Перелік ключових слів: сальмонельоз, перекисне окислення ліпідів, що циркулюють імунні комплекси, каталаза, молекули середньої маси, сироватковий альбумін, ендогенна інтоксикація.

Об'єкт дослідження: сироватка крові практично здорових людей та хворих на сальмонельоз р. Пензи.

Практичне застосування: в охороні здоров'я.

Список скорочень.

ПОЛ - перекисне окислення ліпідів;
ЦВК - циркулюючі імунні комплекси;
ЧСА - людський сироватковий альбумін;
МДА - малоновий диальдегид;
ПЕГ - поліетиленгліколь;
АОС - антиокислювальних здатність;
АТ - антитіло;
АГ - антиген;
ІК - імунний комплекс;
ЛПС - ліпополісахарідний комплекс;
МСМ - молекули середньої маси;
ТБК - тіобарбітуровая кислота;
ЕКА - ефективна концентрація альбуміну;
ОКА - загальна концентрація альбуміну;
Тху - трихлороцтової кислота;
ЦНС - центральна нервова система;
ц-АМФ - циклічний Аденозинмонофосфат;
АФК - активні форми кисню;
LOOH, HOOH - гідроперекисів;
СОД - супероксиддисмутаза.

Зміст.
Введення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..

1. Огляд літератури ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
1.1. Біохімічна характеристика інтоксикації при сальмонельозний інфекції ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ..
1.2. Молекулярні механізми розвитку ендогенної
інтоксикації при сальмонельозі ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ..
1.3. Показники рівня ендогенної інтоксикації
організму при сальмонельозі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....

2. Матеріали та методи дослідження ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....
2.1. Матеріали дослідження ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....
2.2. Методи дослідження ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

3. Результати та обговорення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ...
3.1. Визначення показників рівня інтоксикації в
 сироватці крові практично здорових людей ... ... ..
3.2. Визначення показників рівня інтоксикації в
сироватці крові хворих на сальмонельоз ... ... ... .... ... ..

Список використаних джерел ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ..

Висновки ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....

Програми ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....



Введення

Успіхи в боротьбі з інфекційними захворюваннями в нашій країні загальновизнана. Разом з тим у інфектології ще залишаються проблеми, що мають серйозний соціально-економічне значення для всіх країн світу. До їх числа відносяться гострі кишкові інфекційні захворювання [1].
Сальмонельоз - група гострих кишкових інфекційних хвороб, що викликаються бактеріями роду Salmonella, що характеризуються значним поліморфізмом клінічного перебігу, частих наявністю інтоксикації, лихоманки, ознак ураження шлунково-кишкового тракту [2].
Великі досягнення вітчизняних і зарубіжних дослідників, які встановили патогенетичне значення порушення біологічної регуляції при гострих кишкових інфекціях, дали новий імпульс у вивченні патогенезу сальмонельозу [3].
Імунна система являє собою складну багатокомпонентну систему з бистроделящіхся і покояться клітин. Вона є високочутливої до впливу токсинів бактерій. Це призводить до порушення імунорегуляторних процесів.
Найбільш інформативними є показники станів прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, що при посиленні дії на організм токсинів зміщується у бік активізації ПОЛ, рівня холестерину, ЦВК, Ит, МСМ.
ПОЛ - це фундаментальний універсальний молекулярний механізм, що лежить в основі стійкості та адаптаційних можливостей організму. У нормі ПОЛ забезпечує умова для життєво важливих функцій клітини, у випадку ж інтоксикації стає пусковим механізмом патобіохімічних змін в організмі людини.
Метою моєї дипломної роботи є вивчення біохімічних показників ендотоксикозу в динаміці патологічного процесу. У завдання дослідження входило:
1. Визначення вмісту МДА, рівня холестерину, ЦВК, Ит, ЧСЧ та активності каталази в групі контролю, яку склали практично здорові люди.
2. Визначення вмісту МДА, рівня холестерину, ЦВК, Ит, МСМ і активності каталази у хворих на сальмонельоз.
3. Дослідження зміни досліджуваних показників у хворих в залежності від ступеня тяжкості захворювання.

1.
Огляд літератури

1.1. Біохімічна характеристика інтоксикації при сальмонельозний інфекції

Сальмонельози належать до числа інфекційних захворювань, досить широко розповсюджених на всіх континентах світу. Збудником сальмонельозів є мікроорганізми, що належать до роду Salmonella, сімейства кишкових Enterobacteriaceae.
Сальмонели - це дрібні бактерії витягнутої форми з закругленими кінцями довжиною від 1 до 3 і діаметром 0,5-0,8 нм [4].
Сальмонельоз зустрічається частіше у мешканців міст, ніж сіл, що зв'язується з кращого реєстрацією захворюваності, наявністю множинних дитячих установ, широким вживанням харчових напівфабрикатів. Захворювання відзначається цілий рік, але Максимальна кількість реєструється в теплу пору року, що пояснюється сприятливими умовами розмноження сальмонел у харчових продуктах та реалізації інфекції [5].

