Ембріональні стовбурові клітини людини

Сергій Львович Кисельов, проф. д.б.н., зав. лаб. молекулярної генетики раку Ін-ту біології гена РАН. Марія Андріївна Лагарькова, к.б.н., рук. групи біології стовбурових клітин в тому ж інституті.

Мабуть, наймолодшим напрямком сучасної медицини можна вважати клітинні технології, в яких клітини служать джерелом тих або інших необхідних чинників, наприклад пухлинних антигенів при вакцинотерапію. Але використовувати клітину можна не тільки як джерело будь-яких субстанцій, а й для регенеративної медицини. Тут особливий інтерес викликають технології, засновані на стовбурових клітинах. Здатність до необмеженого поділу і до перетворення в різні типи клітин (так звана плюріпотентность) робить їх ідеальним матеріалом для трансплантаційний методів терапії. Найбільш доступними вважаються стовбурові клітини дорослого організму. Однак реальний потенціал їх диференціювання ще слабо вивчений.

Надзвичайно привабливі в цьому відношенні ембріональні стовбурові клітини (ЕСК) людини: з них можна отримувати будь-які типи клітин організму. Але багато властивостей і клітинні механізми, пов'язані з наявністю у клітини так званої «стовбурові», ставлять її дуже близько до трансформованому, ракової клітки. Саме тому так важливо сьогодні вивчати характеристики самих ембріональних клітин. За вісім років, що минули з моменту одержання перших ліній ЕСК людини, вдалося з'ясувати лише невелику частину механізмів, що забезпечують в культурі самопідтримки недиференційованих клітин або їх диференціювання.

Ще недавно кількість ліній ЕСК людини, доступних для вивчення, було невелике. В даний час їх стало набагато більше, але методологічні труднощі і висока вартість роботи з ними ще обмежують коло дослідників. Не менші обмеження на дослідження в області ембріональних клітин людини накладає етична сторона. Незважаючи на дебати про етичність чи неетичності роботи з ЕСК людини, очевидно, що питання вже не в тому, чи проводити дослідження в області ЕСК людини, а в тому, як будуть проводиться дослідження в цій області. За останні два роки у великій кількості країн вже були прийняті закони, які дозволяють дослідження ембріональних стовбурових клітин людини.

Ембріональні стовбурові клітини отримують з внутрішньої клітинної маси бластоцисти на самих ранніх стадіях розвитку ембріона, коли вона ще не імплантувати в стінку матки. Саме з клітин внутрішньої клітинної маси в подальшому розвивається цілий організм. Досить часто, особливо в російськомовній літературі, ембріональними стовбуровими клітинами називають клітини постімплантаціонного ембріона різних строків розвитку вагітності, які за своїми властивостями швидше схожі з дорослими стовбуровими клітинами. Ми ж будемо говорити тільки про справжні ембріональних стовбурових клітинах, що походять з бластоцисти, - на тій стадії, коли ембріон складається з 150-200 клітин трофоектодерми і внутрішньої клітинної маси приблизно у рівному співвідношенні.

Стабільні лінії

Стабільні клітинні лінії ЕСК людини вперше отримав американський дослідник Дж.Томсон в 1998 р. [1]. Цьому досягненню передували роботи М. Еванса і М. Кауфмана. У 1981 р. вони вперше показали принципову можливість отримання стабільних культур клітин ссавців, що мають властивість плюріпотентності. Лінії ЕСК миші залишалися в культурі in vitro в недиференційованому стані протягом більше сотні подвоєнь, а потім in vivo могли брати участь у формуванні спеціальних тканин тварини. У 1995 Томсон із колегами, модифікувавши технологію виділення мишачих клітин, отримав лінію ЕСК приматів, а в 1998 р. - і лінію клітин людини.

Для отримання стабільних ліній ЕСК людини беруть незатребувані після штучного запліднення бластоцисти людини. Зазвичай після такої процедури кількість бластоцист більше, ніж необхідно реципієнту. Їх можна заморозити, знищити або за згодою донорів використовувати для наукових цілей. Краще за все виділяти ембріональні клітини людини на 4-6-й день після запліднення. Спочатку за допомогою ферменту пронази розчиняють прозору оболонку бластоцисти, а потім методом комплемент-залежного лізису видаляють трофобласта. Внутрішню клітинну масу поміщають в культуральну середу на підкладку з інактивованих мишачих ембріональних фібробластів, які служать джерелом ростових факторів. Пересаджуючи клітини, можна отримати клітинну лінію, здатну до практично необмеженого поділу. Сьогодні в лабораторіях світу виділено близько 150 ліній ЕСК. У нашій країні ембріональні стовбурові клітини отримані в 2003 р. в Інституті біології гена РАН та в Інституті цитології РАН.

