Чи можна вважати віруси живими? Чи є віруси живими?
Відповідно до Львову, "організм - якась незалежна одиниця інтегрованих і взаємозалежних структур і функцій". У найпростіших, тобто в одноклітинних саме клітина є незалежною одиницею, іншими словами, організмом. І клітинні організми - мітохондрії, хромосоми і хлоропласти - це не організми, бо вони не є незалежними. Виходить, що якщо йти за визначенням, даним Львовим, віруси не є організмами, тому що не володіють незалежністю: для вирощування та реплікації генетичного матеріалу потрібна жива клітина.
У той же час, у багатоклітинних видів незалежно від того, чи тварини, рослини, окремі лінії клітин не можуть еволюціонувати незалежно один від одного, отже, їх клітини не є організмами. Для того, щоб зміна була еволюційно значущим, воно повинно бути передано новому поколінню індивідуумів. Згідно з цим міркуванням організм являє собою елементарну одиницю деякого безперервного ряду зі своєю індивідуальною еволюційної історією
Вірус знаходить відносно незалежну еволюційну історію завдяки його здатності до адаптації у напрямку, який веде до придбання ним здатності передаватися від господаря до господаря. Він може пережити клітку або організм, в яких паразитує; фактично вірус часто "експлуатує" клітку. Один вірус може зустрічатися в різних видах, родах і типах і також один і той же вірус може передаватися від рослин комах і розмножуватися в клітинах тих і інших. Вірус, що володіє відповідною пристосовністю, може використовувати різноманітні еволюційні ніші. Таким чином, вірус, звичайно, має більшу незалежність, ніж будь-яка клітинна органела. Тобто, в еволюційному плані вірус більшою мірою організм, ніж хромосома або навіть клітина багатоклітинного тварини, хоча функціонально він значно менш незалежний, ніж будь-яка така клітина.
І в той же час, можна розглядати дану проблему з точки зору іншого визначення: матеріал є живим якщо, будучи ізольованим, він зберігає свою специфічну конфігурацію так, що ця конфігурація може бути реінтегрувати, тобто знову включена в цикл, в якому бере участь генетичне речовина: це ототожнює життя з наявністю незалежного специфічного саморепліцірующегося способу організації. Специфічна послідовність підстав нуклеїнової кислоти того чи іншого гена може копіюватися; ген - це певна частина запасів інформацією, якою володіє живий організм. В якості тесту на живе дане вище визначення пропонує відтворення в різних клітинних лініях і в ряді покоління організмів. Вірус, відповідно до цього тесту, живий точно так само, як і будь-який інший фрагмент генетичного матеріалу, що його можна витягнути з клітки, знову ввести в живу клітину і що при цьому він буде копіюватися в ній і стане хоча б на деякий час частина її спадкового апарату. При цьому передача вірусного генома становить основний сенс існування цих форм - результат їх спеціалізації в процесі відбору. Тому спеціалізовані вірусів як переносників нуклеїнових кислот дає можливість вважати віруси "більш живими", ніж будь-які фрагменти генетичного матеріалу, і "більш організмами", ніж будь-які клітинні органели, включаючи хромосоми і гени.
Строгі постулати Коха
Які ж ті основні положення, сформульовані Робертом Кохом (1843-1910), яких повинен дотримуватися мікробіолог при кожному виявленні невідомого збудника? Що може бути доказом, що саме він є причиною даного інфекційного захворювання? Ось ці три критерії:
Неодноразове отримання чистої культури збудника, взятого з організму хворого.
Виникнення точно такого ж чи схожого захворювання (як за характером течії, так і за що викликається ним патологічних змін) при інфікуванні здорового організму культурою передбачуваного збудника.
Поява в організмі людини або тварини після їх зараження даним збудником завжди одних і тих самих специфічних захисних речовин. При контакті імунної сироватки крові з збудником з культури останній повинен втрачати свої патогенні властивості.
Для сучасної вірусології характерно бурхливий розвиток і широке застосування різних методик - як біологічних (включаючи генетичні), так і фізико-хімічних .. Вони використовуються при встановленні нових, досі ще невідомих вірусів, і при вивченні біологічних властивостей і будови вже виявлених видів.
