Лейкоцітоспермія в діагностиці бактеріальних інфекцій
Сорокін Костянтин Володимирович
Вступ
Лейкоцітоспермія,
обумовлена ВООЗ як концентрація лейкоцитів> 1 млн/мл сперми, спостерігається
приблизно у 20% чоловіків з безпліддям, але її вплив на якість сперми не
з'ясовано. У деяких дослідженнях виявлено негативний вплив
лейкоцітосперміі на якість сперми, в інших впливу не виявлено або
спостерігалося навіть поліпшення якості сперми [1-5]. В останніх дослідженнях
показано, що активні форми кисню, які проводяться, зокрема,
лейкоцитами, можуть викликати пошкодження ДНК сперматозоїдів [6,7]. Це приводить до важливих
висновків: більшість чоловіків, які страждають на безпліддя, здають сперму для
штучного запліднення, і необхідно уникнути пошкодження сперматозоїдів
і інфікування яйцеклітини.
Походження
лейкоцитів у еякуляті часто залишається нез'ясованим. В основному, вони відбуваються
з придатка яєчка, тому що зникають після вазектомії [2], і з'являються при
інфікуванні. Однак, у більшості чоловіків, що звернулися в андрологічний
клініку з приводу безпліддя, не спостерігалося проявів інфекції (наприклад,
епідидиміту). Крім того, наявність лейкоцитів слабо корелює з присутністю
бактерій [8,9]. Бактеріоспермія, яка ймовірно пов'язана з
контамінацією, виявлялася більш ніж у 50% випадків [10] незалежно від
лейкоцітосперміі. Дезінфекція шкіри повинна зменшувати кількість
псевдопозитивних посівів за рахунок виключення контамінації ентеральному
бактеріями [11]. Однак чутливість визначення патогенних бактерій в
зразках сперми за критеріями ВООЗ становить лише 20% [12].
Аналізи
сперми виконуються різними фахівцями (андрологам, урологами,
гінекологами, лікарями-лаборантами), і критерії ВООЗ не завжди суворо
дотримуються. Зазвичай замість пероксидазного реакції для оцінки кількості
лейкоцитів використовують фазову мікроскопію, або ж Пероксидазну реакцію
використовують, якщо кількість лейкоцитів перевищує певний рівень
(наприклад, 1 млн/мл). Однак цим досить простим методом підраховувати не
тільки всі лейкоцити (гранулоцити, лімфоцити, макрофаги), а й інші круглі
клітини, наприклад, круглі сперматіди, сперматоціти, сперматоспори і слущенний
епітелій. Як показав Keel [13], який досліджував 500 американських клінічних
лабораторій, у більшості з них не знають про відмінності цих методів. 35% з
цих лабораторій не були ознайомлені з інструкціями ВООЗ або навіть не мали ні
одного примірника керівництва, в якому йдеться про важливість використання та
розповсюдження стандартних методів аналізу сперми.
Так
як замість визначення кількості лейкоцитів за допомогою реакцій до цих пір
широко поширений підрахунок, мета даного дослідження - вивчити кореляцію
між лейкоцітосперміей і присутністю в спермі бактерій, а, отже,
визначити діагностичну цінність підрахунку лейкоцитів для визначення
бактеріосперміі. Всі аналізи проводили строго за інструкціями ВООЗ.
Матеріали та методи
Були
обстежено 143 чоловіки, що звернулися в клініку андрології для аналізу сперми.
Причиною звернення до клініки було безпліддя. Всіх пацієнтів обстежували
клінічно, включаючи огляд і пальпацію пеніса, мошонки і простати, а також
ретельно збирали анамнез. Усі пацієнти здавали сперму для аналізу та посіву.
До здачі аналізу не повинно було відбуватися еякуляції принаймні протягом
3-5 днів. Пацієнти повинні були помочитися перед здачею аналізу, а також вимити
пеніс, мошонку і руки водою з милом. Їм видавали широко відкривається пластикову
банку і просили принести сперму в лабораторію не пізніше, ніж через півгодини
після еякуляції. Якщо це було неможливо, еякуляція відбувалася в спеціальній
кімнаті в клініці. Всі зразки сперми отримували в результаті мастурбації.
