Електронний мікроскоп

Електронна мікроскопія - метод морфологічного дослідження об'єктів здопомогою потоку електронів, що дозволяють вивчити структуру цих об'єктів намакромолекулярної і субклітинному рівнях.
Після випуску першої промислової моделі, що просвічує
(трансмісійного) електронного мікроскопа ЕМ пройшла великий шлях розвиткуі дала змогу перейти на якісно новий рівень вивчення матерії. ЕМ знайшлашироке застосування в морфології, мікробіології, вірусології, біохімії,онкології, медичної генетики, імунології. Завдяки ЕМ розкритасубмікроскопіческая структура клітин, відкрито ряд невідомих ранішеклітинних органел, таких як лізосоми, рибосоми, ендоплазматичнийретикулум, мікротрубочки, цитоскелет, структури, специфічні для окремихвидів клітин. ЕМ дозволила зрозуміти багато тонкі механізми розвиткухвороб, у тому числі на ранніх етапах їхнього виникнення, ще до появичіткої клінічної симптоматики.
ЕМ все ширше застосовується для ранньої діагностики захворювань, а також длявиявлення етіології інформаційних процесів. Її використовують в онкології длявизначення гістогенезом пухлин, що має важливе значення в лікуванні іпрогнозі онкологічного захворювання. У нефрології дослідження за допомогою
ЕМ матеріалу, отриманого при пункційної біопсії, дозволяє виявити ранішеморфологічні зміни структур пачок, діагностувати формугломерулонефриту і т.п. При ЕМ пунктатів печінки вдається провестидиференціальну діагностику гепатитів, гепатоз та інших захворюваньпечінки, визначити активність процесу і нерідко його етіологію.
Дослідження будови матерії на субклітинному і макромолекулярної рівняхстримуються можливостями роздільної здатності електронних мікроскопів.
Використання ЕМ у поєднанні з іншими методами, наприклад, завторадіографіей, гістохімічними, імунологічних, зумовило появуелектронної авторадіографіі, електронної гістохіміі, імунної електронноїмікроскопії (електронної іммуноморфологіі) та інших. Це дозволилозначно розширити інформацію, що отримується за допомогою ЕМ, спостерігатиструктурний вираз перебігу біохімічних процесів у клітині, що, у своючергу, підтвердило один з основних методологічних принципівсучасної біології - діалектична єдність структури і функції.
ЕМ вимагає спеціальної підготовки об'єктів вивчення, від якої взначною мірою залежать можливості методу. Відповідно до цілейдослідження методика такої підготовки може бути різною. Однакнеодмінною умовою для будь-яких електронно-мікроскопічних дослідженьє фіксація тканин або мікробів з максимальним збереженням їхприжиттєвого будови. Існують два принципово різних способуфіксації: хімічний та фізичний, кожен з яких має різніваріанти.

У ЕМ, як правило, використовують хімічну фіксацію за допомогою фіксаторів,стабілізуючими що володіють властивостями. Універсального для будь-яких тканинфіксатора не існує, тому в залежності від завдання конкретногодослідження застосовують відповідні фіксатори. При виборі хімічнихфіксаторів виходять з їх здатності коагулювати білки (спирти, ацетон,деякі кислоти, солі важких металів та ін) або стабілізуватиліпіди і гелі (четирехокісь осмію, глутаровий альдегід, формалін,двухромовоксільний калій та ін.)
Для дослідження беруть біопсійного матеріалу або матеріал від трупа людиниабо тварин невдовзі після настання смерті. Існують оптимальні термінивзяття різних тканин і клітин, зазвичай обчислюються хвилинами. Чим ранішетканина завадять у фіксатор, тим більш достовірні дані отримують проприжиттєвої структурі клітин. Фіксатори володіють різною швидкістюпроникнення в тканину: від цього залежить можлива величина об'єктадослідження. Так, четирехокісь осмію і глутаровий альдегід проникають втканина на 0,1-0,5 мм приблизно за 1 - 1,5 години, але для деяких тканин вономоже бути збільшено до 4 годин або до 20-30 хв. В окремих випадкахдопускається протягом однієї доби. Найбільшого поширення набулафіксація матеріалу в глутарової альдегіди з наступною дофіксаціей вчетирехокісі осмію. Глутаровий альдегід краще, ніж четирехокісь осміюфіксує білки, але гірше стабілізує ліпіди, що й обумовлюєвикористання обох фіксаторів як доповнюють один одного.
