ВСТУП
Мембрана еритроцита протягом довгого часу уявлялося дослідникам лише оболонкою, що відокремлює гемоглобін від плазми. Роль мембрани в функціонуванні цієї високо спеціалізованої клітини, здавалося, обмежується лише здатністю бути проникною для газів крові. Проте успіхи, досягнуті в мембранології за останні роки і, зокрема, вивченні мембрани еритроцита ссавців за допомогою біохімічних та біофізичних методів, примушують в даний час по-іншому поглянути на роль мембрани в роботі клітини. Сукупність наявних в літературі даних дозволяє зробити висновок про те, що плазматична мембрана еритроцита - найважливіший елемент клітини; вона одночасно є і механічної оболонкою з регульованими фізичними властивостями, і "диспетчерської" клітки, що здійснює координацію роботи клітини в залежності від фізичних і хімічних сигналів, що надходять до неї в організмі. [9]
Найважливіші компоненти біологічних мембран - білки, які здійснюють їх специфічні функції. Одні з них забезпечують транспорт певних молекул всередину клітини або з неї, інші є ферментами і каталізують асоційовані з мембраною реакції, третій здійснюють структурну зв'язок цитоскелету з позаклітинним матриксом або служать в якості рецепторів для отримання та перетворення хімічних сигналів з навколишнього середовища. Мембранні білки, що утворюють цитоскелет, з'єднуються один з одним специфічним для кожного типу клітин чином і формують складні динамічно взаємодіють між собою структури. Ці структури і відповідають безпосередньо за узгоджена поведінка частин клітин. [4] Гемоглобін можна вважати свого роду модельним білком, структура, властивості та функції якого найбільш повно вивчені в порівнянні з іншими білками протягом останніх 50 років. Десятки років досліджень гемоглобіну в багатьох лабораторіях світу призвели до значного прогресу в описі і розумінні фізичних, хімічних і біологічних аспектів його функціонування. [2] Однак, незважаючи на це, у науковій літературі недостатньо докладно висвітлено питання про зв'язок гемоглобіну із структурними білками еритроцитарних мембран.
Вивчення структури мембрани еритроцита людини і перш за все входять до їх складу білків є актуальним, оскільки ряд спадкових патологій (сфероцітарние анемії, міодистрофія, деякі захворювання центральної нервової системи) характеризуються різними порушеннями в білкової компоненті еритроцитарної мембрани і як наслідок порушенням її структурно-функціональної організації. [7] Певні чинники середовища можуть змінювати експресію генів, що відображається на життєдіяльності як окремих органів і систем, так і організму в цілому. Деякі автори розглядають рівень гемоглобіну в крові як універсальний неспецифічний показник адаптаційних процесів, процесів напруженості організму у відповідь на різні зовнішні впливи. [1] Так, наслідком дії таких чинників може з'явитися зменшення кількості гемоглобіну в крові або порушення структурно-функціональної організації білкової компоненти мембран еритроцитів. Результатом таких змін служить ряд патологій, і, як наслідок, - значне зниження адаптаційних можливостей людини. Тому на сьогоднішній день актуально вивчення структури мембрансвязанного гемоглобіну, оцінка його кількісного змісту і взаємозв'язок зі структурними білками еритроцитарних мембран. У зв'язку з почався систематичним вивченням продуктів експресії генів людини в рамках молекулярно-анатомічного напрямку представляється вкрай важливим встановлення кількості та основних властивостей поліпептидів, що входять до складу мембрани еритроцита, і складання каталогу білків. Можливості цих досліджень, а також пошуку первинного біохімічного дефекту при спадкових аномаліях істотно зросли після широкого розповсюдження методу двовимірного електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ). [7]
Метою цього дослідження було вивчення кількісного змісту мембранозв'язаних гемоглобіну еритроцитів людини та її зв'язку із структурними білками.
ЛІТЕРАТУРНИЙ ОГЛЯД
В силу своєї спеціалізації (перенесення кисню від легенів до тканин) еритроцит за механічними властивостями є унікальною кліткою, тому що на відміну від інших клітин постійно піддається вираженим деформуючим впливів в кровоносній руслі. [9]
Для нормального функціонування еритроцит повинен протягом відносно тривалого періоду часу зберігати свою цілісність і бути добре деформуються; остання властивість важливо перш за все для нормальної мікроциркуляції. У свою чергу деформуємість визначається рядом факторів, основні з яких - форма клітини і еластичність мембрани. Зараз можна вважати доведеним, що ці властивості мембрани еритроцита і клітини в цілому обумовлені наявністю білкової мембранної структури, що іменується мембранним скелетом клітини і розташованої на внутрішній стороні мембрани. [9] плазматичну мембрану еритроцитів слід розглядати як відкриту динамічну структуру, здатну специфічно і неспецифічно пов'язувати білки плазми крові і цитоплазмі еритроцитів. [6] Дослідники намагаються з'ясувати механізми метаболічного регулювання білкових взаємодій компонентів мембранного скелету між собою, а також з інтегральними білками мембрани, що має підвести до розуміння природи таких процесів, як зміна форми і деформованості, робота транспортних систем, зміна іонної проникності мембрани. У цьому огляді зроблено спробу узагальнити і осмислити наявні дані з цього питання.