Аналіз
сперми проводив один спеціально навчений лаборант не пізніше, ніж за годину
після еякуляції. Аналіз проводився повністю за інструкцією ВООЗ [14]. Враховували
концентрацію сперматозоїдів, рН насіннєвої рідини, вміст лейкоцитів і
вік пацієнта. pH вимірювали за допомогою індикаторних паперових смужок фірми
Merck (Merck KGaA, 64271 Дармштадт, Німеччина) (робочий інтервал pH 6.5-10.0).
Проте надалі аналізували тільки зміст лейкоцитів та наявність зростання
бактерій в посівах.
підраховували
всі клітини (макрофаги, гранулоцити), не можуть бути визначені як статеві клітини і їх
попередники. Чи не використані ніяких спеціальні методи забарвлення, таких як
Пероксидазна реакція і т.п. Для визначення морфології клітин використовували
предметні скла марки Testsimplets; Waldeck GmbH, Мюнстер, Німеччина,
пофарбовані метиленовим синім або ацетатом крезолового фіолетового. Лаборант
поміщав краплину сперми на предметне скло, витримував її при кімнатній
температурі протягом 2 годин і розглядав під збільшенням у 600 разів.
Концентрацію
лейкоцитів підраховували за інструкцією ВООЗ:
N x S
Кількість лейкоцитів
=
100
N
- Кількість лейкоцитів в тому ж полі зору, де знаходяться 100 сперматозоїдів,
S
- Концентрація сперматозоїдів (млн/мл). Підраховують не менше 200 лейкоцитів.
Найменша
вміст лейкоцитів, яке визначається цим методом - 3700 клітин/мл.
Після
аналізу зразки сперми відправляли у відділення медичної мікробіології для
посіву. Посів проводили на економічно доступні агарових середовища. У
Надалі аналізували тільки зростання патогенних бактерій. Нормальну флору
уретри не враховували і включали до групи нормальної бактеріальної флори
геніталій.
Статистичний
аналіз проводили за допомогою статистичного пакету програм для соціальних
наук (SPSS 10.0.7, SPSS.Inc. 1989-1999). Всі демографічні дані
представлені медіаною і 25-м і 75-м квартиля. Для визначення діагностичної
цінності лейкоцітосперміі при виявленні росту бактерій обчислювали
чутливість, специфічність, позитивне і негативне Предсказательная
значення (positive predictive value - PPV, negative predictive value - NPV), і
відношення правдоподібності (likelihood ratio (LR )).
Таблиця 1 - Результати посівів сперми: проведений посів 143
зразків, узятих у чоловіків з безпліддям. Визначали загальне переважання виду (в
Загалом у двох групах), включаючи різні ізоляти
Види бактерій
Група I
Група II
Перевага
Ureaplasma urealyticum
16
18
34/23.8
Enterococcus faecalis
15
9
24/16.8
Escherichia coli
4
6
10/7.0
Бета-гемолітичний стрептокок
5
4
9/6.3
Prevotella sp.
3
6
9/6.3
Bacteroides sp.
4
2
6/4.2
коагулазу-негативний
стафілокок
3
2
5/3.5
Staphylococcus aureus
2
1
3/2.1
Enterobacter sp.
4
2
6/4.2
Streptococcus viridans sp.
0
2
2/1.4
Анаеробні бактерії
1
0
1/0.7
Mycoplasma sp.
1
0
1/0.7
Gardnerella sp.
1
0
1/0.7
Позначення:
група I - немає лейкоцитів, група II - присутні лейкоцити.
Таблиця 2 - Кількість ізолятів патогенних бактерій
Кількість ізолятів
Група I (n = 39)
Група II (n = 34)
1
26
18
2
8
13
3
4
3
4
1
0
Позначення:
група I - немає лейкоцитів, група II - присутні лейкоцити.