Для виборчої фіксації окремих субклітинних структур використовуютьбільш специфічні фіксатори (перманганат калію, двухромовокіслий калій іін). Якість фіксації в значній мірі залежить від рН іосмотичного тиску фіксуючого розчину. Оптимальним є рН 7,2 -
7,4, що відповідає фізіологічним параметрам. Тому застосовуютьбуферні розчини. Найчастіше застосовують фосфатні або какоділатний буфери.
Фізіологічне осмотичний тиск створюють шляхом додавання осмотичноактивних речовин, наприклад сахарози або деяких солей.
Є декілька методів хімічної фіксації: перфузійний, колифіксатор вводять в потік крові, фіксація на місці, коли фіксатор вводять втканина до її видалення, метод занурення посічених шматочків тканини вфіксатор. Для уповільнення аутолітіческіх процесів, що протікають в пошматованихшматочків тканини до повної їх фіксації, останню проводять при температурі 2 -
5 градусів.
Після фіксації необхідно здійснити зневоднення тканини. Цей процесповинен бути відносно швидким, поступовим і разом з тим забезпечитимаксимально повне видалення води із зразка, що досягається проведеннямщо підлягає дослідженню тканини через батарею спиртів або ацетоном висхіднійконцентрації (від 30 до 100%) протягом однієї години.
Наступним важливим етапом підготовки матеріалу для ЕМ є заливка
(висновок) тканин в заливальне середовища з метою отримання блоку, який маєоптимальним поєднанням твердості й еластичності, що дозволяє приготуватитонкий зріз тканини (товщиною не менше 100 нм), через який може пройтиелектронний промінь. Першими заливальних матеріалами були метилметакрилат ібутилметакрилат. В даний час вони майже не застосовуються, тому що токсичніі легко возгоняются під пучком електронів, що призводить до вираженихартефактами та забруднення електронного мікроскопа. Найбільш широко длязаливки тканин використовують епоксидні смоли, в основному аралдіт і Епон,часто застосовуються спільно. Менш поширені поліефірні смоли
(вестопал), водорозчинні заливальне суміші, з яких найчастіше користуютьсяглікольметакрілатом і дуркупаном. Однак, не один заливальне середовище неє хімічно інертною і в якійсь мірі впливає натканина: це необхідно враховувати при інтерпретації результатівмікрокопірованія.
В останні роки широке застосування знайшла заливка в так званікомпаунди, тобто в суміш певних речовин: основу (мономеру),затверджувача, додала образу полімеру міцність і твердість,пластифікатора, що забезпечує еластичність і пружність полімеру,ініціатора, діссаціірующего з утворенням вільних радикалів, прискорювача,що, взаємодіючи з мономером, звільняє активні додатковірадикали, і каталізатора, що сприяє початку реакції полімеризації. Упрактиці зазвичай використовують компаунд, що складається з основи, затверджувача,пластифікатора і каталізатора, роль якого може грати прискорювач абоініціатор. Є достатньо велика кількість способів просочення тканинизаливальних засобами. Процес просочення зазвичай протікає при кімнатнійтемпературі або у термостаті при температурі 30? протягом 48 годин. Потімшматочки тканини переносять в марковані желатинові капсули або спеціальніформи, наповнені заливальної сумішшю. Для полімеризації суміші капсули на 48годин поміщають в термостат при температурі 60?. У результаті полімеризаціїутворюється блок, що володіє відповідними властивостями.
Для отримання ультратонких зрізів товщиною 30-50 нм використовуютьсяскляні або алмазні ножі. Алмазні ножі довговічніше скляних, але черезза високої вартості вони не отримали широкого розповсюдження.
На задній стороні ножа прикріплюють спеціальну ванночку і встановлюють наультратом, в ванночку наливають 10% розчин етилового спирту і 10% розчинацетону на дистильованої води. У рухомому утримувачі ультратомазакріплюють блок з тканиною. Різка блоку здійснюється за рахунокпоступального руху стрижня власника, а підйом і опускання власникащодо ріжучої кромки ножа забезпечуються електронною схемою. Зазвичайна початку виготовляють так звані тонкі зрізи товщиною 1 мкм, вивчаючиякі, вибирають зацікавив дослідника ділянку. Зорієнтуємосявідповідним чином напівтонких зріз і блок, проводять заточування блоку зтаким розрахунком, щоб на вершині утворився піраміди знаходивсянеобхідну ділянку. Потім виготовляють ультратонкі зрізи товщиною 30-50нм. З ванночки зрізи переносять на металеві сітки.