Сучасні уявлення про структуру та функції мембранного скелету еритроцитів людини та інших ссавців склалися в основному за останні 25 - 30 років. За цей період опубліковано ряд докладних оглядів. Наявність сітчастої структури, що вистилає внутрішню поверхню мембрани еритроцита, було виявлено безпосередньо за допомогою електронної мікроскопії після обробки клітин неіонних детергентом тритоном Х-100. Мембранний скелет видно у вигляді двомірної мережі філаментів, довжина яких залежить від особливостей приготування препарату для мікроскопії. Білкові компоненти мембранного скелета були ідентифіковані за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфату натрію (ДДС).
Класичною роботою по електрофоретичної розділення білків мембрани еритроцитів людини є робота Фейрбанкса і співавторів, в якій автори запропонували номенклатуру поліпептидних смуг, що виявляються в солюбілізірованних за допомогою ДДС мембрані; цієї номенклатурою користуються в даний час більшість дослідників. При одночасному електрофорезі солюбілізірованних білків еритроцитарної мембрани в ПААГ у присутності ДДС виявляється 20 смуг, однак Фейрбанкс зі співавторами виділили 7 основних смуг, які були пронумеровані від катода до анода. У наступні роки були внесені лише незначні уточнення у цю номенклатуру. [9]
У зв'язку зі способом розташування макромолекул в мембрані еритроцита білки поділяють на периферичні (внутрішні) та інтегральні. Інтегральні утримуються в мембрані. До їх складу входять глікопротеїни і протеоліпіди. Опції інтегральних білків різноманітні: вони можуть виступати в ролі гідролітичних ферментів, рецепторів клітинної поверхні, окислювально-відновлювальних компонентів транспортної системи електронів і в якості специфічних білків входить до складу цитоскелету, який являє собою двовимірну мережа, поєднану безпосередньо з мембраною еритроцита через взаємодію з інтегральними білками . Також до периферичних білків відноситься ряд еритроцитарних ферментів.
Метод фракціонування мембранних білків одновимірним електрофорезом в ПААГ у присутності ДДС дозволили розділити білки мембрани щодо їх електрофоретичної рухливості, і отриманим фракціям білків були дані номери в міру зменшення їх молекулярної маси.
Смуги 1 і 2 включають окремі? - І?-Субодиниці спектріна.
Спектрін - основний білок цитоскелету еритроцитів. Спектрін утворює двовимірну мережу, до якої кріпляться Актинові олігомери. Молекула спектріна являє собою??-Гетеродімер. За даними електронної мікроскопії, гетеродімери мають форму зігнутих фібрил довжиною близько 100 нм. Вони можуть приймати різні конфігурації. Кожна ланцюг молекули спектріна містить понад 2000 амінокислотних залишків і складається з лінійно розташованих структурних доменів. Доменна структура була встановлена за допомогою аналізу пептидних фрагментів субодиниць. Вторинна структура? - І?-Субодиниць схожа і являє собою?-Спіральні ділянки, розділені чутливими до протеолізу?-Структурами. Димер спектріна асоціюються з?-Ланцюгом іншої димеру "голова до голови". Ніколи не зустрічаються? -? - Або? -?-Зв'язку. Тим димеру і тетрамерамі існують зворотні переходи, які залежать від умов середовища. При 37? З спектрін екстрагується з мембран еритроцитів у формі димеру, при 4? С - у формі тетрамера. При 30 і 40? С в розчині між димеру і тетрамерамі встановлюється рівновага. Так як у звичайних умовах отримання спектрін екстрагується у формі тетрамера, вважали, що in vivo спектрін знаходиться в тій же формі. Електронно-мікроскопічний аналіз свідчить про те, що такі олігомери утворюються в результаті асоціації 3-7 димерів спектріна. Вважають, що в еритроцитах присутні як олігомери, так і тетрамери, які утворюють двовимірну мережа цитоскелету. Молекула спектріна піддається множинного фосфорилюванню, ступінь якого не впливає на форму еритроцитів. [5]
