| | | Хламідіозу - СУЧАСНІ ПІДХОДИ до діагностики та лікування | | Цітоскопіческіе методи виявлення хламідій | | При цітоскопіческом методі одночасно з пошуком | | цитоплазматичних клітин-включень Провачека враховується | | кількість лейкоцитів як показника запалення, а також | | додаткова інформація про наявність супутньої | | бактеріальної мікрофлори, дріжджоподібних грибів, трихомонад | | і т.п. | | Показання: Гостра фаза захворювання. | | Матеріалом для дослідження служать зіскрібки з уретри у | | чоловіків і уретри і/або цервікального каналу у жінок. | | Матеріал беруть спеціальними щіточками або ложечками | | Фолькмана. Виділення з цервікального каналу видаляються | | ватним тампоном. Щіточка вводиться в канал на 1-2 см, | | обертається 15 секунд. Соскобний матеріал розподіляється на | | предметному склі, висушується на повітрі і фіксується в | | метанолі або холодному ацетоні. Найбільш популярна забарвлення | | за Романовскому-Гимзе. Після забарвлення препарати | | проглядаються в світловому мікроскопі, використовуючи | | иммерсионное об'єктив (х90). При цьому цитоплазма клітин | | забарвлюється в блакитний колір, ядра в фіолетово-синій, | | цитоплазматичні включення визначаються у вигляді | | темно-синіх або рожевих мікроколоній на тлі блакитний | | цитоплазми. На стадії елементарних включення хламідій | | фарбуються у рожевий колір, на стадії елементарних тілець | |-в синій. | | Цітоскопіческій метод широко доступний, але ефективний лише | | при гострих формах інфекції, значно менш ефективний і | | інформативний при хронічних формах захворювання При | | урогенітальному хламідіозі частота виявлення тілець | | Провачека в зіскрібків уретри і цервікального каналу не | | перевищує 10-12%. Наявність цих тілець підтверджує діагноз | | хламідіозу, проте їх відсутність не виключає наявність | | інфекції. | | | | | | Пряма імунофлюоресценція (ПІФ) | | Цей метод передбачає пряме виявлення антигенів | | хламідій. При люмінесцентної мікроскопії включення хламідій | | визначаються у вигляді зеленої або жовто-зеленої флуоресценції | | включень на коричнево-помаранчевому тлі цитоплазми клітин | | Включення можуть мати зернисту гомогенну або змішану | | структуру. | | Показаннями для діагностики хламідійної інфекції цим | | методом є: | | 1.Острая фаза захворювання. | | 2.Хроніческая фаза захворювання | | 3 Встановлення етіології хронічного інфекційного | | процесу урогенітального тракту | | 4. Вагітність з обтяженим акушерським анамнезом | | 5. Безпліддя неясного генезу. | | Діагностична інформативність ПІФ пов'язана з тим, що з її | | допомогою виявляються не тільки корпускулярні, а й | | розчинні антигени хламідій Цей метод не залежить від | | можливої зміни тинкторіальних властивостей мікроорганізму | | у процесі захворювання та лікування. ПІФ-метод є | | найважливішим скринінгове методом діагностики урогенітального | | хламідіозу. Його чутливість і специфічність при | | використанні моноклональних антитіл становить | | відповідно 65-90% і 85-90%. При оцінці результатів | | слід враховувати, що тільки показники внутрішньоклітинної | | флуоресценції можуть оцінюватися як позитивний | | результату цього тесту при використанні поліклональних | | антихламідійний антитіл, при використанні моноклональних - | | результат вважають за наявності 10 ЕТ в полі зору. | | Соскобние препарати готують також, як і для | | цітоскопіческіх досліджень. | | Випускають діагностичні набори, які містять моноклональні | | антитіла для ПІФ, наступні фірми: Syva, Drfco, Kallastad, | | Bartrels, Boots celltech, California Integrated | | Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенти фірм Syva, Difco, | | Kallastad представляють собою мічені Фітц моноклональні | | антитіла до основного білка зовнішньої мембрани хламідій, а | | реагенти інших фірм - моноклональні антитіла до | | родоспеціфіческому хламідійної ліполісахаріду (ЛПС). В | | Росії ЗАТ "Ниармедик плюс" при НІІЕМ ім. Н.