Таблиця 1.1.1.
Статистичні дані хворих на сальмонельоз р. Пензи.
Рік
Кількість хворих
м. Пензи
На 100 тис. населення,%
Кількість хворих Пензенської
області
На 100 тис. населення,%
1996
187
34,9
362
23,1
1997
140
26,1
316
20,3
1998
230
43,0
448
28,8

У виникненні сальмонельозу провідну роль грають живі бактерії, загибель яких в організмі хворого супроводжується розвитком ендотоксінеміі. Прийнято виділяти два види токсичних продуктів життєдіяльності мікробів-екзотоксіі і ендотоксіі. До екзотоксину віднесені токсичні продукти життєдіяльності бактерій, що активно (за життя) секретуються у навколишнє середовище, а до ендотоксинами - ті отруйні для макроорганізму продукти життєдіяльності, які звільняються тільки при лізис мікробної клітини [6].
Крім токсину паличка має ряд антигенів клітинної стінки. О-антиген розташований на поверхні мікробної клітини і являє собою фосфоліпідного-полісахаридних комплекс, що включає 60% полісахариду, 20-30% ліпіду і 3-4,5% гексозаміна. Н-антиген визначається джгутиками. Поверхневі антигени клітинної стінки провокують тіпоспеціфіческій антитільний відповідь, а глибинні - видоспецифічні [6,7].
При сальмонельозі розвиток і тяжкість симптомів зумовлені інтоксикацією і зневоднюванням. На думку А.Ф. Білібіна інтоксикація - складне явище, яке зводиться до зміни нервнорефлекторной діяльності та гуморальної регуляції з обмінними зрушеннями. К.В. Бунін в основу синдрому інтоксикації ставить вплив токсину на:
1) падіння артеріального тиску, зниження скорочувальної здатності міокарда;
2) гормональну регуляцію водно-сольового обміну із змінами біосинтезу гормонів в корі надниркових залоз з пригніченням процесу їх метаболізму;
3) функцію нирок (зниження клубочкової фільтрації, підвищення канальцевої реабсорбції води, зниження концентрації очищення сечовини) [8].
Сальмонельозна інтоксикація виникає як результат патології первинної відповіді на інфекційний агент внаслідок значних втрат води і електролітів з блювотою і рідким стільцем. У міру збільшення дефіциту води і електролітів на перший план виступають симптоми обезводнення і ураження ЦНС. Якщо процес прогресує, зневоднення наростає, з'являються ознаки недостатності кровообігу, які при інтоксикації мають клініку шоку. Часта блювота і пронос - перші ознаки інтоксикації [9].
Обов'язковою умовою розвитку захворювання є наявність великої кількості збудників та їх токсинів, масове проникнення антигенів в кров. Найбільшою токсичністю відрізняється ліпід А, що викликає наступні основні реакції: активацію лейкоцитів і макрофагів, стимуляцію викиду ендогенного пирога, антогоніст глюкокортикоїдів, інтерферону, інтерлейкінів, пригнічення тканинного дихання, активацію системи комплементу, тромбоцитів, факторів згортання крові інші [10,11], [рис . 1.1.1].
Головною причиною розвитку шоку при сальмонельозі вважається не шкідлива дія самих мікробів чи їх токсинів, а своєрідна відповідь організму на них. Під токсико-інфекційних шоком слід розуміти екстремальне стан організму, що виникає в результаті дії токсичних субстанцій збудників, патогенних імунних комплексів на органи і тканини організму, що супроводжується гострим порушенням метаболізму в них [12].

Схематичне зображення ліпополісахаридів
стінок мікробів.
























Рис. 1.1.1.

С.А. Степанов за допомогою аспіраційної біопсії виявив у тонкій кишці хворих на сальмонельоз зміна епітелію, гостре запалення слизової оболонки, порушення мікроциркуляції і судинної проникності. К.Х. Ходжаєв в експерименті на щурах показав, що сальмонельозна інфекція викликає порушення процесів тканинного дихання і фосфорилювання. Стан підшлункової залози вивчено Білянської Т.А. У гострий період хвороби відзначено зниження ферментативної активності панкреатичного соку - рівень трипсину був знижений у 71% випадків, ліпази в 55%, амілази - в 66%.
Таким чином ендотоксин викликає активацію синтезу, переважно протеолітичних ферментів, затримку екструзії секретується проензімов, що призводить до секреції і надходження ферментів у лімфатичне і кровоносне русло [13,14].
При сальмонельозі розвивається зневоднення, обумовлений втратою позаклітинної рідини, а при тяжкому перебігу захворювання і частини клітинної. Дегідратація в більшості випадків має ізотонічний характер, поєднуючись з розвитком згущення крові, дефіцитом електролітів, метаболічним ацидозом в капілярної і венозної крові [15], [рис. 1.1.2].