Смуги 2.1, 2.2, 2.3 Представлені різними формами периферичного білка анкіріна. Дані електронної мікроскопії свідчать про те, що мережа спектріна розташована на певній відстані від мембрани і, очевидно, взаємодіє інтегральними білками мембрани. Латеральна рухливість інтегральних білків залежить від присутності спектріна: це підтверджує наявність такої взаємодії. Під час обробки мембран хімотрипсин був виділений білковий фрагмент з мовляв. масою 72 kD, який інгібувати взаємодія спектріна з еритроцитарної мембраною, збідненій спектріном. Білок був названий анкіріном, від грецького ankyra, що значить заякорюють. Інша група дослідників назвала його сіндеіном, від грецького syndeo, що значить зв'язуватися разом. Молекула анкіріна (мол. маса 200 kD) має сферичну форму і складається з двох доменів: нейтрального і фосфорілірованний. Фосфорілірованним доменом анкірін взаємодіє з?-Субодиницею спектріна на відстані 20 нм від С-кінця молекули. Нейтральний домен анкіріна здійснює зв'язок з білком смуги 3. [5,6]
Білок смуги 3 Білок 3 (аніонтранспортний білок) - одна з основних інтегральних білків еритроцитарної мембрани - є глікопротеїдів з мовляв. масою 90 kD. Показано, що цей білок бере участь у забезпеченні аніонного транспорту, у зв'язуванні цітоскелетного каркасу з мембраною, цитоплазматичних білків гемоглобіну і гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази. Не всі молекули білка 3 взаємодіють з анкіріном. Якби всі молекули білка 3 були пов'язані з анкіріном і, отже, з усією спектріновой мережею, це виключило б можливість латеральних переміщень самого білка, освіти кластерів і транспортних функцій. Зв'язок спектріна з мембраною здійснюється, ймовірно, не тільки через анкірін, але також за допомогою додаткових взаємодій. Наявні на сьогодні дані свідчать про те, що білок 4.1 забезпечує зв'язок спектріна з інтегральним білком мембрани. [5] Всі перераховані додаткові взаємодії носять слабкий характер і, мабуть, грають другорядну роль в порівнянні з взаємодією спектрін? Анкірін? Білок 3.
Білок смуги 4.1 Необхідний для нормальної стабілізації мембрани, закріплює зв'язок спектріна з актином. На електрофореграмме даний білок розділяється на дві смуги: 4.1а (Mr = 80 kD) і 4.1b (Mr = 78 kD). Перехід 4.1а в 4.1b здійснюється за допомогою деамідірованія. Це глобулярні білок з мовляв. масою 80 kD, що становить близько 5% від білкової маси цитоскелету еритроцитів. Його ізоформи подібні за амінокислотним складом. Обидві ізоформи здатні взаємодіяти з спектріном. Кожна з них міститься в кількості приблизно 100 000 молекул на 1 клітину. [5]
Білок смуги 4.2 Паллідін - це олігомер (Mr = 72 kD), в клітці присутній у дімерной і трімерной формах з Mr = 185 kD. З'єднується з цитоплазматичних доменом білка смуги 3, анкіріном, спектріном і білком смуги 4.1. [14]
Білок смуги 4.5 В його склад входять інтегральні білки - переносники нуклеозидів і глюкози через еритроцитарної мембрану. Основна частина білків смуги 4.5 представлена транспортерами глюкози (Mr = 55 kD). [14]
Білок смуги 4.9 Центральний компонент цитоскелету з Mr = 48 kD. Цей білок виділений у вигляді тримера з Mr = 145 kD. Стабілізує взаємодії спектріна з актином і впливає на ступінь його полімеризації. Це фосфопротеін. Білок присутній в еритроцитах в кількостях, приблизно рівних кількості спектріна. Про функції цього білка практично нічого не відомо. Можливо, він бере участь у зміцненні цітоскелетного каркаса (мережі цитоскелету). Показано, що очищений поліпептид смуги 4.9 може взаємодіяти з Актинові нитками, знижуючи швидкість полімеризації актину і, можливо, стабілізуючи короткі Актинові нитки в еритроцитах. [5]
Смуга 5 Актин - представлений в еритроцитах?-Ізоформи і за фізико-хімічними властивостями схожий з актином м'язів. Так як функціональною формою актину є його полімер, спочатку намагалися з'ясувати, чи є в еритроцитах філаментний актин. Електронно-мікроскопічні дослідження показали, що актин присутній в еритроцитах у вигляді філаментів, що містять від 12 до 17 мономерів актину. [5] Виділені мембрани еритроцитів, а також комплекс спектріна, актину і білка 4.1 здатні індукувати полімеризацію мономірні актину, подібно олігомеру актину. Обробка цітохалазіном У пригнічує полімеризацію. Так як типовий фібрилярний актин не виявляється в нативних еритроцитах, а в дослідах in virto можна індукувати освіта довгих філаментів, пов'язаних з мембраною, слід, очевидно, припустити, що в еритроцитах існують якісь механізми, що обмежують зростання філаментів, подібно до того, як це робить цітохалазін В. Актинові олігомери