Фундаментальні теоретичні дослідження дають зазвичай важливі відомості, які використовуються в медицині, в області діагностики або при глибокому аналізі процесів вірусної інфекції. Введення нових дієвих методів вірусології пов'язано, як правило, з видатними відкриттями.
Так наприклад, метод вирощування вірусів у розвивається курячому ембріоні, вперше застосований А. М. Вудрофом і Е. Дж. Гудпесчуром в 1931 році, був з винятковим успіхом використаний при вивченні вірусу грипу.
Прогрес фізико-хімічних методів, зокрема методу центрифугування, привів в 1935 році до можливості крісталмуаціі вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) з соку хворих рослин, а згодом й до встановлення входять до його складу білків. Цим було дано перший поштовх до вивчення будови і біохімії вірусів.
У 1939 році А. В. Арден і Г. Руська вперше застосували для вивчення вірусів електронний мікроскоп. Введення цього апарату в практику означало історичний перелом у вірусологічних дослідженнях, оскільки з'явилася можливість побачити - хоча в ті роки ще й не досить чітко - окремі частинки вірусу, віріони.
У 1941 році Г. Херст встановив, що вірус грипу за певних умов викликає аглютинацію (склеювання і випадання в осад) червоних кров'яних тілець (еритроцитів). Цим було покладено основа для вивчення взаємин між поверхневими структурами вірусу і еритроцитів, а також для розробки одного з найбільш ефективних методів діагностики.
Корінний перелом і вірусологічних дослідженнях стався в 1949 р., коли Дж. Ендерс, Т. Уеллер і Ф. Роббінс вдалося розмножити вірус поліомієліту в клітинах шкіри і м'язів людського зародка. Вони домоглися розростання шматочків тканини на штучної живильному середовищі. Клітинні (тканинні) культури були інфіковані вірусом поліомієліту, який до цього вивчали виключно на мавпах і лише дуже рідко на особливому виді щурів.
Вірус у людських клітинах, вирощених поза материнського організму, добре множився і викликав характерні патологічні зміни. Метод культури клітин (тривале збереження і вирощування в штучних поживних середовищах клітин, виділених з організму людини і тварин) був згодом вдосконалений і спрощено багатьма дослідниками і став, нарешті, одним з найбільш важливих і результативних для культивування вірусів. Завдяки цьому більш доступного і дешевого методу з'явилася можливість отримувати віруси у відносно чистому вигляді, чого не можна було досягти в суспензіях з органів загиблих тварин. Введення нового методу означало безсумнівний прогрес не беруть участі в роботі вірусних захворювань, але й в отриманні прищепних вакцин. Він дав також непогані результати і в біологічних і біохімічних дослідженнях вірусів.
У 1956 році вдалося показати, що носієм інфекційності вірусу є що міститься в ньому нуклеїнова кислота. А в 1957 році А. Айзекс і Дж. Ліндеман відкрили інтерферон, який дозволив пояснити багато біологічні явища, що спостерігаються в стосунках між вірусом і клітиною - господарем або організмом - господарем.
С. Бреннер і Д. Хорн ввели в техніку електронної мікроскопії метод негативного контрастного фарбування, що зробив можливим вивчення тонкої будови вірусів, зокрема їх структурних елементів (субодиниць).
У 1964 році вже згадуваний нами раніше американський вірусолог Гайдузек з співробітниками довів інфекційний характер низки хронічних захворювань центральної нервової системи людини і тварин. Він вивчав нещодавно виявлені своєрідні віруси, лише в деяких рисах схожі з раніше відомими.
У той же час американський генетик Барух Бламберг виявляє (у процесі генетичних досліджень білків крові) антиген сироваткового гепатиту (австралійський антиген), речовина, що ідентифікується за допомогою серологічних тестів. Цьому антигену призначено було зіграти велику роль у вірусологічних дослідженнях гепатиту.
В останні роки одним з найбільших успіхів вірусології можна вважати розкриття деяких молекулярно-біологічних механізмів перетворення нормальних клітин у пухлинні. Не менших успіхів було досягнуто і в галузі вивчення будови вірусів і їх генетики.
Інфекційна одиниця
Найменша кількість вірусу, здатний в даному досвіді викликати інфекцію, називається інфекційної одиницею.