1.2. Молекулярні механізми розвитку ендогенної
інтоксикації при сальмонельозі

Явища інтоксикації викликають захворювання, що супроводжуються підвищеним розпадом тканин, посиленими процесами катаболізму, недостатністю функції печінки та нирок, зниженням процесів мікроциркуляції [16].
У відповідь на дію первинного патогена, яким є ендотоксини, сальмонел, в організмі розвиваються типові каскадні реакції, що лежить в основі сучасної концепції СЕІ.
На Міжнародному симпозіумі в Санкт-Петербурзі (1994 р) було дано визначення цього синдрому як клінічного синдрому з проявом симптомів інтоксикації при патологічних станах неоднорідних по етіології і обумовлюють накопичення в тканинах і біологічних рідинах організму продуктів патологічного обміну речовин, метаболітів, деструкції клітинних і тканинних структур , руйнування білкових молекул [17,18].

Шано В.П. зі співавторами підкреслює, що токсичний вплив ліпополісахарідной субстанції ендотоксин проявляється комплексом порушень, обумовлених пошкодженням як циркулюючих клітин в крові, так і ендотеліоцитів, еозинофілів, нейтрофілів, макрофагів, наслідком чого є викид в кровотік ряду біологічно активних речовин - цитокінів, інтерлейкінів. Головною точкою докладання ендотоксин є ендотеліальні клітини, активація їх приводить до вивільнення простацикліну, виділенню еластази, токсичних метаболітів кисню, факторів активації тромбоцитів і комплементу з вивільненням термінального комплексу комплементу, брадикініну з подальшим формуванням синдрому підвищеної проникності капілярів. Це призводить до того, що у вогнище запалення починають входити компоненти крові, перш за все фібриноген і тромбоцити. Фібрин сприяє агрегації тромбоцитів, полімеризації фібрину і - виникнення тромбів. Наслідком тромбозу є порушення мікроциркуляції з наступною гіпоксією, що призводить до подальших пошкоджень клітин у вогнищі запалення. Метаболічним результатом цього є зміна аеробного метаболізму клітин на анаеробний, підвищений продукування лактату і протонів, зниження показників рН [19].
Серед тканинних (клітинних) медіаторів запалення важливе місце займають простагландини. Вихідними продуктами для біосинтезу простагландинів є ненасичені жирні кислоти: лінолева, арахідонова, пентаноевая. Найбільше значення має в організмі арахідонова кислота, яка міститься в фосфоліпідах клітинних мембран.
Простагландини викликають сильне діуретичну і натрійуретичну дію, надають різноманітну дію на шлунково-кишковий тракт. Вони можуть стимулювати і гальмувати скорочення і секреторну активність тонкої кишки, гальмують секрецію соляної кислоти слизової оболонки шлунка. Простагландини викликають секрецію води та електролітів у просвіт кишки, викликаючи діарею, підвищують концентрацію ц-АМФ в слизовій оболонці тонкої кишки, впливають на міцність і пружність еритроцитарної мембрани [20, 21, 22, 49].

1.3. Показники рівня ендогенної інтоксикації
організму при сальмонельозі

Аналізуючи дані літератури за останні десятиліття, можна сказати, що основними показниками інтоксикації при сальмонельозі є ПОЛ, рівня холестерину, ЦВК, ІТ, МСМ і активність каталази. При розвитку інтоксикації на фоні сальмонельозу відбувається активний хемотаксис нейтрофіллов у вогнище запалення, де вони поглинаючи і переварюючи чужорідний агент, змінюють свою метаболічної активності, що характеризується посиленням поглинання кисню, підвищеною утилізацією глюкози і гіперпродукцією АФК () [23, 24].
Перекисне окислення є універсальним механізмом взаємодії кисню з багатьма органічними субстратами, у тому числі з ліпідами. Впровадження кисню в молекули окисленого субстрату призводить до утворення реакційно-здатних проміжних продуктів - вільних радикалів, гідроперекисів, які в подальшому викликають пошкодження інших класів сполук - білків, нуклеїнових кислот, вуглеводів (мал. 1.3.1).
       

Метаболізм супероксидних радикала в нормі
і при патології (Владимиров Ю.Я., 1998)


  












Рис. 1.3.1.