зв'язуються з N-кінцем молекули спектріна латерально. Кожен тетрамер спектріна має два сайти зв'язування для Актинові олігомерів. Спектрін може зв'язуватися з Ф-актином по всій довжині Актинові нитки, і ці зв'язки, мабуть, істотні для освіти цітоскелетной мережі. Важлива роль у взаємодії актину і спектріна належить білку смуги 4.1, який пов'язується зі спектріном в тих же ділянках, що і актин. Зв'язок спектріна з актином у відсутність білка 4.1 слабка і значно посилюється в його присутності, тому взаємодія спектріна і актину називають 4.1-залежним. Комплекси білка 4.1, спектріна і актину володіють набагато більшою стійкістю до дисоціації при седиментації в сахарозі, ніж комплекси актину і спектріна.
Виникає питання про те, які чинники впливають на полімеризацію еритроцитарного актину. Відносно низька концентрація актину в еритроцитах не може, ймовірно, мати вирішального впливу на довжину філаментів. Припустимо, що на полімеризацію актину можуть впливати такі актінсвязивающіе білки, як спектрін і білок 4.1. Виявилося, що ці білки здатні регулювати швидкість полімеризації актину, скорочуючи лаг-фазу, зменшуючи швидкість елонгації і не викликаючи при цьому ніяких змін в послідовності етапів полімеризації. Спектрін і білок 4.1 викликають нуклеація глобулярні актину в умовах, коли концентрація актину нижче критичної і спонтанна полімеризація не відбувається. Таким чином, можна припустити, що спектрін і білок 4.1 представляють собою комплекс білків, які блокують повільний кінець Актинові нитки на відміну від більшості "замикаючих" білків, що взаємодіють з швидким кінцем. Проте пізніше були отримані дані, що суперечать цьому припущенням. Шен зі співавторами виділили фрагменти цитоскелету еритроцитів при обробці розчинами з низькою іонної силою при 37 ° С. [5] Електронно-мікроскопічні дослідження отриманих фрагментів показали,що частина з них містить філаменти актину, уздовж яких кластерами розташовуються спектріновие молекули. При інкубації цих препаратів з глобулярні актином (при концентрації актину в розчині вище критичної) відбувалося зростання Актинові ниток на обох кінцях. Тсукіта зі співавторами вивчали полімеризацію актину на мембранах еритроцитів, закріплених на електронно-мікроскопічних сектах. При інкубації цих препаратів з глобулярні актином на внутрішній поверхні мембран, що містять цітоскелетние білки спостерігалося зростання Актинові філаментів. [5] При концентраціях глобулярні актину, близьких до критичних, зростання спостерігалося тільки на повільному кінці, а при подальшому збільшенні концентрації - на обох кінцях нитки. Під час обробки мембран "кепірующім" білком з мол. масою 45 kD, що зв'язуються з швидким кінцем Актинові мікрофіламентів, зростання спостерігалося тільки на повільному кінці. Дані Шена і Тсукіти приводять до висновку про те, що в еритроцитах актин існує у вигляді філаментів з вільними кінцями. Отже, спектрін і білок 4.1 не є кепірующімі білками, проте безсумнівно впливають на стан актину в еритроцитах, стабілізуючи Актинові філаменти.
Білок смуги 6 Гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (ГАФД), молекулярна маса становить 35 kD. Розташована на цитоплазматичної домені аніонтранспортного білка, у складі мультіферментного комплексу. Даний білок є ферментом гліколізу і бере участь у регулюванні окислення гемоглобіну. [14]
Смуга 7 Основною складовою поліпептид - тропоміозін. Довгий час залишалася невідомою природа білка зони 7. Було показано, що цей білок зв'язується з антитілами до тропоміозіну, виділеного з м'язового шлунку курчати. Молекулярна маса білка співпадала з молекулярною масою тропоміозінов, виділених з мозкових тканин, з макрофагів і кров'яних платівок. Тропоміозін еритроцитів - димер з мовляв. масою 60 kD, що складається з двох субодиниць з мовляв. масою 29 і 27 kD і зв'язується з м'язовим актином (Ф-актином) при співвідношенні: 1 молекула тропоміозіна на 6-7 мономерів актину. Так як в еритроцитах філаменти актину містять до 15-17 мономерів, вони можуть пов'язувати два молекули тропоміозіна. [5]
Смуга 8 Представлено пептидного частиною ферменту глутатіон-S-трансферази (Mr = 23 kD). Взаємозв'язок білка смуги 8 з мембраною є кальцій - залежною.