Ф. Гамалії РАМН | | випускає моноклональні антитіла до ЛПС хламідій, які | | успішно конкурують з продукцією іноземних фірм по | | якості продукції. Це набір "Хламоноскрін" для | | визначення моноклональних антитіл до родоспеціфіческому | | ліпополісахарідному антигену і набір "Хламоноскрін-2" для | | визначення моноклональних антитіл до видоспецифічні | | білкового антигену хламідій трахоматіс. Набори мають ФС | | 42-359598 і реєстраційне посвідчення МОЗ Росії | | 93/270/9. | | Моноклональні антитіла відрізняються один від одного по | | викликається яскравості світіння, постійності виявляються форм ЕТ | | і ступеня специфічності. Для діагностики хламідій цим | | методом необхідний люмінесцентний мікроскоп. | | У цілому, метод ПІФ відповідає критеріям високої | | чутливості і специфічності, але вимагає виконання | | досвідченим, компетентним лабораторним працівником. | | Висококваліфікована експертна оцінка методом ПІФ рідко | | буває доступною, тому середня чутливість його | | знижується. Метод недостатньо чутливий і для | | стабільного визначення малих кількостей ЕТ. До того ж | | неможливо перевірити і негативні результати, і, | | отже, виявити серед них хибнонегативні, що | | призводить до зниження чутливості. | | | | | | Імуноморфологічні методи | | Ці методи засновані на виявленні антигенних субстанцій | | хламідій в епітелії та інших тканинах шляхом обробки | | препаратів специфічними антитілами. Антитіла | | діагностичної антихламідійний сироватки з'єднані з | | будь-якої міткою - люмінесцирує (Фітц-антитіла) або | | ферментної (ензим-мічені антитіла). | | | | | | Непрямий метод іммунофлюресценцііі | | Непрямий метод іммунофлюресценціі застосовують у тих випадках, | | коли немає в наявності Фітц-кон'югату антихламідійний антитіл. | | У цих випадках приготований тим же методом, що і для ПІФ | | препарат з клінічних проб обробляють спочатку | | антихламідійний антитілами, отриманими шляхом імунізації | | хламідіями овець, кролів, мишей або інших тварин, а | | потім другий сироваткою, специфічною для виду тварини, | | яке було імунізовані хламідіями. Антитіла другу | | сироватки кон'югованих з Фітц. Показання до застосування та | | специфічність даного методу збігаються з ПІФ. | | | | | | Діагностика хламідій на культурі клітин МсСоу | | Одним з кращих, але в той же час найбільш трудомістким | | є метод діагностики хламідій шляхом ізоляції | | збудника на культурі клітин, оброблених різними | | антиметаболітів ( "золотий стандарт") Для цієї мети звичайно | | використовують чутливу культуру клітин, оброблену | | ціклогексімідом. Чутливість культурального методу за | | порівнянні з ПЛР становить 70-80%, але в той же час він | | перевершує молекулярно-біологічні методи діагностики по | | специфічності. У літературі описані випадки виявлення | | хламідій трахоматіс методом ПЛР при негативних | | результати культурального тесту і навпаки. | | Показаннями для діагностики хламідійної інфекції цим | | методом є: | | 1 Вагітність з обтяженим акушерським анамнезом. | | 2. Оцінка ефективності проведеного антибактеріального | | лікування. | | 3. Виявлення чутливості та резистентності до | | антибактеріальним | | препаратів. | | 4. Виявлення хламідій у ВІЛ-інфікованих або осіб з | | вторинними імунодефіцитними станами (онкологічні | | хворі після проведених курсів променевої та хіміотерапії, | | трансплантації кісткового мозку; особи, які отримують | | імунодепресанти; хворі на вірусний гепатит та | | туберкульоз). | | 5. Безпліддя неясного генезу. | | 6. Встановлення етіології хронічного інфекційного | | процесу урогенітального тракту. | | Культуральні посів є референс-методом при оцінці | | ефективності антибактеріальної лікування. При дослідженні | | біопроб методом ПЛР після курсу хіміотерапії в деяких | | випадках можна отримати "хибнопозитивні з клінічною | | точки зору "результати. Це пов'язано з тим, що неможливо | | однозначно оцінити життєздатність і патогенність | | мікробної клітини на підставі виявлення фрагменту її | | геному, використовуючи лише дані молекулярно-біологічних | | методів. У цьому випадку при дослідженні клінічного | | матеріалу за допомогою культурального посіву мікробні клітини, | | втратили ці важливі з клінічної точки зору властивості, | | не дадуть зростання в клітинній культурі. | | Для транспортування і зберігання клінічного матеріалу | | використовують спеціальну живильне середовище (транспортна | | середу). Вона розливається в пеніциліновий флакони по 1 мл і | | зберігається при температурі + 4 ° С (в загальній камері побутового | | холодильника) протягом 2-х місяців. Склад транспортної | | середовища: середа MEM з додаванням 10% сироватки великої | | рогатої худоби і антибіотика гентаміцину концентрації 50 | | мкг/мл. | | Клінічний матеріал після перенесення в транспортну середу | | зберігається в загальній камері холодильника при температурі + 4 ° | | З і, протягом двох діб повинен бути доставлений в | | лабораторію. | | Процедура посіву | | 1. Обробка одноденною клітинної культури МсСоу 1% | | розчином ДЕАЕ декстрану протягом 30 хвилин. | | 2. Зараження оброблених клітин матеріалом, отриманим від | | хворих. | | 3. Центрифугування заражених клітин при 2500 g протягом | | 45 хвилин. | | 4. Відмивання клітин живильним середовищем. | | 5. Додавання до клітин ростової середовища, що містить | | ціклогексімід. | | 6. Інкубації клітин протягом двох діб при 36 ° С. | | 7. Виявлення хламідій в клітинах методом прямої | | иммунофлюоресценции або ПЛР. | | Реальний термін отримання результатів цим методом - сім | | днів. | | | | В даний час в літературі зростає кількість повідомлень про | | випадках резистентності хламідій до антибактеріальних | | препаратів (еритроміцину, тетрацикліну, доксициклину, | | фторхінолонів). Цінність культурального методу полягає в | | те, що він є поки єдиним методом, який дозволяє | | вибрати антибактеріальний препарат для лікування хламідійної | | інфекції та оцінити ефективність антибактеріальної терапії. | | | | Схема методу виявлення стійкості хламідій трахоматіс к | | антибактеріальних препаратів | |-Хламідійним ізолятів, виділених від хворого при посіві, | | заражають чутливі клітини. | |-К заражених клітин додають ростові середу, що містить | | антибіотик. | |-Заражені клітини інкубують 5 днів при температурі + 36 ° | | С. | |-Хламідій Чутливість до антибіотика визначається за | | придушення інфекції в заражених клітинах. Процедура | | тривала, займає за часом два тижні. | | | | | | Діагностика Chlamydia trachomatis методом полімеразної | | ланцюгової реакції | | Дорожнеча, тривалість і трудомісткість | | мікробіологічного виділення хламідій у культурі | | істотно ускладнює використання цієї процедури в | | рутинної лабораторній діагностиці. В літературі накопичений | | великий клініко-лабораторний досвід з використання методу | | ПЛР для виявлення хламідій трахоматіс. Особлива увага при | | його використанні слід приділяти, без сумніву, питань | | правильної інтерпретації отриманих результатів. | | Екстремально високі показники чутливості і | | специфічності ПЛР роблять цю методику в чому | | революційної в лабораторній діагностиці. Основними | | мішенями при виявленні хламідій трахоматіс є | | нуклеотидних послідовність видоспецифічні | | кріптіческой плазміди, послідовність головного білка | | внутрішньої мембрани, рибосомальні гени. | | Ця реакція є багато разів повторюються | | цикли синтезу (ампліфікації) специфічної області | | ДНК-мішені у присутності термостабільної ДНК-полімерази, | | дезоксінуклеотідтріфосфатов, відповідного сольового | | буфера і олігонуклеотидних затравок-праймерів, що визначають | | кордону ампліфіціруемого ділянки. Кожен цикл складається з | | трьох стадій з різними температурними режимами. На першому | | стадії при 94 ° С відбувається розділення ланцюгів ДНК, потім | | при 56-58 ° С - приєднання (отжиг) праймерів к | | комплементарним послідовностей на ДНК-мішені, і при | | температурі 72 ° С протікає синтез нових ланцюгів ДНК шляхом | | добудовування ланцюгів праймерів в напрямку 5 '-3'. В | | кожному циклі відбувається подвоєння числа копій | | ампліфіціруемого ділянки, що дозволяє за 25-40 циклів | | напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою обраних | | праймерів, в кількості, достатній для її детекції з | | допомогою електрофорезу або альтернативними йому технологіями | | В порівнянні з широко застосовуються імунологічними | | тестами ПЛР-діагностика має низку переваг: | |-високою і регульованою специфічністю, обумовленої лише | | нуклеотидної послідовністю, яка застосовується в даній | | діагностичній системі; | |-високою чутливістю, що дозволяє діагносціровать не | | тільки гострі, але й латентні інфекції (можливе виявлення | | навіть поодиноких бактерій або вірусів); | |-хімічна схожість всіх нуклеїнових кислот дозволяє | | розробляти універсальні процедури для виявлення | | різних інфекційних агентів, | |-можливістю ідентифікації збудника протягом 4,5-5 | | годин. | | | | Доставка біоматеріалу в ПЛР-лабораторію проводиться в | | холодового термоконтейнери або термосі з льодом. Важливою | | відмінною рисою ПЛР-діагностики є | | відносно низька вартість обладнання для проведення | | аналізу, що поєднується з універсальністю методу, що | | дозволяє виявляти весь спектр клінічно актуальних | | інфекційних агентів. | | | | ПЛР-лабораторія повинна бути розділена на зони (кімнати). | | Слід мати не менше двох кімнат | |-пре-ПЛР-приміщення, де проводиться обробка клінічних | | зразків, виділення ДНК, приготування реакційної суміші | | для ПЛР і постановка ПЛР (при наявності умов два останніх | | етапу рекомендується також проводити в додатковому | | окремому приміщенні), у цих приміщеннях забороняється | | проводити всі інші види робіт з інфекційними агентами | | (мікробіологічний аналіз, ІФА, інші діагностичні | | тести), ПЛР-діагностика яких проводиться в даній | | лабораторії. | |-пост-ПЛР-приміщення, де проводиться детекция продуктів | | ампліфікації, в ПЛР-приміщенні допускається використовувати | | інші методи детекції інфекцій, діагностика яких | | проводиться в даній лабораторії. Кімнату детекції продуктів | | ампліфікації (пост-ПЛР-приміщення) слід розташовувати як | | якнайдалі від пре-ПЛР-приміщень. Слід виключити | | рух повітряного потоку з пост-ПЛР-приміщення в | | пре-ПЛР-приміщення. | | У кімнаті приготування реакційної суміші та в кімнаті | | обробки клінічних зразків повинні бути встановлені | | ультрафіолетові лампи, робочі поверхні в лабораторії | | повинні оброблятися дезінфікуючими розчинами. | | Показання для діагностики С. trachomatis методом ПЛР | | 1. Гостра фаза захворювання | | 2. Хронічна фаза захворювання | | 3. Встановлення етіології хронічного інфекційного | | процесу урогенітального тракту. | | 4. Вагітність з обтяженим акушерським анамнезом. 5 | | Безпліддя неясного генезу. | | 6. Контроль ефективності проведеного антибактеріального | | лікування. | | У разі виявлення фрагмента ДНК хламідії трахоматіс після | | курсу хіміотерапії слід провести культуральну | | діагностику для виключення "хибнопозитивні с | | клінічної точки зору результату ". Якщо проведення | | культуральній діагностики неможливо, то необхідно через | | 5-6 тижнів (повне оновлення епітеліального покриву | | сечостатевих шляхів) провести повторне дослідження методом | | ПЛР. | | 7. Виявлення хламідії у ВІЛ-інфікованих осіб, хворих | | туберкульозом, вірусним гепатитом і з вторинними | | імунодефіцитними стані (онкологічні хворі після | | курсів хіміо-і променевої терапії, трансплантації кісткового | | мозку, які отримують імуносупресивну терапію). | | У 1991 році компанія Хоффман-ла Рош ЛТД отримала від | | компанії Cetus права і патенти на використання ПЛР. У цьому | | ж році було створено Roche Molecular Systems, що займається | | виключно питаннями розвитку та вдосконалення ПЛР. В | | 1992 році були впроваджені перші стандартизовані | | тест-системи для клінічної ПЛР-діагностики AMPLICOR | | Chlamydia trachomatis, а в 1993 році розпочато виробництво | | цих тест систем. Численний?? ті проведені дослідження | | показали високу чутливість і специфічність даного | | набору. Це дозволило отримати даної тест-системи | | сертифікат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 році. | | У 1995 році з'явився новий набір AMPLICOR Chlamydia | | trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одночасної їх | | детекції в одній пробірці. У тесті використані | | біотінілірованние праймери (СР24/СР27) з кріптіческой | | плазміди С. trachomatis. Чутливість тесту становить | | 10 копій/мл, специфічність 99,6%. Тест-система включає: | | набір для збору та транспортування зразків, набір для | | виділення ДНК із цервікальних, уретральних зразків і сечі, | | набір для ампліфікації і детекції. Всі набори | | стандартизовані, повністю готові до використання, мають | | внутрішній контроль, систему захисту від контамінації. | | Науково-виробничою фірмою "Літех" при НДІ | | фізико-хімічної медицини МОЗ РФ випускається набір | | реагентів "Полімік" у вигляді трьох окремих наборів для | | визначення відповідно Chlamydia trachomatis, | | Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Кожен режим | | "Полімік" комплектується окремим набором для виділення ДНК | | з біопроб. Інструкція по застосуванню набору реагентів | | рекомендована до затвердження експертною комісією Комітету | | за нової медичної техніки МОЗ РФ (протокол No 3 від | | 18.03.96 р.) і затверджена Міністерством охорони здоров'я РФ | | 17.05.96 р. (ТУ 9398-405-17253567-96). | | До складу реакційної суміші набору "Полімік" входить | | внутрішній контроль (рекомбінантний плазміда, що містить | | фрагмент-вставку розміром 308 н.п.). Цей компонент | | дозволяє контролювати процес проходження реакції | | ампліфікації, а також тестувати наявність у пробах речовин, | | інгібують ПЛР. Смуга, що відповідає внутрішньому | | контролю, повинна виявлятися як в позитивному, так і в | | негативного контролю, так і в усіх тестованих пробах. | | При виділення ДНК із біопробах ( "Набір для виділення ДНК") | | використовується метод екстракції ДНК з клітин хламідій з | | допомогою гуанідинів тіоціанат та скріплення вивільняються | | нуклеїнових кислот з частками великопористі скла. Це | | дозволяє оптимізувати умови виділення і підготовки | | проб для ампліфікації, а також зменшити кількість | | маніпуляцій зі зразком. При цьому всі маніпуляції проводяться | | в одній пробірці. Вихід хромосомної ДНК становить 70-80% | | за результатами визначення числа колонієутворюючих одиниць | | клітин Acholeplasma laidlawii (штам мікоплазм, узятий в | | як стандарт) як у випадку чистої культури, так і при | | додаванні цих клітин до клінічного матеріалу, не | | містить визначених інфекційних агентів. | | Після завершення ПЛР продукти ампліфікації фракціоніруют | | методом електрофорезу в 1,5% агарозном гелі. | | Аналіз результатів діагностики | | 1. У позитивному контрольному зразку для хламідій | | виявляється смуга розміром 501 н.п. | | 2. У негативному контрольному зразку смуга, | | відповідна фрагментів геному хламідій, повинна | | відсутніми. Поява смуги в негативному контролі | | свідчить про контамінації компонентів набору. | | 3. У аналізованої пробі відсутність смуги строго на рівні | | відповідного контролю свідчить про відсутність | | збудника в пробі, наявність смуги, що відповідає за | | електрофоретичної рухливості позитивного контролю, | | свідчить про наявність хламідій у клінічній пробі. | | 4. У всіх зразках виявляється смуга оранжево-червоного | | кольору, що відповідає внутрішньому контролю розміром 308 | | н.