Накопичені до цього часу дані літератури дозволяють зробити висновок про те, що вільнорадикальне окислення ліпідів при сальмонельозний інфекції відіграє певну патогенетичну роль [25, 50].
Встановлено, що при розвитку ПОЛ в біомембранами знижується вміст легкоокислюваних поліненасичених жирних кислот і змінюються фізико-хімічні властивості: мікровязкость, плинність, мембранний потенціал, полярність внутрішніх областей мембран. Таким чином, змінюються транспортні властивості мембрани і активність ферментів [26].
Регулювання вільнорадикального окислення забезпечується в клітці системою антиоксидантного захисту. Так, що накопичується в процесі ПОЛ перекис водню знешкоджується за допомогою каталази, яка присутня у всіх тканинах організму. Каталаза (КФ 1.11.1.6.) Являє собою гемсодержащій фермент з молекулярною масою близько 250000 Д, локалізований в Пероксисома клітин [27].
Мітохондріальна каталаза бере участь у оксидазної шляху окислення, що супроводжується запасання енергії у вигляді АТФ. Блокування транспорту електронів в дихальної ланцюга призводить до стимуляції пероксісомального окислення. При потологіях, пов'язаних з порушенням енергетичних процесів, каталаза пероксисом може виходити з них і брати участь в окисленні на мембранах ЕПР [28, 53].
У роботі Л.Б. Оконенко зі співавторами про стан антиоксидантної системи судили за активністю СОД, глутатіонпероксидази і каталази, аналіз даних виявив дефіцит антиоксидантів [29, 30].
При інфекційному токсикозі в мембранах еритроцитів різко знижується вміст загальних фосфоліпідів, але збільшується кількість НЕЖК і лізофосфотіділхоліна, що побічно вказує на підвищення активності фосфолілаз, які вибірково руйнують ліпіди мембран. Холестерин піддається як активного, так і пасивного обміну в мембранах еритроцитів [29]. Фермент лецітінхолестеролаціл трансфераза перетворює ефіри холестерину в вільний холестерин і тим самим регулює рівень вільного холестерину в плазмі, що сприяє проникненню його в мембрани. Отже, інактивація цього ферменту в результаті гіпоксії при е.?? дотоксікозе веде до підвищення рівня ефірів холестерину в мембранах еритроцитів [31,32].
Поряд з рівнем МДА, активності каталази та рівня холестерину для діагностики захворювання та його прогнозу мають значення й інші неспецифічні показники - ЦВК, Ит, МСМ.
Синтезується при формуванні імунітету специфічні антитіла мають здатність взаємодіяти з антигенами збудників і тим самим викликати нейтралізацію патогенних мікробів та їх токсинів. Ця реакція супроводжується утворенням імунних комплексів антиген - антитіло [33, 34, 54, 55]. При патологічних станах освіта ІК виходить з під контролю, в результаті чого розвивається та чи інша хвороба ІК [рис. 1.3.2.].
       
Патогенетичні механізми хвороб імунних
комплексів (Сура В.В., 1987)

Рис. 1.3.2.

В результаті розвитку ендотоксемії при сальмонельозі організм тривалий час контактує з надлишком АГ як екзогенного (компоненти мікробних клітин), так і ендогенного (компоненти зруйнованих клітин самого організму) походження. Разом з тим спостерігається пригнічення системи комплементу, відповідального за лізис мікробних клітин. У цих умовах значного надлишку АГ і недостатності вироблення АТ може призвести до утворення ІК, які здатні відкладатися в певних тканинах і викликати гострі запальні реакції. При значних відкладеннях спостерігаються функціональні та морфологічні ушкодження органів і тканин [35].
Зв'язуючись з клітинною мембраною ЦВК викликають виділення в навколишнє середовище протеолітичних ферментів і основних пептидів. Ці речовини ушкоджують протеоглікановие компоненти тканин, діють на базальну мембрану і викликають некроз ендотеліальних клітин [36].
ЦВК разом з продуктами ПОЛ викликають порушення проникності мембран, аж до їх розриву, що в остаточному підсумку може призвести до загибелі клітини. У результаті з'являються різні речовини пентідной природи. З них найбільший інтерес представляють молекули середньої маси.
Будучи олігопептиди з молекулярною масою 300-5000 Дальтон, вони розцінюються як універсальний критерій ендогенної інтоксикації і впливають на її рівень і прогноз [37, 38].
МСМ утворюються в організмі під впливом ушкоджують ендогенних або екзогенних чинників різного генезу, є проміжними продуктами протеолізу. [39, 57].
Пильна увага дослідників до МСМ пояснюється високою біологічною активністю їх окремих фракцій, які інгібують гліколіз, глюконеогенез, пентозний цикл, синтез гемоглабіна, нуклеїнових кислот, мембранний транспорт, дагоцітов, еритропоез, мікроциркуляцію, володіють імунодепресивною, цитотоксическим, нейро-та психотропних властивостями. Зараз, кваліфікаційна оцінка ступеня тяжкості стану хворих при сальмонельозі немислима без визначення МСМ [40].
Встановлено, що значна частина що циркулюють у крові СМ не тільки розчинена в плазмі крові, а й пов'язана з альбуміном.
Людський сироватковий альбулін (ЧСА) - найважливіший транспортний білок, який здійснює перенесення ендогенних метаболітів і ксенобіотиків в плазмі крові, міжклітинної рідини, в лімфі.
Універсальність транспортної функції ЧСА забезпечується його унікальною здатністю зв'язувати ліганди різної хімічної природи. Інтенсивна лігандная навантаження молекул альбуліна призводить до зміни їх структури і що зв'язує здібності. Такі модифікаційних форми ЧСА виявляються при патології [41].
Про величину токсичної дії шкідливих речовин можна судити з ЕКА, яка знижується після того, як токсичні речовини займуть центри зв'язування у молекулі альбуліна, що призводить до зниження детоксикаційних властивостей організму. Вивчення властивостей альбуліна є важливим з точки зору як діагностики, так і лікування [42].