У 1985 р. було показано, що ще одним компонентом цитоскелету еритроцитів є міозин. За допомогою моноклональних антитіл до важкої ланцюга міозину Фаулер виявив в еритроцитах поліпептид, який був виділений і охарактеризований. Білок складається з важкої ланцюга з мовляв. масою 200 kD і з двох легких ланцюгів з мовляв. масами 26 і 19,5 kD. У розчинах з низькою іонної силою він утворює біполярні філаменти і володіє АТФазной активністю. У еритроцитах міозин присутній приблизно в кількості 6000 молекул на 1 клітину, тобто на 1 молекулу міозину, як і в інших клітинах, припадає близько 80 мономерів актину. [5]
Білки, що утворять цитоскелет еритроцитів, неунікальни. Вони або їм подібні білки є в багатьох інших клітинах. Переважна їх локалізація - поблизу мембран. Ймовірно також, що розглянуті білки можуть бути поліфункціональні і використовуватися в структурних комплексах різного функціонального призначення. [5]
Смугу 9 на електрофореграмме становить білок Глобино, який є частиною мембрансвязанного гемоглобіну. Як вже говорилося вище, цитоплазматичний домен білка смуги 3, що включає близько 380 амінокислотних залишків, локалізована в цитоплазмі і відіграє важливу роль у підтримці форми еритроцита і його метаболізмі. N-кінцева послідовність цитоплазматичного домену багата амінокислотними залишками кислого характеру. На цій ділянці знаходяться центри зв'язування гідролітичних ферментів - гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази, альдолази, каталази, гемоглобіну і геміхрома. Таким чином, цитоплазматичний домен аніонтранспортного білка і є місцем локалізації мембрансвязанного гемоглобіну, про структуру, властивості і деякі аспекти функціонування якого буде сказано нижче.
Гемоглобін Гемоглобін - білок еритроцитів, червоних кров'яних клітин, що переносить молекулярний кисень від легенів до тканин в організмах хребетних тварин. Гемоглобін можна вважати свого роду модельним білком, структура, властивості та функції якого найбільш повно вивчені в порівнянні з іншими білками протягом останніх 50 років. Американський фізик Хопфілд назвав його атомом водню сучасної біохімії, маючи на увазі, що вивчення гемоглобіну зіграло в біохімії ту ж роль, що й вивчення атома водню у фізиці. Гемоглобін називають також почесним ферментом, оскільки дослідження його структури в статиці і динаміці дозволили значно просунутися в розумінні механізмів функціонування ферментів. Структура цього глобулярні білка відома в деталях головним чином завдяки роботам англійського біофізика Макса Перутца, який отримав перший рентгеноструктурні дані ще наприкінці 40-х років нашого століття. За ці дослідження він був удостоєний Нобелівської премії.
Структура гемоглобіну Молекула гемоглобіну складається з чотирьох субодиниць: двох? і двох? - І відповідно містить чотири поліпептидні ланцюжка двох сортів. Кожна?-Ланцюжок містить 141, а?-Ланцюжок - 146 амінокислотних залишків. Таким чином, вся молекула гемоглобіну включає 574 амінокислоти. Хоча амінокислотні послідовності? - І?-Ланцюжків різні, вони мають практично однакові третинні просторові структури. Власне кажучи, наведені вище деталі структури відносяться не до гемоглобіну, а до його білкової компоненті - глобіну. Кожна субодиниця гемоглобіну містить одну небілкової (так назвав простетичної) групу - гем. Гем являє собою комплекс Fe (II) з протопорфірину. Структура гема представлена на рис.1, а. [2]
Атом заліза може утворити шість координаційних зв'язків. Чотири зв'язку направлені до атомів азоту піррольних кілець, що залишилися два зв'язку -
Рис.1. Структура гема (а), структура активного центру дезоксігемоглобіна (б), структура активного центру оксигемоглобіну (в).