Рис. 1. Три колонії ЕСК людини.

На відміну від ЕСК миші, людські клітини дуже погано ростуть у вигляді поодиноких клітин,

а виживають тільки в колонії. Вивів. 100. Тут і далі фото авторів Ембріональні стовбурові клітини ростуть щільними колоніями клітин на підкладці з мітотичний інактивованих ембріональних фібробластів миші (рис.1). Успішність отримання ліній ЕСК людини досить висока при використанні морфологічно нормальних бластоцист з видимою внутрішньої клітинної масою, майже половина яких може дати каріотіпіческі нормальні клітини. Ці результати відповідають рівню імплантації ембріонів після пересадки реципієнтів. Нарощувати клітинну масу досить складно. Мишачі клітини прекрасно ростуть після ферментативної обробки до одиничних клітин, але клітини людини, позбавлені міжклітинних контактів, зазвичай гинуть. Тому їх поділяють до окремих фрагментів по 50-500 клітин (або ферментативної обробкою, або механічно, розрізаючи на шматочки мікроінструменту).

Маніпуляції з ооцита in vitro дозволяють отримувати лінії ЕСК людини із заданим генотипом і, відповідно, імунологічно сумісні з потенційним донором. Тут можливі кілька підходів: перенос ядер соматичних клітин, партеногенез або злиття клітин. Перенесення ядер соматичних клітин досить часто не зовсім коректно називають клонуванням. В останні місяці 2005 розгорнулася детективна історія навколо робіт вчених з Сеульського національного університету під керівництвом В. Хванг. У 2004-2005 рр.. в журналі «Science» вони опублікували дві роботи з описом методики отримання лінії ЕСК людини із внутрішньої клітинної маси, отриманої після пересадки ядра соматичної клітини в ооцит. На жаль, роботи виявилися грандіозною фальсифікацією, причини якої досі не з'ясовані. Не виключено, що все могло бути заздалегідь організовано третіми особами в комерційних або політичних цілях. Проте ці події не тільки не знизили інтерес до проблеми, а й активізували роботи в цьому напрямку.

Основні характеристики

Як і всі клітинні культури, ембріональні стовбурові клітини потребують чіткої характеристиці [2]. Найпростіше - це зовнішнє опис, але воно дає досить обмежену інформацію про властивості клітин. У останнім часом прийнято розрізняти клітини з поверхневим антигенів, які більш повно описують той чи інший тип. Ембріональні стовбурові клітини людини мають поверхневі імунологічні маркери, наприклад: SSEA-3, SSEA-4 -- антигенні детермінати (епітопи) гліколіпіду та TRA-1-60, TRA-1-81 - різні епітопи одного протеоглікани клітинної поверхні.

Наявність набору певних маркерів говорить про приналежності клітин до ЕСК людини, але не про їхню здатність до тривалої проліферації. Вона визначається активністю ферменту теломерази і довжиною теломерна повторів. У соматичних клітин з обмеженим числом поділок довжина теломер мала, а теломеразная активність зазвичай дуже невисока. Навпаки, у пухлинних клітин активність ферменту залишається дуже високою, а довжина теломерна повторів зберігається. Цією ж властивістю володіють і ембріональні стовбурові клітини.

І імунологічні маркери ЕСК, і висока теломеразная активність властиві трансформувати клітини, тобто клітин, в яких відбулися генетичні зміни. Виходить, для точної характеристики ліній ЕСК людини обов'язковий аналіз каріотипу. Нормальний набір хромосом і відсутність хромосомних аномалій - це ознаки нормального каріотипу, який, однак, у процесі культивування клітин може бути порушений. Так, при тривалому культивуванні (приблизно через два роки) ми відзначили істотна зміна в швидкості росту клітин, а також в їх здатності до диференціювання. Каріотіпіческій аналіз показав порушення в хромосомі 18 і тенденцію до нестабільності каріотипу. Не виключено, що це і стало причиною аномального поведінки клітин в культурі. Згодом ми не раз виявляли субклони інших ліній ЕСК з різними хромосомними абераціями. Зовсім недавно з'явилася публікація, що підтверджує наші спостереження. Отже, при тривалому культивуванні ЕСК людини необхідний строгий контроль їх каріотипу.

Молекулярно-генетичні механізми самопідтримки

Одне з чудових властивостей ембріональних стовбурових клітин - їх спроможність зберігати плюріпотентность в культурі. На мишачих клітинах це легко перевірити експериментально: з однієї клітини, культивований in vitro, можна відтворити цілий організм. Саме так отримують тварин з генетичним «нокаутом». Суть технології полягає в тому, що генетично модифіковані in vitro ембріональні клітини миші вводять в бластоцисти, яку імплантують псевдобеременной мишці. В результаті народжуються так звані химерні миші, у яких частина клітин - від бластоцисти реципієнта, а частина генетично модифікована. Якщо такі клітини потраплять в зародковий шлях, у другому поколінні можна отримати тварину, усі клітини якого будуть нащадками однієї генетично модифікованої ембріональної клітини.