Результати
З
143 зразків 81 не містили лейкоцитів (група I), а в 62 зразках лейкоцити
були виявлені (група II). Медіана концентрації лейкоцитів у групі II
склала 0,63 млн/мл (0,44-1,00 млн/мл). Проявів інфекції (наприклад,
епідидиміту) не спостерігалося. Найбільш поширеними виявилися наступні
види бактерій: Ureaplasma urealyticum (група I: n = 16; група II: n = 18),
Enterococcus faecalis (група I: n = 15; група II: n = 9), Escherichia coli
(група I: n = 4; група II: n = 6), бета-гемолітичний стрептокок (група I:
n = 5; група II: n = 4) і Prevotella sp. (група I: n = 3; група II: n = 6) (Таблиця
1). Патогенні бактерії були виявлені в 48,2% (39/81) зразків з групи I і
в 54,8% (34/62) зразків з групи II. Нормальна бактеріальна флора геніталій
була виявлена в 34 зразках з групи I і в 26 зразках з групи II, тоді
як у 8 зразках групи I і в 2 зразках групи II зростання флори не було.
Деякі зразки містили бактерії декількох ізолятів (Таблиця 2).
Для
визначення діагностичної цінності лейкоцітосперміі при виявленні бактерій,
були обрані прикордонні значення концентрації лейкоцитів> 0.25,> 0.5,
> 0.75, і> 1 млн/мл. Результати представлені в Таблиці 3. Чутливість
визначення бактерій при концентрації лейкоцитів> 0,25 млн/мл склала 0,47
при специфічності 0,60. Чутливість і специфічність при концентрації лейкоцитів
> 1 млн/мл склали 0,16 і 0,84 відповідно. Найбільше відношення
правдоподібності (likelihood ratio - LR) - 1,29, було отримано для концентрації
лейкоцитів> 0,5 млн/мл при чутливості і специфічності 0,37 і 0,72
відповідно.
В
групах з різною концентрацією лейкоцитів було підраховано відсоткове
співвідношення зразків, що містять бактерії. Бактерії були виявлені в 27
(57,5%) зразках з концентрацією лейкоцитів> 0,5 млн/мл, у 16 (51,6%)
зразках з концентрацією лейкоцитів> 0,75 млн/мл, у 12 (52,2%) зразках з
концентрацією лейкоцитів> 1 млн/мл і у 34 (54,8%) в зразках з концентрацією
лейкоцитів> 0,25 млн/мл.
Обговорення результатів
В
51,1% (73/143) обстежених на предмет фертильності зразків сперми поза
залежно від наявності лейкоцитів були виявлені бактерії.
Таблиця 3 - Чутливість, специфічність, позитивна і
Предсказательная негативне значення (PPV і NPV) і відношення правдоподібності
(LR) різного рівня лейкоцітосперміі для передбачення бактеріосперміі
Концентрація лейкоцитів
(млн/мл)
Чутливість
Специфічність
PPV
NPV
LR
> 0.25
0.47
0.60
0.55
0.52
1.16
> 0.5
0.37
0.72
0.57
0.52
1.29
> 0.75
0.22
0.79
0.52
0.49
1.02
> 1
0.16
0.84
0.52
0.49
1.04
Нормальна
флора шкіри геніталій була виявлена в 42,0% (60/143) зразків, і лише 7,0%
(10/143) зразків були стерильні. Найбільш часто виявляли U. urealyticum
(23,8% (34/143) зразків). Цей вид бактерій зазвичай можна виділити у молодих
людей при частих статевих контактах і викликає уретрит. Лейкоцити виявлені в
43,4% (62/143) зразків, при цьому в 16,1% (23/143) з них концентрація
лейкоцитів перевищувала 1 млн/мл.
В
літературі зустрічаються результати аналогічного дослідження сперми, в якому
лейкоцітоспермія (за критеріями ВООЗ) спостерігалася в 10-20% [15]. У нашому
дослідженні містила лейкоцити значно більша частина зразків (43,4%
(62/143)). У нашій лабораторії не використовували Пероксидазну реакцію, тому
відмінність можна пояснити неправильним визначенням лейкоцитів. Крім того, в
літературі термін «лейкоцітоспермія» часто застосовують для концентрації
лейкоцитів> 1 млн/мл, тому такі дані можуть бути занижені. Для
порівняння, лейкоцітоспермія за критеріями ВООЗ спостерігалася в 16,1% (23/143)
зразків, що цілком співвідноситься з даними літератури. Але в групі II патогенні
бактерії виявлялися в 54,8% (34/62) зразків, а в групі I - в 48,2%
(39/81) зразків.