перпендикулярно до площини порфіринового кільця по обидва боки його. Геми розташовані поблизу поверхні білкової глобули в спеціальних кишенях, утворених складками поліпептидних ланцюжків глобіну. Гемоглобін при нормальному функціонуванні може знаходитися в одній з трьох форм: феррогемоглобін (зазвичай званий дезоксігемоглобіном або просто гемоглобіном), оксигемоглобіну і феррігемоглобін (званий також метгемоглобін). У феррогемоглобіне залізо знаходиться в закісной формі Fe (II), один з двох зв'язків, перпендикулярних до площини порфіринового кільця, спрямована до атому азоту гістідінового залишку, а друга зв'язок вільна (рис.1, б). Крім цього гістідінового залишку, званого проксимальних (сусіднім), по інший бік порфіринового кільця і на більшій відстані від нього знаходиться інший гістідіновий залишок - дистальний гістидин, не пов'язаний безпосередньо з атомом заліза. Взаємодія молекулярного кисню з вільним гемом призводить до необоротного окислення атома заліза гема [Fe (II) ==> Fе (III); гем ==> Гемін]. У дезоксігемоглобіне Глобин охороняє залізо гема від окислення.
Реакція оксигенації оборотне приєднання кисню (оксигенація), що дозволяє гемоглобіну виконувати свою основну функцію переносника, забезпечується можливістю утворити міцні п'яту і шосту координаційні зв'язки і перенести електрон на кисень не від заліза (тобто окислитися Fe2 +), а від імідазольного кільця проксимального гістидину. Це схематично зображено на рис.1, б. Замість молекулярного кисню залізо гема може приєднати окис вуглецю СО (чадний газ). Навіть невеликі концентрації СО призводять до порушення кіслородпереносящей функції гемоглобіну та отруєння чадним газом.
Вище було сказано, що одна молекула гемоглобіну містить чотири субодиниці і, отже чотири гему, кожен з яких може оборотно приєднати одну молекулу кисню. Тому реакцію оксигенації можна розділити на чотири стадії:
Hb + O2? HbO2 (1a)
НbO2 + O2? Hb (O2) 2 (1б)
Hb (O2) 2 + O2? Hb (O2) 3 (1в)
Hb (O2) 3 + O2? Hb (O2) 4 (1г)
Перш ніж розглянути цю головну функціональну реакцію гемоглобіну більш детально, необхідно сказати кілька слів про м'язовому гемоглобіні - міоглобін. Цей барвний білок м'язів являє собою комплекс гема з "чвертку" глобіну. Він містить одну молекулу гема і одну поліпептидних ланцюжок, склад і структура якої подібні до складу та структури?-Субодиниці гемоглобіну. Як і для гемоглобіну, найважливішою функцією міоглобіну є оборотне приєднання молекулярного кисню. Цю функцію характеризує так звана крива оксигенації, що зв'язує ступінь насичення гемоглобіну киснем (у відсотках) з парціальним тиском останнього, рО2 (мм Hg). Типові криві оксигенації гемоглобіну і міоглобіну (за умови досягнення хімічної рівноваги) наведено на рис.2, а, б. Для міоглобіну крива є гіперболою, як і повинно бути у випадку одностадійной хімічної реакції за умови досягнення хімічної рівноваги:
Mb + O2? MbO2 (2)
де Mb - міоглобін.
Рис. 2 Криві оксигенації
міоглобіну (а) і гемоглобіну (б)
Зовсім інша картина виникає у випадку гемоглобіну. Крива дисоціації має S-подібну форму. Без кисню молекули гемоглобіну мають низьку спорідненість до кисню і рівновага реакції (1а) зрушено вліво. Потім крива стає крутіше і при високих значеннях рО2 практично зливається з кривою дисоціації міоглобіну. [2]
Рис. 3. Логарифмічні анаморфози кривих оксигенації міоглобіну (a) і гемоглобіну (б)
М. Перутц пише, що розподіл молекул кисню по молекул гемоглобіну слід біблійній притчі: "Кожному, у кого є, дай ще, і у нього буде надлишок; у того ж, у кого немає, забери те небагато що, що в нього залишилося". Це змушує припустити, що між гемамі однієї молекули гемоглобіну існує певний зв'язок, завдяки якій приєднання кисню до одного гему впливає на приєднання кисню до іншого гему тієї ж молекули. Це явище було відомо задовго до робіт Перутца і встановлення структури гемоглобіну та механізму його реакції з киснем. Воно отримало назву гем-гем взаємодії. Фізіологічний сенс гем-гем взаємодії очевидний. Сігмоідная форма кривої дисоціації створює умови максимальної віддачі кисню при перенесенні гемоглобіну від легких з високим значенням pO2 до тканин з низьким значенням pO2. Для людини значення pO2 артеріальної і венозної крові в нормальних умовах (Т 37? С, pH 7,4) рівні відповідно 100 і 40 ммHg. При цьому (рис.2, б) гемоглобін віддає тканинам 23% зв'язаного кисню (ступінь оксигенації змінюється від 98 до 75%). При відсутності гем-гем взаємодії для одногемового міоглобіну (рис.2, а) ця величина не перевищує 5%. Міоглобін тому служить не переносником, а депо кисню і віддає його м'язової тканини лише за різкої гіпоксії, коли насичення тканини киснем падає до неприпустимо низького значення. [2]
