишеантивидових кон'югат на кон'югат на основі білка А, останній будевзаємодіяти не тільки з вторинними антитілами, але і з первиннимиімуноглобулінами, даючи позитивну реакцію, навіть якщо проба не міститьшуканого антигену. У цьому випадку є декілька варіантів рішенняпроблеми. По-перше, в якості первинних антитіл в методиці можнавикористовувати імуноглобуліни, з якими білок А слабо взаємодіє
(наприклад, з мишачими імуноглобулінами). По-друге, можлива прямаадсорбція антигену на полістирол, коли первинні антитіла просто невикористовуються. І, нарешті, в якості первинних антитіл можна застосовувати неповні молекули імуноглобулінів, а молекули, позбавлені Fс-фрагментів, - такзвані Раb2-фрагменти. У цьому останньому випадку додатковимзручністю методики буде те, що для конструюваннядіагностичної системи можна буде використовувати не дві сироватки,отримані від різних тварин, а одну. Саме у зв'язку з цимиобставинами в даний час розроблено і розробляється великачисло діагностичних методик, що використовують кон'югати на основі білка А.

Побудова діагностикумів для серодіагностики бактеріальних і віруснихзахворювань, виявлення та ідентифікація з їх допомогою антитіл вбіологічних і клінічних зразках проводиться аналогічним чином.
Зазвичай готується так званий іммуносорбент - антиген,іммобілізованих на твердому носії (або за рахунок його прямий сорбції натверду матрицю, або за рахунок ковалентного «прішівкі» до цієї матриці, абоза рахунок іммуносорбціі на імобілізовані первинні антитіла). Потімдосліджувана сироватка, що містить або не містить виявляються антитіла,контактує з іммуносорбентом. Ступінь адсорбції специфічних доіммобілізованим антигену імуноглобулінів звичайно визначається за допомогоюантивидових кон'югатів. Використання антивидових антитіл до різнихкласів імуноглобулінів дозволяє виявити в досліджуваному зразку не тількиспецифічні до використаного антигену антитіла, але і провести їхізотіповой аналіз.

Конкретні методики діагностики та серодіагностики захворюваньбактеріальної та вірусної природи, що використовують імуноферментні підходи,відрізняються багатьма параметрами, зокрема, типом і формою адсорбенту, наякому мобілізують імунний комплекс. Як твердофазного носіяможе використовуватися цілий ряд полімерів: поліметилметакрилат., і нейлон,тефлон, поліпропілен і ін Однак найбільш часто як адсорбенту вданий час застосовується полістирол і полівінілхлорид. Для зручностіпроведення аналізу ці адсорбенти виробляються у вигляді многолуночних плашок,кульок або паличок. Використання плашок, виготовлених з оптичнопрозорого полістиролу або полівінілхлорида дозволяє проводити всіоперації ТФІФА, включаючи кінцеве фотометрірованіе хромофорной субстратноїсуміші. Не менш суттєвою перевагою полістиролових плашок передіншими формами адсорбенту є можливість автоматизації практичновсіх операцій аналізу, включаючи трудомісткі етапи промивки лунок та внесення доних однотипних реагентів.

Слід зазначити, що використання полістиролових плашок для цілей
ТФІФА має і деякі недоліки - високі вимоги до чистотиполімерного матеріалу і точності виготовлення плашок і нерентабельність їхвикористання для поодиноких аналізів.

Велика увага при постановці ТФІФА звичайно приділяється правильномувибору фермент-субстратної системи. У сучасних діагностичнихімуноферментних тест-системах використовується велика кількість різноманітнихферментів та субстратів. Вибір тієї чи іншої фермент-субстратної пари длявикористання в конкретної тест-системи на основі ТФІФА диктуєтьсядекількома міркуваннями. По-перше, звертається увага на стабільність упроцесі аналізу та зберігання як вкрай чутливого до структурнихвнутрішньомолекулярних перебудовам кон'югату, так і в багатьох випадкахсвітлочутливого хромофорного або флуорохромного субстрату. По-друге,це відсутність використовуваного в діагностикуми ферменту або субстрату
(вільного або пов'язаного) в біологічних або клінічних зразках,які належить аналізувати. По-третє, наявність відповідноїреєструючої апаратури (спектрофотометра або спектрофлуоріметра). І,нарешті, по-четверте, вибір тієї чи іншої фермент-субстратної пари диктуєтьсяприродним бажанням експериментатора або клініциста мати на рукахсистему, що володіє максимальною специфічністю і чутливістю.