Для її визначення застосовуються зазвичай два методи. Перший заснований на визначенні 50%-ної летальної дози, що позначається LD 50 (від лат. Letatis - смертельна, dosis - доза). Другий метод встановлює кількість інфекційних одиниць за кількістю бляшок, що утворилися в культурі клітин.
Що, по суті, є величина LD 50 і як вона визначається? Досліджуваний вірусний матеріал розлучається відповідно до падінням ступенями концентрації, скажімо кратними десяти: 1:10; 1:100; 1:1000 і т.д. Кожним з розчинів з вказаними концентраціями вірусу інфікують групу тварин (десять індивідуумів) або культуру клітин в пробірках. Потім спостерігають загибель тварин або зміни, що сталися в культурі під впливом вірусу. Статистичним методом визначається ступінь концентрації, здатна вбити 50% тварин з числа заражених вихідним матеріалом. При використанні культури клітин слід знайти таку дозу вірусу, яка виробляє згубну дію на 50% інфікованих нею культур. У цьому випадку вживається скорочення ЦПД 50 (цитопатичної доза). Інакше кажучи, мова йде про таку дозі вірусу, що викликає пошкодження або загибель половини інфікованих нею культур.
Методом бляшок не можна отримати статистичні дані, але можна встановити фактичне число одиниць вірусу в матеріалі, що дає бляшки в культурі клітин. В ідеальному випадку така одиниця відповідає одній функціонально повноцінної частці.
Титрування
індукована вірусом реакція може відбуватися по типу "все або нічого" (тобто наявність або відсутність інфекції), а може бути виражена кількісно, наприклад тривалістю часу, необхідного прояви інфекції, або числом поразок у шарі чутливих клітин. Кількісне визначення вірусної активності називається титруванням. Титр вихідної вірусної суспензії виражається числом інфекційних одиниць, що припадають на одиницю об'єму. Інфекційні нуклеїнові кислоти, незалежно від того виділені чи вони з фагів або з вірусів тварин або рослин, як правило, мають значно меншим інфекційним титром, ніж вихідний вірус (тобто відношення кількості тих, що містяться в препараті молекул нуклеїнової кислоти до числа інфекційних одиниць значно більше, ніж відповідні величини для віріонів, з яких ці нуклеїнові кислоти були виділені). Однак і при титрування вільної нуклеїнової кислоти і при титруванні віріонів ймовірність знаходження в пробі середнього числа частинок виражається однією формулою. Звідси випливає, що вірусну інфекцію може викликати також і одна молекула вірусної нуклеїнової кислоти. Як правило, інфекційними є тільки інтактні вірусні ДНК і РНК. Виняток спостерігається при множині зараженні клітин молекулами нуклеїнової кислоти, що містять неповним геном вірусу.
Резюмуючи сказане, можна прийти до висновку, що титр вірусної суспензії, виражений числом інфекційних одиниць, що містяться в одиниці об'єму, як правило, відповідає числу віріонів (або числа молекул вірусної нуклеїнової кислоти), здатних за умов даного досвіду викликати інфекцію.
Втрата інфекційності
Як правило, чутливість віріонів даного вірусу до дії тих чи інших інактивуючої речовин визначається специфічними властивостями його білків, внаслідок чого методи інактивації інфекційності, розроблені для даного конкретного вірусу, ефективні лише у відношенні близькоспоріднених йому вірусів. Виняток становить чутливість до вірусів рентгенівським променів, що залежить від типу нуклеїнової кислоти віріонів та її кількості. В основі цієї закономірності лежить той факт, що дія рентгенівських променів призводить до розриву молекул нуклеїнової кислоти, і навіть одного такого розриву часто буває достатньо для втрати інфекційного вірусу. Результати експериментів показують, що дрібні віруси інактивуються рентгенівськими променями значно ефективніше, тому що для них характерна велика величина відносини вмісту в віріона нуклеїнової кислоти до вмісту в ньому білка, ніж для великих віріонів, більш багатих білком.