Логарифмічна анаморфоза кривої дисоціації гемоглобіну людини представлена на рис.3, б. У цьому випадку початок кривої являє собою пряму під кутом 45? до координатним осях, як і для міоглобіну: перший молекули кисню з'єднуються в основному з молекулами гемоглобіну, ще не містять кисню, і геми таким чином оксігеніруются незалежно. Це свідчать про те, що гем-гем взаємодія обумовлене не просто наявністю декількох гемов в молекулі, а тим, що після оксигенації одного гема змінюються умови оксигенації інших гемов тієї ж молекули. Потім нахил кривої збільшується. Тангенс кута максимального нахилу отримав назву коефіцієнта Хілла (n), який відображає ступінь кооперативності процесу. Для міоглобіну n = 1, а для гемоглобіну людини (в нормі) n? 3. Поблизу області повного насичення гемоглобіну киснем нахил кривої знову стає рівним 45? (більшість молекул гемоглобіну або не містять вільних гемов, або мають лише один гем, здатний приєднати кисень).
Механізм кооперативності У 1963 році Моно, Шанже і Джекоб виявили, що активність деяких ферментів змінюється стрибком між двома значеннями при впливі на білок деяких низькомолекулярних агентів, які не беруть участі безпосередньо в каталітичному акті. Такі ферменти отримали назву аллостеріческіх, а саме явище - аллостеріі. Передбачається, що ці ферменти можуть перебувати в різних станах, перемикання між якими здійснюється при приєднанні специфічного низькомолекулярного ліганда (необов'язково поблизу активного центру). У 1965 році Моно, Вайман і Шанже зрозуміли, що гемоглобін, не будучи ферментом, належить до того ж класу білків. На той час уже було відомо, що структури глобул оксигемоглобіну і гемоглобіну різні, і автори припустили, що стани з різними значеннями констант оксигенації відповідають різним просторовим структурам білка. Для гемоглобіну постулюється наявність двох таких станів: R (від англ. Relaxed) і Т (від англ. Tense). Стан R характеризується високим, а Т - низьку спорідненість до О2 (сильніше і слабше пов'язують молекулярний кисень відповідно). В рамках цієї концепції вважається, що як в R-, так і в Т-стані спорідненість до кисню субодиниць однієї глобули (тобто є всіх чотирьох гемов однієї глобули) однаково. Цей постулат дозволяє побудувати порівняно просту математичну модель кооперативних властивостей гемоглобіну: КR, КТ і L (константи рівноваги реакцій асоціації в станах R, Т і відношення числа молекул гемоглобіну в станах Т і R відповідно). На рис.2, б зрозуміло, що КТ
? G = 2,3 RT lg (KR/KT) кДж/моль. (7)
Для гемоглобіну людини при 37 ° С ця "вільна енергія кооперативності" дорівнює 5,61 кДж/моль. У фізіологічних умовах при відсутності кисню лише ~ 3 * 10? 5% молекул гемоглобіну знаходяться в R-формі, а в умовах повного насичення киснем лише ~ 7-10? 3% - в Т-формі. [2]
Зміни електронної і просторової структури гемоглобіну в процесі оксигенації На рис.4 схематично показані електронна структура заліза гему, положення атома заліза щодо площини порфіринового кільця гему, спектральні та магнітні характеристики молекул у різних станах молекули гемоглобіну: дезоксігемоглобін, оксигемоглобіну і феррігемоглобін. Слід підкреслити, що у всіх випадках мова йде про рівноважних станах молекул білка. Ми побачимо далі, що перехід з одного стану в інший потребує значного (у молекулярних масштабах) часу, протягом якого система проходить через кілька нерівноважних станів, що помітно відрізняються за своїми фізичними і хімічними властивостями від рівноважних. [2]
У молекулі дезоксігемоглобіна залізо відстоїть від площини порфіринового кільця приблизно на 0,5-0,6 А ° (є невеликі відмінності між? - І?-Субодиниця). З шести 3d електронів заліза Fe (II) два електрони спарені на одній з нижчих d-орбіталей (dxy, dyz, dxs), а чотири електрона займають залишилися d-орбіталі, їх спінові моменти, згідно з правилом хунди, паралельні і сумарний спін S - 2. Магнітний момент гема в цьому стані дорівнює ~ 5,5 Борівського Магнетон (БМ), а спектр поглинання в зеленій області має характерну смугу з? Max ~ 556 нм. Приєднання кисню веде до значних змін. Атом заліза в оксигемоглобіну лежить практично в площині порфіринового кільця (відстань до площини становить 0,16 А ° в? - І 0,00 А ° в? - Субодиниця). Всі шість d-електронів спарені на трьох нижчих d-орбіталях, S = 0, оксигемоглобіну діамагнітен. У зеленій області спектра є дві характерні смуги поглинання: а (? Max 576 А °) і b (542 А °).