2.
Матеріали та методи досліджень

2.1. Матеріал досліджень

Рівень інтоксикації оцінювався по змінах в крові хворих ефективної і загальної концентрацій сироваткового альбуліна, малонового діальдегіду, як одного з продуктів ПОЛ, рівня холестерину, ЦВК, МСМ і активності каталази.
Для всіх досліджень бралася сироватка крові. Досліджено 30 хворих на сальмонельоз у віці від 17 до 46 років. Для контролю набиралася група 51 людини різної статі у віці від 20 до 46 років.
Кров бралася з ліктьової вени, переважно натщесерце в кількості не менше 5 мл. Центріфугіруем 1500 об/хв 10 хвилин. Для виконання аналізів сироватки необхідно використовувати відразу або заморозити та зберігати при t =- 20С.

2.2. Методи досліджень

2.2.1. Визначення МДА з тіобарбітуровой кислотою
 (Конюхова В.С., 1989)

Про зміну інтенсивності ПОЛ судили по зміні рівня вторинного продукту ПОЛ - малонового діальдегіду.
Метод заснований на тому, що при високій температурі в кислому середовищі МДА реагує з 2-ТБК, утворюючи забарвлений рожевий тріметіновий комплекс з максимумом поглинання при 535 ім.
Хід роботи: До 0,2 мл сироватки крові додати 0,2 мл дистильованої води, 1 мл 0,6% ТБК у крижаній оцтової кислоти. Кип'ятити 30 хвилин, охолодити і додати 1 мл 5 № КОН і 2 мл ізопропанол. Центріфугіруют при 6000 об/хв 20 хвилин. Колоріметріруют при 535 нм і 580 нм проти контролю, що містить замість плазми воду.
Розрахунок: (мкМоль/л), де Е - оптичне поглинання ізопропіловий екстракту; 106 - коефіцієнт перерахунку оптичної щільності.
Приклад розрахунку: хворий Максимов С., 19 років

концентрація МДА = (мкМоль/л).
     
2.2.2. Визначення активності каталази
(Королюк М.А., 1988)
     
Метод заснований на здатності перекису водню утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс.
Хід визначення: Реакція запускається додаванням 0,1 мл сироватки крові до 2 мл 0,03% розчину перекису водню. У холосту пробу замість сироватки вносять 0,1 мл дистильованої води. Реакцію зупиняють через 10 хвилин додаванням 1 мл 4% молібдати амонію. Інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 410 нм проти контрольної проби, в якій замість перекису водню вносять 2 мл води.
Розрахунок: (мкат/л), де
Е - активність каталази в мкат/л;
А - оптична щільність холостий і досвідченою проб;
V - обсяг вноситься проби, 0,1 мл;
t - час інкубації, 600 сек;
К - коефіцієнт міллімолярной екстинкції перекису водню, рівний.
За одиницю активності каталази приймають ту кількість ферменту, який бере участь у перетворенні 1 мкат перекису водню за 1 секунду при заданих умовах. Розрахунок активності каталази ведуть на 1 л сироватки крові.
Приклад розрахунку: хворий Крайнов Т.В., 31 рік.
2.2.3. Визначення загального холестерину в сироватці крові ферментативним методом «Фотокол»
(Творогова М.Г., 1995)

Визначення засноване на сполучених реакції, що каталізує холестерінестераза, холесеріноксідаза і пероксидаза:
Ефіри холестерину холестерин + Ж.К.;
Холестерин + О2 холестінон + Н2О2;
Н2О2 + хромоген Н2О + забарвлений продукт.