Таблиця: Фермент-субстратні системи, найбільш часто використовувані в твердофазним ІФА
| Фермент | Субстрат | Спосіб | Довжина хвилі | чутливе |
| | | | Спостереження | сть |
| | | | (Н/м) | нг/зразок |
| Лужна | Паранітрофенілфос | Фотометрія | 400,405 | 0,5-20 |
| фосфатаз | фат | Флуорометр | 450 (360) | 10-4-10-2 |
| а | 4-метілумбелліфер | ия | - | 10-2 |
| | Іл-фосфат | Радіометр | | |
| | Н-аденозінмонофос | я | | |
| | Фат | | | |
| Пероксид | аміносаліцилова | Фотометрія | 450,474,520 | 100 |
| аза | кислота | | 630 | - |
| | Ортотолуідін (ОТ) |-//- | 450,492 | 2,5 |
| | 0ртофенілендіамін |-//- | 400 | 20 |
| | (ОФД) |-//- | 405 (320) | 5 * 105 |
| | Ортодіанізідін | Флуорометр | | |
| | (ОД) | ия | | |
| | Парагідроксіфеніл | | | |
| | Пропив - | | | |
| | Нова кислота | | | |
| (| Ортонітрофеніл-(- | Фотометрія | 410,420 | 0,01-10 |
|-галакто | D-галактозид | | | |
| зідаза | 4-метілумбелліфер | | 450 (360) | 10-6-10-2 |
| | Ил-(-D-галактозид | Флуорометр | | |
| | | Ия | 450 (360) | 2 * 10-2 |
| | Флуоресцеїну-ді | | | |
| | ((-Галактозид) | Флуорометр | | |
| | | Ія | | |

* Для фотометричних вимірювань зазначені тільки найбільш часто використовуванідовжини хвиль спостереження; для флюорометріческіх вимірювань - довжини хвильфлуоресценції та збудження (у дужках).

Специфічність діагностичної системи не залежить від вибору фермент -субстратної пари і визначається в основному чистотою і гомогеннихвикористовуваних при конструюванні діагностикуми препаратів антигенів іантитіл. Використання в ТФІФА НЕ гетерогенних антиген-містятьпрепаратів і навіть не очищених бактерій і вірусів, а індивідуальнихбактеріальних і вірусних білків - ось єдиний, хоча і трудомісткий шляхпідвищення специфічності діагностичних систем. Те саме можна сказати і пропрепарати, які використовуються в ТФІФА імуноглобулінів, - бажановикористовувати не цільні сироватки і навіть не сумарні гаммаглобуліновиефракції цих сироваток, а аффінноочіщенние або моноклональні антитіла.