Рис.4. Основні характеристики молекули гемоглобіну в різних станах.
У феррігемоглобіне (метгемоглобін) при нейтральних значеннях рН місце кисню займає молекула води (при лужних значеннях рН? ОН), залізо знаходиться значно ближче до площини гему, ніж у дезоксігемоглобіне, всі п'ять d-електронів неспарени і займають п'ять d-орбіталей. S = 5/2 і магнітний момент дорівнює 5,91 БМ.
Структурні зміни в активному центрі (поблизу гема) і призводять до значних змін просторової структури усього білка. При оксигенації (перехід від Т-к R-формі) зсув окремих амінокислотних залишків досягає 7 А?. Як вже було сказано више, четвертинна структура гемоглобіну характеризується наявністю чотирьох поліпептидних ланцюгів, що утворюють дві (? - і два?-субодиниці). Більш детальні дослідження показали, що субодиниці утворюють??-Димер. Т ==> R - перехід супроводжується поворотом одного димеру щодо іншого на 12-15? і в остаточному підсумку приводить до збільшення кишень, в яких знаходяться геми. Ці структурні зміни ініціюються приєднанням перший молекули О2 до одного з вільних гемов і поширюються на всю глобул. Саме тому в рівноважної суміші завжди присутні тільки Т-і R-форми. Ці димер в Т-формі стягуються 14 додатковими (в порівнянні з R-формою) сольовими містками (водневі зв'язки між іонними або нейтральними групами аміноксілот, ван дер Ваальсових контакти). Крім того, між?-Субодиниця в Т-формі приєднується молекула діфосфогліцерата, що також призводить до звуження кишень. Ці зміни схематично представлені на рис.5.
Тригери для всіх описаних вище структурних перебудов при переходах між Т-і R-формами і назад служить приєднання або відщеплення кисню. Після локального елементарного хімічного акта: приєднання або відщеплення низькомолекулярного ліганда, окислення заліза при утворенні феррігемоглобіна (інакше кажучи, після появі зайвої позитивного заряду на залозі) - виникає істотно нерівноважної конформаційної стан - зміни поблизу активного центру вже відбулися, а вся величезна молекула білка залишилася в колишньому, ще не отрелаксіровавшем стані. Подальша релаксація може займати мікросекунди і навіть секунди. В ході цієї релаксації змінюються не тільки фізичні, а й хімічні властивості білка, зокрема швидкості подальших хімічних актів, якщо вони встигають відбутися до повного завершення релаксації. Таким чином, описана вище картина процесів, що супроводжують зворотне зв'язування кисню гемоглобіном, є лише першою, хоча і дуже важливим наближенням до істини. Так, наприклад, швидке відновлення заліза в феррігемоглобіне коротким (мікро-або наносекунди) імпульсом електронів призводить до виникнення нерівноважного стану, в якому залізо вже відновлено, але не відійшло від площини порфіринового кільця. За спектральним і магнітним характеристикам цей стан відповідає рівноважного оксигемоглобіну. Релаксація гема і його найближчого оточення з видаленням заліза від площини порфіринового кільця займає при кімнатній температурі десятки мікросекунд, а повна релаксація всієї білкової глобули до рівноважної Т-формі дезоксігемоглобіна - сотні мілісекунд.
Рис. 5. Структурна схема переходу гемоглобіну від Т-к R-формі
Інші реакції і функції гемоглобіну При взаємодії молекулярного кисню з гемоглобіном існує невелика, але кінцева вірогідність окислення останнього: молекула О2 не приєднається, але окислів заліза: Fe2 + + O2 ==> Fe3 + O2?. Тому при диханні в еритроцитах безперервно утворюється метгемоглобін. Для його відновлення в еритро