Подібні
результати переконують у тому, що виявити кореляцію між лейкоцітосперміей і
бактеріосперміей вкрай важко. Найімовірніше, лейкоцітоспермія має обмежену
діагностичну цінність для виявлення не тільки бактеріосперміі, а й
бактеріальних інфекцій. Ні в одного з 143 чоловіків на момент обстеження не
було ознак інфекцій. Отже, більш актуально обговорювати виявлення
бактеріосперміі, а не інфекцій. Відповідно до рекомендацій ВООЗ, учасників
дослідження просили мити руки і пеніс водою з милом, але не обробляти шкіру
антисептиками. Незважаючи на те, що така підготовка запобігає
хибно позитивні результати, зазвичай її не проводять. Основна мета
дослідження полягала в тому, щоб оцінити найпоширеніші методи
аналізу, суворо дотримуючись рекомендацій ВООЗ.
Під
всіх групах, виділених в залежності від концентрації лейкоцитів, більше 50%
зразків містили бактерії. Чутливість зменшувалася від 0,47 в групі з
мінімальною концентрацією лейкоцитів (> 0,25 млн/мл) до 0,16 у групі з
максимальною концентрацією (> 1 млн/мл). У цих же групах специфічність
підвищувалася від 0,60 до 0,84. PPV і NPV в різних групах значуще не змінювалися
(0,55 і 0,52; 0,52 і 0,49). LR не був вирішальним параметром (змінювався в діапазоні
від 1,16 до 1,04). Проте, найбільше значення LR брало в групі з
концентрацією лейкоцитів> 0,5 млн/мл. PPV і NPV в цій групі були також
найбільшими.
З
цих даних можна зробити висновок про те, що лейкоцітоспермія не може служити
для визначення бактеріосперміі. Такий результат узгоджується з висновками
Punab і співроб. [12]. Однак у цьому дослідженні під лейкоцитами розуміли лише
лімфоцити, тоді як до лейкоцитам також відносяться макрофаги і гранулоцити. За
даними цього дослідження, у групі зразків з лейкоцітосперміей за критеріями
ВООЗ чутливість склала 25% (у нашому дослідженні з урахуванням всіх типів
лейкоцитів - 16%), а оптимальне співвідношення чутливість/специфічність
було при концентрації лейкоцитів> 0,2 млн/мл (чутливість 45% і
специфічність 69%). Ми отримали схожі результати у групі з концентрацією
лейкоцитів 0,25 млн/мл - чутливість 47%, специфічність 60%. LR в цій
групі склало 1,16, а в групі, виділеній за критеріями ВООЗ, - 1,04.
Крім
цього, результати, отримані для лейкоцітосперміі як маркера бактеріосперміі,
узгоджуються з дослідженнями, в яких застосовували Пероксидазну реакцію [8,9].
Trum і співроб. [8] виявили у 39% чоловіків бактеріальні інфекції та у 11% --
вірусні. Площа під кривою receiver operating склала 0,55 та 0,56
відповідно, і був зроблений висновок про низьку діагностичної цінності
лейкоцітосперміі для виявлення бактеріальних інфекцій. Площа під кривою в
нашому дослідженні склав 0,53 (95% довірчий інтервал 0,44-0,63) (Див
Рис.1), що можна порівняти з результатами більш швидкого підрахунку лейкоцитів. Rodin і
співроб. [9] використовували різні методи забарвлення лейкоцитів (за Грамом,
Пероксидазну, крезоловим фіолетовим - метиленовим синім) і також не отримали
кореляції між наявністю лейкоцитів і бактерій. Отже, можна зробити
висновок про те, що лейкоцітоспермія має невелике значення у виявленні
бактеріосперміі і дефектів сперми.
Ось
x - специфічність, ось y - чутливість
Рис.
1 - Крива receiver operating для різних концентрацій лейкоцитів і
бактеріосперміі. Площа під кривою 0,53 (95% довірчий інтервал
0,44-0,63), Див дані в Таблиці 3.