Ця технологія не тільки дозволяє «вимикати» певні гени в строго детермінованих тканинах, але «включати» дефектні, створюючи модельні системи захворювань. Зі зрозумілих причин така процедура з клітинами людини неможливе. Тут для перевірки плюріпотентності ембріональні клітини людини вводять імунодефіцитних мишам. В результаті у тварин формуються доброякісні пухлини - тератоми, в яких можна виявити кілька видів сформованих тканин [3]. Однак для постійного моніторингу стану ЕСК і для забезпечення оптимальних умов культивування такий метод видається нераціональним. Тут дуже важливо з'ясувати молекулярні механізми, що визначають специфіку ембріональних стовбурових клітин, а саме їх здатність залишатися в культурі в недиференційованому стані. Деякі механізми - загальні для ЕСК миші і людини, а деякі - різні.

У самопідтримки ЕСК бере участь транскрипційні OCT4 фактор, який виникає від восьміклеточной стадії ембріона миші. Він необхідний для формування внутрішньої клітинної маси бластоцист (в клітинах трофоектодерми він відсутній). Відповідна активність гена oct4 підтримує недиференційоване стан ембріональних клітин, а її підвищення або відсутність викликає їх перетворення в клітини ентодерми і мезодерми або трофобласта відповідно [4]. У соматичних клітинах тканин експресія гена oct4, характерна для ЕСК людини, не виявлено, хоча останнім часом з'явилися повідомлення про його низьку активність в стовбурових клітинах дорослого організму. Навіть на початку диференціювання ЕСК в ембріоідние тільця активність гена оct4 знижується.

У підтримці плюріпотентності ЕСК миші і людини бере участь також гомеобоксний транскрипційні фактор NANOG. Якщо ген nanog заблокований, ембріональні клітини перетворюються на примітивну ентодерми. У відсутність ростового фактора LIF підвищена активність гена nanog забезпечує плюріпотентное стан ЕСК миші. Подібно гену oct4, в клітинах соматичних тканин ген nanog не виявляється, за винятком фетального мозку, репродуктивних органів (сім'яників і яєчників) та клітин ембріональної карциноми. У міру спонтанної диференціювання ЕСК людини в ембріоідние бичка активність гена nanog знижується.

Крім генетичних механізмів, долю клітини визначають і так звані епігенетичні механізми (тобто успадковані клітиною зміни у функціонуванні генів, не пов'язані зі зміною послідовності ДНК). Яскравим прикладом їх дії може служити інактивація однією з Х-хромосом в жіночих ХХ-клітинах. Епігенетичні механізми відіграють істотну роль у процесах раннього ембріонального розвитку, контролюючи роботу генів. Епігенетична модифікація регуляторних районів генів забезпечує вимикання їх функцій на наступних етапах розвитку. Це надзвичайно важливо, оскільки несвоєчасна або нескоординованих робота генів може призводити до загибелі клітин або до їх трансформації. Наприклад, регуляторний район гена oct4 епігенетичні модифікований практично у всіх клітинах дорослого організму. Така зміна і становить одну з основних проблем переносу ядер соматичних клітин дорослого організму в ооцит. У нашій лабораторії показано, що і регуляторний район гена nanog в клітинах дорослого організму епігенетичні модифікований, що ще більше ускладнює перенесення ядер.

Сучасні методи аналізу, такі як мікрочіпи, дозволяють досить швидко визначати активність декількох тисяч генів, що створює більш точну картину молекулярно-генетичного стану клітини. Це особливо важливо для довгостроково культивованих клітин, призначених для терапії.

Говорячи про підтримку плюріпотентності ембріональних стовбурових клітин ссавців, не можна не відзначити роль зовнішніх ростових факторів, у тому числі і фібробластів як підкладку-фідера (від англ. feed - Годування, харчування). Перші клітинні лінії ЕСК миші і людини отримували з використанням первинних мишачих ембріональних фібробластів, забезпечують не тільки кращий ріст клітин, але і їх недиференційоване стан. Пізніше їх замінили безсмертної клітинної лінією. Проте вважається, що ці клітинні лінії не можна застосовувати в регенеративної медицини або генної терапії, оскільки від мишачих клітин можливе перенесення патогенних мікроорганізмів і вірусів. Крім цього, клітини людини починають представляти мишачі антигени, що може викликати відторгнення трансплантата. Сьогодні для культивування ліній ЕСК людини іноді використовуються фібробласти крайньої плоті людини. У літературі з'явилися окремі публікації про отримання таких ліній і в бесфідерних умовах.