Особливою популярністю в даний час у нас в країні користуютьсяімуноферментні кон'югати на основі пероксидази хрону. Це, ймовірно,сіязано з доступністю сировини для виділення цього ферменту, щодолегкістю очищення, досить високою стабільністю, і великою кількістюхромофорних і флуорохромних субстратів .. Проте слід підкреслити,що два інших досить часто використовуються в ТФІФА ферменту - лужнафосфатаза та (-галактозидаза - у деяких випадках мають цілий рядпереваг перед пероксидазою. Це, по-перше, висока стабільність,розчинність і нетоксичність субстратів, а, по-друге, можливістьвикористання відносно недорогих флуорохромних субстратів, застосуванняяких різко підвищує чутливість аналізу.
Певне значення для реалізації максимальної чутливості ТФІФАмає правильний вибір субстрату. Поряд з природним бажаннямвикористовувати субстрати з високою питомою активністю хромофорной (високийкоефіцієнт молярній екстинкції пофарбованого кінцевого продукту) необхіднобрати до уваги такі важливі фактори, як рвстворімость субстрату тапродуктів його ферментативної модифікації в умовах проведення аналізу тастабільність цих субстратів при зберіганні та в процесі експерименту.
Чутливість діагностичних систем на основі ТФІФА лише частковозалежить від типу обраної при конструюванні діагностикуми фермент -субстратної пари. В основному ця чутливість визначається іншимичинниками, які важко врахувати: способом синтезу кон'югату, гомогенністьі питомою активністю які використовуються для такого синтезу антитіл і антигенів,а також численними па.раметрамі проведення аналізу (способоміммобілізації виявляється антигену або антитіл, ступенем їх солюбілізаціі вбіологічному або клінічному зразку і т. д.). Саме у зв'язку з цим улітературі наводиться такий широкий діапазон меж чутливості длявже розроблених методик ТФІФА. На підставі аналізу цих даних важкорекомендувати при конструюванні новостворюваних твердофазнихімуноферментних систем найкращий фермент і наулучшій субстрат. Слідлише відзначити, що за допомогою використаних раніше фермент-субстратні парТФІФА метод дозволяє виявити в досліджуваному зразку нанограммовиекількості антигену при використанні хромофорних субстратів іпікограммовие кількості антигену при застосуванні флюорохромних субстратів.
Якщо при конструюванні нової системи на основі ТФІФА неможливо абонебажано використання комерційних універсальних кон'югатів
(антивидових фермент-мічених антитіл), то постає питання про синтезкон'югату на основі вибраних ферменту і антитіл. Як вже вказувалося,найбільш специфічні і високоактивні кон'югати можуть бути отримані наоснові тільки максимально очищених білкових інгредієнтів. Однак у зв'язку звідносною складністю і трудомісткістю робіт з ретельного очищеннябактеріальних і вірусних антигенів в даний час при розробціімуноферментних систем часто використовуються або цільні сироватки, абосумарні фракції імуноглобулінів, що містять у своєму складі якспецифічні, так і баластні антитіла. Антигени також часто непіддаються належної очищенню і що використовується при конструюваннідіагностикуми білок становить лише невеликий відсоток від сумарного білка.
У зв'язку з цим різко зростає ймовірність неспецифічних реакцій,особливо небезпечних при високій чутливості, яку мають ІФ -методики.
Велике значення для успішного використання ТФІФА в мікробіологічних івірусологічних дослідженнях має правильна інтерпретація отриманихрезультатів. Це особливо важливо при використанні клінічного матеріалу,коли поняття «контроль» і «досвід» часто визначаються з великою часткоюсуб'єктивізму. Для тестування позитивних проб спочатку ставлять 6-8тестів на зразках, взятих від явно здорових людей і визначають середнюоптичну щільність контролю і стандартне відхилення при природномурозкид даних за рахунок різних методичних похибок. Проба зазвичайвважається позитивною, якщо відхилення її оптичної щільності відконтролю в 3 рази перевищує стандартне.

Іммуносенсори
Вперше принцип іммуносенсоров був використаний М. Аizawа і співавт. (1977),коли вони сконструювали мембрану, здатну на імунологічний відповідь. Уданий час опубліковано кілька повідомлень про використанняаналогічного підходу для визначення різних мікробних антигенів абоантитіл до них [Horbach Е. еt аl, 1989, Parry R. еt аl., 1990].
Принцип методів, заснованих на іммуносенсорной технології, полягає взміні фізико-хімічних властивостей мембрани або іншого носія,пов'язаного з антитілами або антигенами. Зменшення мембранного потенціалу,зміна оптичних або хімічних властивостей середовища, що прилягає до носія,виявляються за допомогою спеціального електрода або оптичного пристрою івиражаються у вигляді електричного сигналу.
Існує два основних типи іммуносенсоров, що розрізняються за особливостямивизначення реакції антиген - антитіло. 1 тип - так званий немеченийіммуносенсор. Такий пристрій складається з металевого електрода дляпотенціометрії, покритого напівпроникною полімерною мембраною зіммобілізованими на ній молекулами антитіл (або антигену). У результатіреакції з шуканим комплементарним речовиною утворюються імунні комплексина поверхні мембрани. Це призводить до зміни заряду мембрани та їїповерхневого потенціалу. Зміна різниці потенціалів і визначаєтьсяелектродом.2 тип - мічений іммуносенсор. У цьому випадку на мембрані такожмобілізують антитіла або антиген, але реакція визначається по змініпровідності (амперметри). Для цього використовують кисневий електрод,реагує на зміну концентрації О2 після реакції антитіл з антигеном,міченим ферментом (наприклад, каталази). Конкуренція шуканого антигену звідомою кількістю міченого кон'югату дає зміна провідностірозчину в області мембрани, що реалізується у вигляді електричного сигналуна виході електрода. В іншій модифікації результат кольоровий ферментативноїреакції може бути визначений і за допомогою оптичного пристрою.
Для оцінки результатів реакції у двох описаних типах іммуносенсоровзначно рідше використовують п'єзоелектричний ефект, вимірюваннятемпературних коливань і деякі інші способи, менш розроблені впорівняно з електрохімічними і оптичними.
Особливістю іммуносенсоров, що відрізняє їх від інших системімунохімічної діагностики, є те, що інформація про виникненняімунного комплексу безпосередньо реалізується у вигляді фізичного сигналу
- Зміни різниці потенціалів, оптичної щільності, сили струму і т. п.
Одним з перших застосувань іммуносенсоров було вимірювання кількості антитілпри сифілісі. Для цього на напівпроникною мембрані електрода пов'язувалиантигени трепонеми і інкубувати його в розчині сироватки крові. Змінирізниці потенціалів спостерігали аж до розведення позитивноїконтрольної сироватки 1:800, причому, збільшення сигналу відповідалопідвищення концентрації антитіл. Важливо те, що після відмивання іммуносенсорможна використовувати знову. Аналогічний підхід був застосований для визначенняантитіл іншої специфічності (до групових антигенів крові) і альбуміну.
Більш складну будову іммуносенсора збільшує чутливість аналізу.
Так при використанні міченого іммуносенсора досягається чутливістьдо 0,1 нг білка/мл. Є дані про визначення таким методом HBs -антигену за допомогою I-електрода і антитіл до HBs-антигену, міченихпероксидазою [Аizawа М., 1987]. Пристрій, що включає скляну матрицю,активовану різними вірусними антигенами (біочипів) було використанодля серологічної діагностики вірусних захворювань [Ноrbach Е. еt аl.,
1989]. Вжито спроби визначати за допомогою іммуносенсоров продуктисинтезу деяких грибів (охратоксін А), клітини С. Albicans.