Для констатуванням зрізів застосовують речовини з великою атомною вагою,такі як солі важких металів, природно розсіюють електрони. Іонидеяких з цих речовин можуть утворювати зв'язку з киснем іприєднаються до фосфатним групам нуклеїнових кислот. Інші, особливоуранілацетат, крім цього, діють як універсальні барвники. Свинецьзв'язується з комплексами тканини і осмієво факторами. Звичайно проводятьконтрастування ультратонких зрізів або поєднують контрастування шматочківі ультратонких зрізів тканини, після чого вивчають в електронному мікроскопі.
Хімічні методи фіксації і заливки матеріалу мають ряд недоліків.
Так, при їх використанні відбуваються хімічні зміни макромолекулярноїструктури клітин: при фіксації і зневоднюванні клітин і тканини втрачаютьдеякі речовини: при взаємодії тканини, фіксатора і заливальної середовищаможе змінюватися локалізація внутрішньоклітинних структур. Тому інтенсивнорозробляються фізичні методи приготування тканини для ЕМ і особливогістохіміі і цітохіміі. Більша частина цих методів заснована на дужешвидкому заморожуванні шматочків тканини.
При використанні методу заморожування-висушування шматочки тканини поміщаютьв холодоагенти (пропан, ізопентан або фреон), охолоджені до -150?, і вклітинах миттєво припиняються обмінні процеси. При цьому в тканини невстигають утворюватися кристали льоду, і тому субклітинні структури неруйнуються, а вода переходить у склоподібний стан. Потім у високомувакуумі (10-6 -10-7 мм рт.ст.) відбувається сублімація, після чого в тканиниспеціальним чином заливають заморожені метакрилат, аралдіт або вестопал
В. Однак, не завжди вдається досить швидко рівномірно заморозити тканина,а, отже, повністю уникнути утворення кристалів льоду, якіпри підвищення температури ушкоджують внутрішньоклітинні структури. Виникають іінші труднощі, що призводять до появи артефактів. Тому, частішезастосовують різновид цього методу: заморожування-заміщення. Післязаморожування воду, яка перейшла в склоподібний стан, видаляють, розміщуючитканину в зневоднюються речовини при низькій температурі. У цих умовахспирт і ацетон мало впливають на структуру клітин. Метод кріоскаливанія
(заморожування-травлення) дозволяє уникнути виникнення хімічноїреакції при обробці тканин. Фрагменти тканин заморожують у холодоагенті зшвидкістю перевищує 1000? в 1 с. Об'єкт поміщають у вакуумну камеру і тимабо іншим способом розколюють або розривають. На поверхні відколу наносятьплатіноуглеродное покриття (репліку). Потім репліку очищають від органічнихзалишків у розчині сильного окислювача, промивають у воді і поміщають насіточку для електронної мікроскопії.
Для досліджень поверхні біологічних тканин використовують і методвідтінення. Найбільше поширення отримав метод приготування реплікшляхом напилювання у вакуумній камері вуглецю на поверхню зразка тканин.
Для контрастування утворилася репліки на неї під гострим кутомнапилюють електронно-щільні речовини (платину або платіноірідіевий сплав).
При цьому кількість атомів металу значно більше, на тому боціконтурів зразка, яка ближче до джерела напилювання: при дослідженні велектронному мікроскопі вона виглядає неконтрастних. Протилежнаповерхню контуру має мало атомів металу: в електронному мікроскопі вонаконтрастна і як би відтіняє неконтрастних поверхню контуру. Методвідображення дозволяє розрахувати висоту контурів досліджуваного об'єкта, такяк відомий кут напилення, довжина тіні і збільшення, при якомупроводилося фотографування репліки в електронному мікроскопі.