Концентрація що утворюється в ході реакції пофарбованого продукту пропорційна концентрації холестерину в пробі.
Хід визначення: Робочий реагент обов'язково вносити в пробірки після проб, які містять холестерин. Пробірки струсити і інкубувати при t = 37oС. Через 10 хвилин після початку інкубації пробірки повторно струсити і інкубувати 20 хвилин при t = 37oС. Пофарбований проби фотометріровать при 500 нм в кюветі з довжиною оптичного шляху 5 мм або 10 мм щодо холостий проби. Забарвлення стабільна протягом двох годин при кімнатній температурі.
Концентрацію холестерину в досліджуваних пробах розрахувати за формулою:
 ммоль/л, де
ЕОП і ЄК - оптичні щільності досліджуваної проби та проби з калібратором.
Норма: 3,62 - 5,2 ммоль/л.


2.2.4. Визначення циркулюючих імунних комплексів
в крові методом ПЕГ-тесту (Гриневич Ю.А., 1988)

Метод заснований на селективної преципітації комплексів АТ-АГ в 3,75% ПЕГ (поліетиленгліколю) з наступним визначенням щільності преципітату.
Реактиви:
1) 0,1 м боратний буфер (3,410 г борної кислоти, 4,275 г бури розчинити в 1 л дистильованої води)
2) 10 г поліетиленгліколь - 6000 од. розчинити в 240 мл буфера.
Хід визначення: До 0,3 мл сироватки крові додати 0,6 мл реактиву № 1, перемішати і перенести по 0,3 мл в 2 пробірки. У I додати 2,7 мл розчину № 1 (контроль). В II додати 2,7 мл розчину № 2 (досвід). Перемішати, інкубувати протягом 60 хвилин при кімнатній температурі. На спектрофотометрі (КФК-3) визначають оптичну густину в кюветах при 450 нм.
Розрахунок: Вираховують різниця показників оптичної щільності, результат множать на 1000 і отримують кількість ІК в 100 мл сироватки. Відповідь виражають в одиницях оптичної щільності. - Кількість ЦВК у 100 мл сироватки.
Норма: 54,24 + 2,03 ум. од.
Приклад розрахунку: хворий Максимов С.І., 19 років.

Кількість ЦВК у 100 мл сироватки:

2.2.5. Визначення рівня МСМ в крові (Габріеле М.І., 1984)

Метод заснований на осадженні білків з досліджуваної рідини 10% розчином Тху з подальшому центрифугуванням та визначенням абсорбції світла супернатантом в 10 разів розведеним дистильованою водою.
Хід роботи: Сироватку крові обробляють 10% розчином Тху. В якості контролю краще використовувати сам розчин Тху в 30 разів розведений дистильованою водою. Оптична щільність його проти води складає 0,123? 0,012 усл. од. на хвилі 254 нм при 23-25С. Центріфігіруем 3000 об/хв протягом 30 хвилин. До 0,5 мл надосадову рідини 4,5 мл дистильованої води. Вимірювання проводимо на спектрофотометрі в УФ світлі при 280 нм для визначення ароматичних амінокислот і при довжині хвилі 254 нм для визначення нуклеотидів. Рівень МСМ виражають в одиницях, кількісно рівних показникам екстінціі.

2.2.6. Визначення показників «ефективна концентрація
альбуміну »і« загальна концентрація альбуміну »в сироватці крові людини флуоресцентним методом
(Міллер Ю.І., 1994).

Принцип методу:
Метод заснований на специфічному взаємодії флуоресцентних органічних сполук з альбуміном в сироватці крові. Залежно від умов цієї взаємодії інтенсивність флуоресценції барвника з альбуміну відображає різні властивості білка. Індекс ЕКА/ОКА не залежить від кількості молекул альбуміну в пробі і характеризує фізико-хімічні властивості молекули альбуміну.
Склад набору:
Реактив I (4 ампули по 5 мл). Призначений для приготування розчину використовується при розведенні сироватки крові. Він містить антикоагулянт ЕДТА.
Реактив II (4 ампули по 0,7 мл). Основним компонентом є спеціальне флуоресціюючі з'єднання, інтенсивність флуоресценції якого в сироватці крові пропорційна концентрації сироваткового альбуміну.
Реактив III (4 ампули по 0,7 мл). Взаємодія реактивів № 2 та № 3 з сироваткою дозволяє визначити ОКА.
Визначення показника ЕКА:
До 2,0 мл надосадову рідини додати 0,025 мл реактиву 2. Перемішати. Виміряти інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420 нм і довжині хвилі випускання 515 нм.
Визначення показника ОКА:
У ту ж пробу додати 0,025 мл реактиву 3. Перемішати. Виміряти інтенсивність флуоресценції. Нормальні величини показника ЕКА лежать в інтервалі нормальних значень ОКА від 40 г/л - 55 г/л.
Підготовка зразків крові до вимірів:
Буферний розчин: Вміст ампули з реактивом 1 перенести в 100 мл дистильованої води. Перемішати. 0,025 мл сироватки крові додати в пробірку, що містить 5 мл розчину для розведення крові. Беруть Для аналізу рідина 2,0 мл отриманого зразка.
Використовують спеціалізованого аналізатора АКЛ-0, 1.