Хоча в даний час відсутні комерційні зразки іммуносенсоровдля діагностики інфекційних захворювань, слід звернути увагу наосновні етапи використання подібних пристроїв.
Досвід використання аналогічних систем для визначення глюкози в крові,гормонів, низькомолекулярних речовин дозволяє розділити процес аналізу натри етапи:

1 - підготовка зразка для аналізу

Деякі типи іммуносенсоров здатні взаємодіятибезпосередньо з біологічним матеріалом. Однак найчастіше використовуєтьсяпопередньо відокремлена центрифугуванням плазма або сироватка крові,розлучена спеціальним розчином.

2 - проведення аналітичної процедури

Поміщаючи краплю розчину на мікроелектродами, або опускаючи електрод удосліджуваний зразок, створюється контакт реагентів. Час досягненнярівноваги від декількох секунд (для низькомолекулярних речовин) додекількох хвилин (для високомолекулярних агентів, антигенів, клітин).
Результат визначається по різниці в показаннях з референс-електродом або позміни сигналу після реакції. Результат може бути виражений усистематичних одиницях (міллівольт, міліампер), або за допомогоюмікропроцесора трансформований в одиниці концентрації шуканого агента, уЗгідно з попередніми калібруванням.

3 - регенерація іммуносенсора

Для повторного або багаторазового використання іммуносенсоранеобхідно звільнити його робочу поверхню від речовин, активно абопасивно сорбованих в ході аналізу. Найбільш простий спосіб регенераціїполягає в інтенсивному послідовному промиванні іммуносенсора розчином зкислим значенням рН і буферним розчином з високою іонною силою. Длядеяких типів іммуносенсоров до цих пір не знайдено оптимальних умоврегенерації, не знижують їх чутливість. У цих випадках використовуютьзмінні одноразові мембранні елементи.
Найближчим часом будуть створені надійні портативні іммуносенсори длядіагностики найбільш поширених інфекційних захворювань, як цезроблено вже для аналізаторів глюкози.

МЕТОДИ генного Зондування
Інтенсивний розвиток молекулярної біології і створення досконалоїметодичної бази генетичних досліджень стали основою генетичноїінженерії. В області діагностики виникло і бурхливо розвивається напрямокза визначенням специфічних нуклеотидних послідовностей ДНК і РНК,так зване генное зондування. В основі подібних методик лежитьздатність нуклеїнових кислот до гібридизації - утворення двухцепочнихструктур за рахунок взаємодії комплементарних нуклеотидів (А-Т, Г-Ц).
Для визначення шуканої послідовності ДНК (чи РНК) спеціальностворюється, так званий, зонд полінуклеотід з певноюпослідовністю підстав. До його складу вводять спеціальну позначку,що дозволяє ідентифікувати освіта комплексу. Схема реакціїпредставлена на малюнку.

Рис. Схема реакції генного зондування для виявлення в зразках
ДНК або РНК мікроба специфічним міченим зондом.

Хоча генное зондування не можна віднести до методів імунохімічноїаналізу, основною його принцип (взаємодія комплементарних структур)методично реалізується тими ж способами, що і індикаторні методиіммунодіагностікі. Крім того, методи генного зондування дозволяютьзаповнити інформацію про інфекційне агента у відсутності йогофенотипова експресії (віруси, вбудовані в геном, «мовчазні» гени).