Для вивчення поверхні ізольованих клітин і тканин служить скануюча
(растрова) ЕМ. Одним з основних умовою приготування об'єкта дляскануючої ЕМ є необхідність збереження відповідногоповерхневого натягу клітин, щоб уникнути їх деформації. Поверхнядосліджуваної тканини промивають збалансованими ізотонічними забуференнимісольовими розчинами або безбілкових культуральному середовищі з рН 7,3-7,4,підігрітими до температури 37?. Для фіксації зазвичай застосовують ізотонічнийрозчин глутаровоальдегіда з наступною дофіксаціей четирехокісью осмію.
Тканина зневоднюють в спиртах або ацетону, а потім висушують методамизаморожування-висушування або переходу критичної точки. Останній заснованийна використанні такого фізичного явища як виникнення припевних умовах критичного стану рівноваги пари і рідини.
При цьому методі тканина виявляється в газовому середовищі (тобто висушеної), щодозволяє уникнути пошкоджуючого дії поверхневого натягу. Длядосягнення високих ступенів дозволу підвищують електропровідність об'єкту,напиляя на нього важкі метали: золото, платину, срібло або їх сплави.
Застосовується також метод іонної бомбардування у вакуумі платівки металуіонами інертного газу. «Вибиті» атоми металу осідають на поверхніоб'єкта дослідження. Для виявлення внутрішньотканинний і внутрішньоклітиннихструктур застосовують механічні, термічні, хімічні та інші методи.
Для ЕМ мікробів застосовують подібні методи з урахуванням будови мікробів їхрозмірів, осмотичного тиску та ін Особливий підхід здійснюється при ЕМвірусів. Вивчення структур вірусів ускладнено через малих розмірів і слабкоюрозсіює здатності віріона. На перших етапах ЕМ вірусів ця трудністьдолалася оттенененіем частинок при випаровуванні важких металів увакуумі. Аж до кінця 50-их років 20 століття методика відтінення віруснихчастинок була основною при вивченні вірусів у суспензіях. Частіше для цієїметодики використовували уран 238, платину, паладій або сплави платини зпаладієм. Найбільше поширення отримав сплав платини з паладієм вспіввідношенні 4:1. Знаючи заданий кут відтінення, по довжині утвореної тінівизначають висоту вірусної частинки і її діаметр. Відтінення металамидосліджуваного об'єкта при поєднанні з кріогенними методиками (заморожування -висушування) дозволяє отримати важливу інформацію при вивченні структуривіріона ізометричних вірусів.
Широке поширення набула методика негативного контрастуваннявірусів за допомогою вольфрамофосфорной кислоти (Н3РW12О40), що приподщелачіваніі їдким калієм або їдким натрієм (від значення рН 2,0 до рН
7,0) змінюється і після нанесення препарату на вірус створює зону високогорозсіювання електронів, у результаті чого виявляються морфологічніознаки вірусу.
Розвиткові знань про структуру віріона сприяли криогенні методики.
Один з найпростіших варіантів таких методик полягає в наступному: сітки зпідкладкою і що знаходяться на них вірусами після нанесення контрастуєрозчину поміщають у зріджений пропан (температура -150?) абопереохолоджений азот (температура -200?). Подальше висушування зразкапри температурі -100? в глибокому вакуумі сприяє збереженню тривимірноїорганізації віріона. Виключення в цих умовах деформуючий ролі силповерхневого натягу води призвело до перегляду точки зору, що формавіріона у ліпідосодержащіх вірусів має високу лабільністю. Більшескладні криогенні методики, що застосовуються в електронній мікроскопії
(наприклад, кріоскаливаніе), також внесли помітний вклад у розвитокуявлень про структуру віріонів, особливо про що мають ліпопротеїднихоболонку.
Структура геному вірусів вивчається за допомогою модифікованої в 1959 році
Клейштейном і Лангом методики відтінення чинейних макромолекул важкимиметалами, які випаровуються з В-образним катодів під кутом в 5-10?.
Умовою, що дозволяє вивчити нуклеїнові кислоти, і особливоодноніческіе (поперечний розмір 1-1,1 нм), є зв'язування їх зосновними білками, тому що при цьому утворюється нуклеопротеїдів має діаметрдо 18 нм в двунітчатих структурах і до 15 нм - в однонитчатим. В якостітакого білка частіше використовують цитохром С. Поміщена на підкладку нуклеїновакислота в білковому чохлі має самий вигадливий контур, і можливістьпобачити її на всьому протязі здійсненна тільки в тому випадку, якщо підчас відтінення металами буде здійснений хоча б один поворот сітки зоб'єктом для напилювання на 360?. Кращі результати досягаються притривалому відтінення (до 10 хвилин) сплавом платини з паладієм ібагаторазовому повертанні напилень сітки на обертовому столику.