Серологічні методи
З метою визначення виду даного вірусу при вивченні захисних процесів в організмі хворої людини або зараженої тварини застосовуються серологічні методи. Серологія (від лат. Serum - сироватка, рідка складова частина крові) - це розділ імунології, що вивчає реакції антигену специфічними захисними речовинами, антитілами, які знаходяться в сироватці крові. Антитіла нейтралізують дію вірусу. Вони зв'язуються з певними антигенними речовинами, що знаходяться на поверхні вірусних часток. У результаті зв'язування молекул антитіл з поверхневою структурою вірусу останній втрачає свої патогенні властивості. Для встановлення рівня (кількості) антитіл в сироватці або визначення типу даного вірусу проводиться реакція нейтралізації вірусу. Її можна проводити як на тварин, так і на культурі клітин.
Мінімальну концентрацію сироватки, що містить антитіла, достатню для того, щоб нейтралізувати вірус, не дати йому проявити цитопатичної дії, називають титром сироватки, нейтралізуючу вірус. Ця концентрація може бути виявлена і за допомогою методу бляшок.
Для виявлення антитіл використовується метод гальмування гемаглютинації (склеювання еритроцитів під впливом вірусу) і метод зв'язування комплементу. З методів, що застосовуються у вірусології для різних дослідницьких цілей, можна ще згадати методи, за допомогою яких вірусологічний матеріал готується для фізичних і хімічних аналізів, які полегшують вивчення тонкої будови і складу вірусів. Ці аналізи вимагають великої кількості абсолютно чистого вірусу. Очищення вірусу - процес, при якому із суспензії з вірусом усуваються всі сторонні, що забруднюють її частки. В основному це шматочки і "уламки" клітин - господарів. Одночасно з очищенням відбувається зазвичай згущення суспензії, підвищення концентрації вірусу. Так виходить вихідний матеріал для багатьох досліджень.
З окремих методів очищення згадаємо лише найбільш ефективний - метод ультрацентріфугірованія, який дає препарати вірусу дуже високої концентрації.
Опишемо коротко процедуру отримання і очищення вірусної суспензії. Процес цей починається з штучного введення вірусу в мозок піддослідної тварини. Через декілька днів вірус розмножиться в тканини мозку. При цьому будуть виявлені характерні порушення функцій нервової системи "хазяїна", і в тварини виявляться ознаки захворювання. Коли симптоми досягнуть найбільшого розвитку, звірка присипляють, а його мозок, у тканинах якого містяться великі кількості вірусу, витягають у стерильних умовах з черепа тварини. Потім з мозку готується, скажімо, 10%-ва суспензія. Крім віріонів вона містить ще й велика кількість шматочків нервової тканини, залишки кровоносних судин, кров'яні тільця та інші біологічні компоненти. Шматочки тканини та інші великі частинки усуваються першого центрифугуванням зі швидкістю 5000-10000 оборотів в хвилину. Воно триває близько півгодини. Рідина над осадом (суперкатакт) обережно зливають у спеціальні пробірки для центрифугування, зроблені з пластмаси або нержавіючої сталі, оскільки скло не витримує тиск, що розвивається при високошвидкісному центрифугування. А осад знешкоджують дезінфікуючими середовищствами. Злити "супернатант" обробляється потім вже в ультрацентрифугу.
Для седиментації дрібних вірусів необхідно багатогодинне ультрацентріфугірованіе, причому отриманий осад часто буває не більше шпилькової головки. Але і після такої обробки ми маємо не зовсім чистий вірусний матеріал, у ньому ще містяться чужорідні домішки. Для тонких аналізів цей осад треба кілька разів обробити різними реактивами і повторити ультрацентріфугірованіе. Тільки тоді можна одержати концентровану суспензію вірусу високої чистоти, яка потрібна для точних і достовірних біохімічних, кристалографічних аналізу або для спостережень в електронно-оптичних приладах.
У розпорядженні вірусологів взагалі багато різних технічних пристроїв, як, наприклад, центрифугування по градієнтам концентрації, коли віріони поділяються за ступенями концентрації або за формою. Інший прилад, який представляє в наш час стандартне устаткування майже кожної науково-дослідної вірусологічної лабораторії - електронний мікроскоп. Це дорогий, великий і складний апарат.