Висновок
В
даному дослідженні лейкоцити були виявлені в 43,4% (62 з 143) зразків
сперми чоловіків, які звернулися в урологічне клініку для діагностики
безпліддя, а патогенні бактерії - у 51,1% (73/143) з них. Ставлення
чутливість/специфічність для визначення бактеріосперміі при концентрації
лейкоцитів> 1 млн/мл (лейкоцітоспермія за критеріями ВООЗ) було рівне
0,16/0,84. Найбільше відношення чутливість/специфічність спостерігалося в
групі з концентрацією лейкоцитів> 0,5 млн/мл, LR в цій же групі склав
1,29. Тим не менше, підрахунок лейкоцитів у спермі не має Предсказательная
здібності для бактеріосперміі. Цей висновок узгоджується з даними
літератури про те, що підрахунок лейкоцитів без використання спеціальної забарвлення,
незважаючи на простоту виконання, має невелику діагностичну цінність.
Список літератури
[1] Wolff H, Politch JA, Martinez A,
Haimovici F, Hill JA, Anderson DJ. Leukocytospermia is associated with poor
semen quality. Fertil Steril 1990; 53:528-36.
[2] Wolff H. The biologic
significance of white blood cells in semen. Fertil Steril 1995; 63:1143-57.
[3] Tomlinson MJ, Barratt CL, Cooke
ID. Prospective study of leukocytes and leukocyte subpopulations in semen suggests
they are not a cause of male infertility. Fertil Steril 1993; 60:1069-75.
[4] Kiessling AA, Lamparelli N, Yin
HZ, Seibel MM, Eyre RC. Semen leukocytes: friends or foes? Fertil Steril
1995; 64:196-8.
[5] Alvarez JG, Sharma RK, Ollero M,
Saleh RA, Lopez MC, Thomas AJ, et al. Increased DNA damage in sperm from
leukocytospermic semen samples as determined by the sperm chromatin structure
assay. Fertil Steril 2002; 78:319-29.
[6] Erenpreiss J, Hlevicka S,
Zalkalns J, Erenpreisa J. Effect of leukocytospermia on sperm DNA integrity: a
negative effect in abnormal semen samples. J Androl 2002; 23:717-23.
[7] Saleh RA, Agarwal A, Kandirali
E, Sharma RK, Thomas AJ, Nada EA, et al. Leukocytospermia is associated with
increased reactive oygen species production by human spermatozoa. Fertil Steril
2002; 78:1215-24.
[8] Trum JW, Mol BW, Pannekoek Y,
Spanjaard L, Wetheim P, Bleker OP, et al. Value of detecting leukocytospermia
in the diagnosis of genital tract infection in subfertile men. Fertil Steril
1998; 70:315-9.
[9] Rodin DM, Larone D, Goldstein M.
Relationship between semen cultures, leukospermia, and semen analysis in men
undergoing fertility evaluation. Fertil Steril 2003; 79:1555-8.
[10] Cottell E,
Harrison RF, McCaffrey M, Wealsh T, Mallon E, Barry-Kinsella C. Are seminal
fluid microorganisms of significance or merely contaminants? Fertil Steril
2000; 74:465-70.
[11] Kim FY,
Goldstein M. Antibacterial skin preparation decreases the incidence of
false-positive semen culture results. J Urol 1999; 161:819-21.
[12] Punab M,
Loivukene K, Kermes K, Mandar R. The limit of leukocytospermia from the
microbiological viewpoint. Andrologia 2003; 35:271-8.
[13] Keel B. How
reliable are results from the semen analysis? Fertil Steril 2004; 82:41-4.
[14] World
Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen
and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 4th ed. Cambridge: Cambridge University
Press, 1999.
[15] Aziz N,
Agarwal A, Lewis-Jones I, Sharma RK, Thomas AJ. Novel associations between specific
sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril
2004; 82:621-7.