Численні модифікації методики Клейшмідта і Ланга дозволяють отримуватидані не тільки про довжину геному, але вивчати і ступінь гомології геномурізних вірусів, локалізувати вставку того чи іншого гена до складугібридних молекул, досліджувати гібридні молекули нуклеїнових кислот.
Загальна інформація про морфогенез вірусів отримана за допомогою ультратонкихзрізів вірусів. Техніка отримання ультратонких зрізів вірусів не відрізняєтьсявід загальноприйнятої.
В останні роки зростає питома вага ЕМ як експрес-методу абодіагностики вірусних інфекцій. Особливо велика роль методу імунноїмікроскопії, що дозволяє встановити родову приналежність вірусу.
Імунна ЕМ зіграла вирішальну роль на перших етапах дослідженняінфекційного гепатиту (гепатиту А), а також вірусних гастроентеритів івнесла істотний вклад у вивчення гепатиту В.
Теоретичні основи іммуноморфологіі на світлооптичному рівнірозроблені в 1942 році Кунсом зі співробітниками, які вперше показали,що в молекулу антитіла можна ввести деякі речовини, не порушуючиістотно їх специфічності. Розвиток цієї ідеї дозволило в 1959 році
Зінгер розробити іммунноморфологіческій метод наелектронномікроскопіческом рівні, заснований на використання антитіл,мічених феритину. Феритин-білок з високим вмістом заліза, в якомуатоми металу організовані у 4 субодиниці, розташовані близько один доодному, що забезпечує високу розсіювання електронів при ЕМ і чіткевиявлення молекули.
кон'югація білка з антитілом можлива за допомогою різнихбіфункціональних агентів, найбільше поширення серед яких отримали
3,4-толуендіізоціанат і ксіленметадіізоцеанат. Імунна електроннамікроскопія за допомогою антитіл, мічених феритину, ефективна длявиявлення екстрацеллярних антигенів мікробів в інфікованих тканинах, у томучислі вірусних антигенів на поверхні клітини, а також поверхневихантигенів в клітці. Разом з тим ця методика в ряді випадків неефективна,наприклад, якщо необхідно досліджувати внутрішньоклітинні об'єкти, антигенимікробів усередині клітини, що має місце, в першу чергу, при віруснихінфекціях. Це обумовлено тим, що молекулярна вага (маса) антитіл,мічених феритину, близько 800 тис., і тому походження їх черезплазматичну мембрану клітини неможливо, а антитіла, мічені феритину,проникли через неї шляхом ендоцитозу не вступають у контакт зі специфічнимантигеном. Тому основна маса досліджень, пов'язана з виявленнямвнутрішньоклітинних антигенів за допомогою антитіл, мічених феритину, виконанапри руйнуванні плазматичної мембрани шляхів заморожування-відтавання абообробки компліментом. Заміна феритину низькомолекулярними сполуками,що містять ртуть, йод, не знайшла широкого застосування із-за низькоїспецифічності методу.
З кінця 60-их років 20-го століття в імунології застосовуєтьсяіммуннопероксідазная методика ЕМ для виявлення антигенів всередині і наповерхні клітин. Перексідаза, яка використовується для мітки антитіл, дозволяєотримати найкращий ефект у порівнянні з іншими ферментами (фосфотаза,деякі оксидази) завдяки більш низьким молекулярному вазі (близько 40тис) і стійкості до різних гістологічним процедур. Антитіла,мічені пероксидазою, проникають у клітину і зв'язуються з гомологічнихантигеном. Кон'югірованіе антитіл з ферментом здійснюється поручбіфункціональних агентів, серед яких найбільш доступним єглутаровий альдегід. Після того як відбулася зв'язок антитіла звідповідним антигеном, локалізація ферменту виявляється після контактуйого з відповідним субстратом - бензидину, а-нафтол, сумішшю а -нафтол, з р-ферментом. У присутності перекису водню утворюється продуктз більш вираженою розсіює здатністю електронів в порівнянні зоточуючими структурами.