Для отримання зображення вірусів існує багато різних методів, і всі вони пройшли свої етапи розвитку. Щоб виявити віріони в клітинах, в даний час користуються методом ультратонких зрізів Фіксований матеріал, залитий епоксидної смолою, розрізає найтоншим скляним або алмазним ножем. За допомогою точних ультрамікротомов одну клітину можна розрізати більш ніж на тисячу тонких зрізів. Отримані таким чином зрізи обробляються потім спеціальними хімікаліями, що забезпечує кращу їх видимість.
Для спостереження тонкого будови окремих віріонів застосовується метод негативного контрастування (фарбування), впровадження якого значно підвищило якісний рівень електронного мікроскопірованія. Вірусні частинки при цьому обережно змішуються з розчином фосфовольфрамовой кислоти, що дає осад, не пропускає електронні промені. У результаті віріони постають у вигляді своїх абсолютно точних відбитків, за якими можна вивчати найтонші деталі їх поверхонь. При методі позитивного фарбування (або "металізовані" препарату) застосовуються такі речовини, які здатні вибірково прилипати до поверхні віріонів (наприклад, специфічні антитіла, мічені феритину, що містить у своїй молекулі залізо і тому добре помітні в електронному мікроскопі).
Загальні методи вивчення вірусів
Про присутність вірусу в організмі як при спонтанному захворюванні, так і при експериментальному зараженні господаря судять по появі тих чи інших патологічних симптомів. Кожного разу, коли виникає підозра про присутність вірусу в досліджуваному об'єкті, доводиться підбирати певний комплекс умов - відповідний організм і відповідний спосіб зараження, - при якому вірус викликає у зараженому організмі розпізнавані зміни. Так що вірусологам доводиться витрачати великі зусилля на розробку методів одержання експериментальних інфекцій.
Як відомо, для доказу того, що дане захворювання дійсно викликається певним мікроорганізмом, необхідно виконати так звані постулати Коха: 1) показати, що цей мікроорганізм регулярно виявляється у хворому організмі; 2) отримати культуру цього мікроорганізму на штучної живильному середовищі; 3 ) відтворити дане захворювання зараженням експериментального тваринного виділеної культурою і, нарешті,; 4) повторно виділити даний мікроорганізм, але тепер вже з організму штучно зараженого господаря. Ті ж постулати mutatis mutandis справедливі і для діагностики вірусних захворювань. У цьому випадку, згідно Ріверса, постулати формуються наступним чином: 1) виділення вірусу з організму хворого, 2) культивування вірусу в організмі чи в клітинах експериментального тварини, 3) доказ фільтрованності інфекційного агента (щоб виключити патогенні агенти більшого розміру, наприклад бактерії), 4) відтворення подібного захворювання в іншого представника даного або спорідненого виду і, нарешті, 5) повторне виділення того самого вірусу.
Культивування та ідентифікація вірусів - основні вірусологічні методи, використовувані в практичній вірусології при діагностиці вірусних захворювань. Матеріал, в якому підозрюється наявність вірусу, наприклад лізат бактерій, шматочок тканини або біологічна рідина, при необхідності подрібнюють або гомогенезіруют з тим, щоб при контрольованих умовах перевести його в суспензованого стан.
Великі фрагменти клітин, а також можливі забруднюючі матеріал мікроорганізми видаляють за допомогою центрифугування і фільтрування. Таку очищену суспензію вводять невластивому господареві, або додають до суспензії клітин, або наносять на монослой відповідних клітин. У результаті в шарі чутливих клітин, таких, як бактерії, що ростуть у чашці з агаром, або клітини тварин, що ростуть на поверхні скла, можуть з'явитися локальні ураження, так звані бляшки, які характерні для даного вірусу .. Бляшки утворюються в результаті зараження розташованих в даній області клітин, розмноження в них вірусу і їх повного або часткового лізису. Якщо розмноження вірусу не веде до утворення візуально виявляються дискретних бляшок, вірус може бути виявлений і охарактеризовано щодо змін, що викликається ним в культурі клітин, або по пошкодження шару клітин або за допомогою інших тестів.