Коментар Wolfgang Weidner, Гессен, Німеччина
ВООЗ
[1] висуває пропозицію використати підвищений вміст
пероксидаза-позитивних лейкоцитів у спермі та висівання значного
кількості патогенних бактерій в якості ознак інфекцій придаткових залоз
у чоловіків. У 1995 році [2] експерти прийшли до висновку про те, що звичайні методи
забарвлення не дозволяють достовірно виявити лейкоцити в спермі. Більше того, хоча
преоксідазний метод можна застосовувати для підрахунку гранулоцитів, золотий стандарт
визначення всіх типів лейкоцитів - це іммуноцітологіческіе методи [2].
Нещодавно були отримані дані про те, що пероксидазних метод може виявитися
неточним через екзоцитозу вмісту гранулоцитів під час запалення [3].
Навіть
не враховуючи методику аналізу, можна сказати, що лейкоцітоспермія може
виникнути спонтанно [4], в результаті фагоцитарної активності [5] та
корелює з процесом апоптозу [6] в спермі. Крім того, лейкоцітоспермія може
бути пов'язана з виділенням лейкоцитів простатою, яка формує основний
обсяг еякулята [7]. З цих даних випливає, що вміст лейкоцитів у спермі
залежить від безлічі різних і не цілком з'ясованих факторів.
Ці
фактори повинні враховуватися при дослідженні кореляції між лейкоцітосперміей
і бактеріосперміей. При концентрації лейкоцитів> 1 млн/мл [6]
чутливість для визначення значущою бактеріосперміі відповідно до
кривими receiver operating characteristic вкрай низька [8]. З урахуванням того, що
можна значно знизити кількість псевдопозитивних результатів шляхом
простий підготовки шкіри [9], звертають на себе увагу дані більш пізнього
дослідження [10], в якому оцінювали вміст бактерій у перші порції
сечі, середньої порції сечі, спермі, підвищену концентрацію лейкоцитів у спермі
і настання вагітності. Між вмістом бактерій у спермі,
лейкоцітосперміей і настанням вагітності кореляції виявлено не було.
В
Загалом, на даний момент у всіх дослідженнях підтверджується висновок авторів
(Lackner і співр.) Про те, що підрахунок лейкоцитів без використання спеціальних
методів не може бути використаний для діагностики бактеріосперміі.
[1] Rowe PJ, Comhaire FH, Hargreave TB,
Mahmoud AMA. WHO manual for the investigation, diagnosis and manage-ment of the
infertile men. Cambridge University Press, 2000.
[2] Wolff H. The
biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril
1995; 63:1143-57.
[3] Villegas J,
Schulz M, Vallejos V, Henkel R, Miska W, Sanchez R. Indirect immunofluorescence
using monoclonal antibodies for the detection of leukocytospermia: comparison
with peroxidase staining. Andrologia 2002; 34:69-73.
[4] Yanushpolsky
EH, Politch JA, Hill JA, Anderson DG. Antibiotic therapy and leukocytospermia:
a prospective, ran-domzided, controlled study. Fertil Steril 1995; 63:142-7.
[5] Tomlinson
MJ, White A, Barratt CLR. Bolton AE, Cooke ID. The removal of morphologically
abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes.
Human Reproduction 1992; 7:517-22.
[6] Ricci G,
Perticarari S, Fragonas E, Giolo E, Canova S, Pazzo-bon C, et al.
human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes.
Human Reproduction 2002; 17:2665-72.
[7] Ludwig M,
Vidal A, Diemer Th, Pabst W, Failing K, Weidner W. Chronic prostatitis/chronic
pelvic pain syndrome: seminal markers of inflammation. World J Urol 2003;
21:82-5.
[8] Punab M,
Loivukene K, Kermes K, Mandar R. The limit of leukocytospermia from the
microbiological viewpoint. Andrologia 2003; 35:271-8.
[9] Kim FY,
Goldstein M. Antibacterial skin preparation decreases the incidence of
false-positive semen culture results. J Urol 1999; 161:819-21.
[10] Cottell E,
Harrison RF, McCaffrey M, Walsh T, Mallon E, Barry-Kinsella З Are seminal fluid microorganisms of
significance or merely contaminants. Fertil Steril 2000; 74:465-70.
Для
підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://www.uroweb.ru/