3. Результати дослідження та їх обговорення

3.1. Визначення показників рівня інтоксикації в сироватці крові практично здорових людей

Нами було проведено дослідження біохімічних показників - МДА, активність каталази, рівень холестерину, ЦВК, МСМ, Ит в сироватці крові 51 донора у віці від 20 до 46 років. Сироватка крові донорів була отримана на ОСПК (обласна станція переливання крові) м. Пензи.
Отримані результати біохімічних аналізів були піддані статистичній обробці, згідно методам і прийомам статистичного аналізу.
За даними комітету експертів Міжнародної федерації клінічної хімії за референтним величин рекомендується верхня і нижня межі норми на рівні М? 1,96?, Стан передхвороби М? 2?, Стан гострої форми М? 3?.
Про рівень процесів ПОЛ судили за концентрацією вторинного продукту МДА. Зміст кількості МДА становить 3,61? 0,07 мкМоль/л. Це значення близьке до даних, знайденим в літературі (табл. 3.1.1). У 48 чоловік значення вмісту МДА входить в межі М? 1,96?. У 3 осіб (5%) вміст МДА відповідає значенню М? 2?, Що відповідає стану передхвороби.
Активність каталази у практично здорових людей склала 16,7? 0,15 мкат/л (табл. 3.1.1). При дослідженні активності каталази в групі донорів відхилень за межі М? 1,96? ми не спостерігали.
Рівень холестерину, який визначається нами у практично здорових людей склав 4,45? 0,68 ммоль/л (табл. 3.3.1.), Показники вклалися в кордон референтної величини М? 1,96?.
Зміст ЦВК, яке визначається нами в сироватці крові практично здорових людей склало 52,62? 3,52 ум. од. (табл. 3.1.1). 94% людей за показниками ЦВК входить в межі норми, а 6% перебувають у стані передхвороби.
Рівень МСМ у обстежених донорів в середньому склав 0,280? 0,01 ум. од. Це значення близьке до даних, знайденим в літературі (табл. 3.1.1). При дослідженні МСМ відхилень за межі М? 1,96? ми не спостерігаємо.
У практично здорових людей визначено детоксикационная навантаження сироваткового альбуміну, тобто визначення загальної і ефективної концентрації альбуміну. Токсичність по альбумін становить 0,13? 0,01 ум. од. (табл. 3.1.1). Всі значення токсичності по альбумін увійшли в межі М? 1,96?.
Отримані нами дані не мали суттєвих відмінностей від значень цих показників, що є в літературі у порівнянні з додатком 2.

Таблиця 3.1.1.

Зміст біохімічних показників у сироватці крові практично здорових людей

Група
обстежених
n
МДА
мкМоль/л
Активність
каталази
мкат/л
ЦВК
ум. од.
МСМ
ум. од.
Ит
ум. од.
Холестерин
ммоль/л
Практично
здорові
51
3,61? 0,07
16,7? 0,15
52,62? 3,52
0,28? 0,01
0,13? 0,01
4,45? 0,68

3.2. Визначення показників рівня інтоксикації
в сироватці крові хворих на сальмонельоз

Сироватка крові хворих досліджувалася на базі центру Держсанепіднагляду р. Пензи. Дослідження біохімічних показників велися в гостру фазу захворювання і в період ранньої реконвалесценції. Обстежено нами 30 хворих на сальмонельоз у віці від 17 до 46 років, з метою встановлення показників, що характеризують ендотоксикозу: перекисне окислення ліпідів, рівень холестерину, Ит з сироваткового альбуміну, циркулюючих імунних комплексів, молекул середньої маси та активності каталази. Причому біохімічні показники крові в розпал захворювання відрізнялися від показників у період ранньої реконвалесценції.