Якщо досліджуваний матеріал не наносять на шар культивованих клітин, а вводять в організм господаря, то мета експерименту - виявлення загальних реакцій організму, що свідчать про розвиток інфекції: поява симптомів захворювання, загибель тварини або які-небудь інші специфічні реакції, наприклад утворення антитіл .
Нарешті, якщо ні зараження культури клітин, ні введення матеріалу в організм господаря не ведуть до появи будь-яких симптомів вірусної інфекції, вірусологи вдаються до так званих "сліпим пасажів", тобто до повторних перенесенню досліджуваного матеріалу, що часто призводить до підвищення вірулентності вірусу або до збільшення його титру.
Загальний хімічний склад вірусів
Неодмінною компонентом вірусної частинки є яка-небудь один з двох нуклеїнових кислот, білок і зольні елементи. Ці три компоненти є спільними для всіх без винятку вірусів, тоді як інші дваліпоіди і вуглеводи - входять до складу далеко не всіх вірусів.
Віруси, що складаються тільки з білка нуклеїнової кислоти і зольних елементів, найчастіше належать до групи простих, так званих мінімальних, вірусів, позбавлених диференціації, власних ферментів або будь-яких спеціалізованих структур. До такого роду вірусів належать віруси рослин, деякі віруси тварин і комах. У той же час практично всі бактеріофаги, які за хімічним складом, безумовно належать до групи мінімальних вірусів, насправді є дуже складними і високодиференційованими структурами. Віруси, до складу яких поряд з білком і нуклеїнової кислотою входять також ліпоїдами і вуглеводи, як правило, належать до групи складно влаштованих вірусів. Більша частина вірусів цієї групи паразитує на тваринах.
Білки вірусів
Амінокислотний складу вірусних білків
Білок всіх досліджених до теперішнього часу вірусів побудований із звичайних амінокислот, що належать до природного L-ряду. D-амінокислот у складі вірусних часток не знайдено. Співвідношення амінокислот у вірусних білках досить близько до такому в білках тварин, бактерій і рослин.
Вірусні білки не містять зазвичай великої кількості основних амінокислот (аргініну, муцину), тобто не належать до групи білків типу гістонів і протаміну з яскраво вираженими лужними властивостями. Не враховуючи нейтральних амінокислот, можна сказати, що у вірусному білку переважають кислі дикарбонових кислот. Це справедливо як для вірусів з низьким вмістом нуклеїнової кислоти, так і для вірусів з високим вмістом РНК і ДНК.
Вірусна ДНК
Головною структурною особливістю більшості вірусних молекул ДНК, як і ДНК з інших джерел, є наявність двох спарених антипаралельних ланцюгів. ДНК-геном вірусів, проте, невеликий і тому тут виникають питання, що стосуються решт спіралі і загальної форми молекули ДНК, а не монотонної, фактично не має решт "середньої" частини спіралі. Отримані відповіді виявилися досить дивними: молекули вірусних ДНК можуть бути лінійними або кільцевими, дволанцюжкові або одноланцюжкові по всій своїй довжині або ж одне цепочечнимі тільки на кінцях. Крім того, з'ясувалося, що більшість нуклеотидних послідовностей у вірусному геномі зустрічається лише по одному разу, проте на кінцях можуть перебувати повторюються, або надлишкові ділянки.
З усіх описаних до цих пір вірусних ДНК найбільш складно організована ДНК вірусу герпесу. Геном тут, мабуть, складається з двох великих з'єднаних сегментів, кожен з яких має повторювані кінцеві послідовності. Можливі чотири способи з'єднання двох таких сегментів кінець в кінець, і всі вони нібито зустрічаються в кожному препараті віріонів.
Найбільший з відомих вірусів - вірус осповакціни має геном розміром 15-108 дальтон. ДНК, виділена зі свіжого препарату віріонів, очевидно, має поперечні зшивання, тому що не розділяється за два ланцюги. Одна з можливих моделей такої молекули - гігантська, не схильна до денатурації кільцева структура, що утворюється при замиканні решт лінійної подвійної спіралі.
Крім дуже цікавих відмінностей у формі молекули і в структурі кінцевих ділянок вірусних ДНК існують також великі відмінності у величині геному. Серед найменших "повних" вірусів (тобто вірусів, які здатні розмножуватися в клітині-господаря) можна назвати фаг