п. Отримані результати можна документувати | | фотографуванням гелів з використанням помаранчевого або | | інтерференційного (594 нм) світлофільтру. При використанні | | відеосистеми "Gel-doc" можливо документування | | результатів електрофорезу у вигляді комп'ютерного файлу, | | доступного будь-яким додаткам "Windows". | | Набір "Полімік" слід зберігати при температурі - 18-20 ° С | | протягом усього терміну придатності (6 місяців). Допускається, | | зберігання і транспортування набору при температурі не вище 0 | | ° градусів не більше однієї доби. | | За станом на третій квартал 1999 МОЗ Росії | | крім набору "Полімік" дозволені наступні діагностичні | | набори для виявлення хламідій трахоматіс методом ПЛР в | | якості виробів медичного призначення: | | набір реагентів ампліфікаціонний для визначення ДНК | | хламідій (Хламідія-Амплі-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 | | виробництва АТ "ВНЦМДЛ", Москва; | | набір реактивів для виявлення нуклеотидних | | послідовностей хламидия трахоматіс методом ПЛР (Хлам | | Ам) ТУ "9398-403-29032954-96 виробництва ЗАТ" Впровадження | | систем в медицину ". Москва, | | набір реагентів для виявлення ДНК хламідій трахоматіс | | методом ПЛР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 виробництва | | НПФ "ДНК-технологія", Москва. | | | | | | Переваги і недоліки різних методів виявлення Chlamydia | | trachomatis | | (Taylor-Robinson О., Thomas BJ, 1991, з доповненнями Говорун В.М, | | Бочкарьов Є.Г., Парфьонова Т.М., 1999) | | | | Характеристика/Метод | | ПІФ | | Культуральні посів | | ІФА-методи | | ПЛР | | | | Досліджуваний матеріал | | Будь-який | | Більшість | | Обмеження через неспецифічної реакцій | | Будь-який | | | | Значення правильно взятих проб | | Вирішальне | | Вирішальне | | Вирішальне | | Вирішальне | | | | Умови транспортування проб | | Якщо препарат фіксований-умови не важливі | | Швидка доставка чи зберігання при низькій температурі | | Не має значення, якщо проба взята в буфер | | Швидка доставка чи зберігання при низькій to менш важливо, ніж для | | культури клітин | | | | Умови зберігання | | На короткий час при +4 ° С тривало при -20 ° С | | 4 ° С - добу-дві. Трив зберігання в рідкому азоті | | 3 -5 днів при +4 ° С Заморожування знижує чутливість | | На короткий час + 4 ° С, два тижні - 20 ° С Тривалий час - в | | рідкому азоті | | | | Перевірка адекватності взяття матеріалу | | Мазки оцінюють під час тестування | | Не практикується | | Не практикується | | Визначається, чи присутній ДНК. | | | | Потреба в спеціальному обладнанні | | Люмінесцентний мікроскоп | | Центрифуга | | Комплект для ІФА | | Ампліфікатором й устаткування для електрофорезу | | | | Обробка проб | | Проста | | Трудомістке | | Стає простіше для нових тестів | | Вимагає суворої обережності, щоб не контаміновані ДНК | | | | Читання результатів | | Суб'єктивне і стомливе | | Суб'єктивне помірно стомлююче | | Об'єктивне, Просте | | Об'єктивне, просте | | | | Час виконання | | 30 хвилин | | 12-72 години | | 3 години | | 4,5-5 годин | | | | Способи перевірки результатів | | Повторний перегляд | | Повторний перегляд | | Повторення тесту | | Повторна проба або перетравлення ендоуклеазой | | | | Результат залежить від наступних причин: | | Досвіду мікроскопісту | | Чутливості клітинної культури | | Властивій потужності тесту | | Вимагає хорошого контролю та відсутністю контамінації | | | | Здатність до підтримки штаму | | Ні | | Да | | Ні | | Ні | | | | Використання як контролю ефективності лікування | | Обмежено | | Рекомендується | | Обмежено | | Рекомендується з обмеженнями | | | | | | | P>