Таблиця 3.2.1.
Біохімічні показники сироватки крові
у хворих на сальмонельоз

Група
обстежених
МДА
мкМоль/л
Активність
каталази
мКат/л
Ит
ум. од.
ЦВК
ум. од.
МСМ
ум. од.
Холестерин ммоль/л
Контроль, n = 51 (практично
здорові)
3,61? 0,07
16,7? 0,15
0,13? 0,01
52,62? 3,52
0.280? 0,01
4,45? 0,68
Хворі (гострий період) n = 30
7,19? 0,2
13,09? 0.16
0,29? 0,01
100,63? 4,04
0,550? 0,02
6,54? 0,07
Хворі (рання
реконвалесценція) n = 30
3,87? 0,15
15,84? 0,19
0,15? 0,01
68,9? 2,8
0,310? 0,02
4,65? 0,7

р? 0,001
р? 0,01
р? 0,001
р? 0,001
р? 0,05
р? 0,01

Так, в ході дослідження виявлено достовірне збільшення кількості МДА в сироватці крові хворих на сальмонельоз на 99% по відношенню до контролю, тобто зростає в 2 рази. Дані наших досліджень підтверджуються відомостями Л.Б. Оконенко, Л.Д. Мартиненко та іншими. За даними цих авторів концентрація МДА при сальмонельозі зростає в 2-2,5 рази.
Як видно з таблиці (табл. 3.2.1), у хворих спостерігається інтенсифікація ПОЛ.
Під впливом сальмонельозна токсину відбувається порушення ліпідного бішару клітинних і субклітинних мембран. Накопичення в крові первинних і вторинних продуктів ПОЛ йде не в силу кількісних змін у змісті фосфоліпідів плазми крові, а внаслідок інтенсифікації їх вільнорадикального окислення. Результатом ініціації ПОЛ стає освіта критичних концентрацій продуктов ПОЛ, які токсичні для організму. Відомо, що підвищення ПОЛ може призводити до порушення проникності мембран з наступною інактивацією мембранно-асоційованих ферментних систем, виходом лізосомальних гідролаз в цитозолі, що викликає пошкодження ДНК т інші істотні зміни в структурі і функціональному стані клітини [29, 43, 51, 52].
Встановлено, що при ряді інфекційних захворювань розвивається антиоксидантна недостатність. Одночасно знижується актином ферментів антиоксидантного захисту, зокрема каталази [44].
За нашими спостереженнями, активність каталази знизилася на 22% в гострий період захворювання по відношенню до контролю. У період ранньої реконвалесценції показник активності каталази наближається до контролю (табл. 3.2.1).
Л.Б. Оконенко, Л.І. Волкова у своїх роботах зазначає пригнічення каталазной активності. У гострий період захворювання відбувається різке скорочення антиоксидантної забезпеченості організму [26, 29].
А.С. Волков вказує на те, що в процесі ендотоксікаціі метаболічні розлади призводять до гіперліпідемії. Це підтверджується даними наших спостережень. Так, рівень холестерину в сироватці крові хворих на сальмонельоз в середньому склав 6,54? 0,07 ммоль/л, що на 46,9% більше контролю (табл. 3.2.1).
Таким чином, гіперхолестеринемія характеризує патологію обміну ліпідів та ліпопротеїдів [32,45].
У період ранньої реконвалесуценціі рівень холестерину наближається до контролю [рис. 3.2.1].

Процентне співвідношення показників ліпідного обміну при ендотоксикозу, викликаному сальмонельозний інфекцією

Рис. 3.2.1.

Аналізуючи результати проведених досліджень, ми встановили, що утримання ЦВК в плазмі крові хворих на сальмонельоз на 91% більше, ніж у контролі [рис. 3.2.2]. Отримані дані узгоджуються з висновками дослідження І.А. Іллінського, Т.В. Лукинський та інших. Підвищений вміст ЦВК говорить про зниження антитілоутворення в присутності надлишку антигенів. У подібній ситуації ЦВК індукує імунне гостре запалення, що супроводжується пошкодженням ендотелію судин і ниркових клубочків, активацією кінінової системи, що веде до більш серйозних метаболічних порушень [46, 47, 48].
Як правило, підвищення рівня ЦВК виявляється вже в початковий період хвороби, на цьому ж рівні зміст їх залишається і в гостру фазу. Тільки в стадії реконвалесценції спостерігається зниження показників [табл. 3.2.1].

Процентне співвідношення показників ендотоксикозу (ЦВК, МСМ) у сироватці хворих щодо контролю

Рис. 3.2.2.

При запаленні вплив протеїназ на протеоглікановие комплекси тканин призводить до утворення пулу токсичних речовин з середньомолекулярні масою (МСМ).
У обстежених нами хворих на сальмонельоз рівень МСМ на 96% вище в порівнянні з контролем (рис. 3.2.2). За нашими даними вміст МСМ при сальмонельозі підвищилася в 1,9 рази, що узгоджується з даними досліджень Б.С. Нагаєва і М.І. Габріловіча. В наших дослідженнях рівень МСМ підвищується в розпал захворювання [т