Перші повідомлення про використання зондів були пов'язані з сутодослідницькими завданнями молекулярної біології - контролем наявності тихчи інших послідовностей ДНК в загальному пулі клітинної ДНК. Розрізняютькілька різновидів генного зондування: гібридизація по Саузерн
(аналіз ДНК), Nothern-блот (аналіз РНК), точкова гібридизація,гібридизація in situ. (на зрізі, в мазку)

Для проведення аналізу ДНК пробу піддають денатурації з метоюотримання одноцепочних структур, з якими і реагують молекули ДНК-або
РНК-зонда. Для приготування зондів використовують або різні ділянки ДНК
(або РНК), виділені з природного джерела (наприклад, того чи іншогомікроорганізму), як правило представлені у вигляді генетичнихпослідовностей у складі векторних плазмід, або хімічносинтезовані олігонуклеотиди. У деяких випадках як зондазастосовують препарати геномної ДНК, гідролізувати на фрагменти, іноді --препарати РНК, особливо часто - рибосомальних РНК [Stull T.1988].

В якості мітки використовують ті ж індикатори, що і при різнихвидах імунохімічної аналізу: радіоактивні ізотопи, флуоресцеїну,біотоп (з подальшим проявом комплексом авідін-фермент) і т. п.

Порядок проведення аналізу визначається властивостями наявного зонда. Удослідних лабораторіях використовують ДНК-зонди, приготов?? ленісамостійно і мічені, як правило, радіоактивним фосфором (32Р). Уданий час все частіше застосовуються комерційні набори, що містять всінеобхідні інгредієнти.

У більшості випадків процедуру проведення аналізу можна розділити нанаступні стадії: підготовка зразків (у тому числі екстракція і денатурація
ДНК), фіксація проби на носії (найчастіше - полімерний мембраннийфільтр), предгібрідізація, власне гібридизація, відмиваннянезв'язаних продуктів, детекция. При відсутності стандартного препарату
ДНК-або РНК-зонда попередньо проводиться його отримання і введенняпозначки.

Для підготовки проби може бути необхідний попередній
«Підрощування» досліджуваного матеріалу для ідентифікації окремих колонійбактерій або збільшення концентрації вірусів у клітинній культурі.
Проводиться і безпосередній аналіз зразків сироватки крові, сечі,уретральних зіскрібків, формених елементів крові або цільної крові наприсутність інфекційного агента. Для звільнення нуклеїнових кислот зскладу клітинних структур проводять лізис клітин, а в деяких випадкахочищають препарат ДНК за допомогою фенолу. Денатурація ДНК, тобто перехід її водноцепочную форму, відбувається при обробці лугом. Потім зразокнуклеїнових кислот фіксують на носії - нітроцеллюлезной або нейлоновоїмембрані, звичайно шляхом інкубації від 10 хв до 4 годин при 80 С0 у вакуумі.
Далі, в процесі предгібрідізаціі досягається інактивація вільних місцьзв'язування для зменшення неспецифічного взаємодії зонда змембраною. Процес гібридизації займає від 2 до 20 год, в залежності відконцентрації ДНК у зразку, концентрації використовуваного зонда і його розміру.

Після закінчення гібридизації та відмивання незв'язаних продуктівпроводиться детекция утвореного комплексу. Якщо до складу зонда входитьрадіоактивна мітка, то для прояву реакції мембрану експонують зфотоплівкою (ауторадіографія). Для інших позначок використовують відповідніпроцедури. Наприклад, відомий метод визначення модифікованих ділянок
ДНК з допомогою антитіл [Stollar В., Rashtchian А., 10987], введенням всклад зонда нізкомолеку лярні компонентів (біотин, дигоксин і т. п.) зподальшим проявом кон'югатів авідін-фермент, антитіло - фермент [van
Brunt J., Klausner A. 1987].

Перші повідомлення про комерційні зразках наборів для генногозондування з'явилися в 1986 р. - ними стали набори для визначення
М.pneumoniae, L.pneumoniae. Потім з'явилися набори для ідентифікаціїінших патогенів, у тому числі - вірусу імунодефіциту людини.
В даний час ведуться інтенсивні розробки щодо спрощення процедуригенного зондування до однієї - двох стадій процесу. Вжито спробивідмовитися від сорбції матеріалу на мембрані [Edelstein Р., 1986].
Найбільш перспективним є отримання нерадіоактивних (так званих --холодних) зондів. На цій же основі розвивається методика гібридизації,що дозволяє встановлювати наявність патогенів в препаратах зрізів, пунктатівтканини, що особливо важливо при патоморфологічної