Диференціація in vitro

In vitro спонтанна диференціювання ЕСК відбувається при тривалому культивуванні прикріплених колоній і в суспензії в міру зростання ембріоідних тілець, які певною мірою служать моделлю ранніх подій ембріогенезу. У разі мишачих ЕСК ембріоідние тільця виходять аггрегірованіем окремих клітин або груп клітин у сферичні структури. У відміну від мишачих клітин, не всі лінії людини легко утворюють ембріоідние бичка, і ніколи з поодиноких клітин. У ембріоідних тільцях короткого культивування спостерігаються групи клітин, які несуть маркери, специфічні для всіх трьох зародкових листків (рис.2), але далі розвиток зупиняється. Сьогодні чіткої відповіді про причини гальмування органогенезу немає; найімовірніше, для цього потрібна поляризація ембріона, що диктується ззовні.

Рис. 2. Ембріоідние бичка, сформовані ЕСК людини.

У міру дозрівання всередині щільних клітинних кульок з'являються порожнини, і через деякий час ембріоідное тільце перетворюється на сферу. Справа показано імуногістохімічне фарбування зрізів ембріоідних тілець антитілами до клітин епітелію (червоний), мезодермальні клітинам (зелений), синім забарвлені ядра клітин. Вивів. 50.

Ембріональні стовбурові клітини in vitro здатні перетворитися на різні клітини, що мають специфічні маркери нейронів і глії, ендотелію, кератиноцитів, трофобласт, кардіоміоцитів, остеобластів, клітин крові, печінкових клітин, які продукують інсулін-клітин і деяких інших [2]. Однак функціональність більшості носіїв маркерів ще мало доведена.

У 2001 р. вперше описали диференціювання ЕСК людини в нейрони і астроцити [5]. Клітини нейроектодерми, що формуються в ембріоідних тільцях, механічно витягували, поміщали у відповідні умови культивування (фактори, що забезпечують проліфераціїю клітин), де формувалися нейросфери. Hейральние попередники після пересадки в мозок новонароджених мишей могли утворювати три типи нейтральні клітин і не давали тератом.

З тих пір зроблено дуже багато. Знайдено фактори, збільшують кількість нейтральні попередників (ретиноєва кислота, блокатор СИГНАЛЬНИЙ шляху BMP та ін); показана диференціювання функціональних нейрональних клітин певної спеціалізації (наприклад, дофамінергічних нейронів). Нещодавно отримані дані про можливість тривалого (більше 100 пасажів) культивування нейроектодермальні попередників у бессивороточной середовищі в присутності ростових факторів.

нейрональні попередники отримують через стадію ембріоідних тілець або безпосередньо з недиференційованих колоній ліній ЕСК людини. Нейрональні попередники можна культивувати в суспензії до 25 пасажів у вигляді нейросфер у присутності епідермального чинника зростання і фактора росту фібробластів. При перекладі нейросфер на культуральний пластик, покритий компонентами позаклітинної матриксу, вони прикріплюються і перетворюються в нейрони і астроцити. При додаванні в середу трііодтіроніна і певних ростових факторів у нейросферах з'являються попередники олігодендроцітов. Ймовірно, саме олігодендроціти і будуть першими клітинами, отриманими з ЕСК людини, які пройдуть апробацію при клінічних випробуваннях лікування травми спинного мозку. Ці клітини, секретирующие основний білок мієліну, необхідні для відновлення пошкодженої ділянки нервової тканини спинного мозку. В США ці випробування планують розпочати вже в 2006 р.

Спонтанне диференціювання ЕСК в кератиноцити з ембріоідних тілець описали в 2003 р. Автори відзначили зміни активності трьох маркерів, характерних для формуються кератиноцитів (p63, кератин 14, інволюкрін).

Ембріональні клітини миші легко диференціюються міокарда. Усього через кілька днів після видалення живильного шару і фактора LIF, що підтримує недиференційоване стан клітин, на культуральних чашках утворюються що скорочуються колонії клітин. У певних умовах вони мають електрофізіології нормальних дорослих кардіоміоцитів і, більше того, можуть функціонально інтегруватися в м'яз міокарда. На відміну від мишачих клітин, спонтанна диференціювання клітин людини спостерігається у різних ліній ЕСК - від скорочуються ділянок у 70% ембріоідних тілець до повного відсутності диференціювання. Попередники кардіоміоцитів, отримані з ЕСК людини, синтезують транскрипційні фактори Nkx 2.5, GATA4, а потім і специфічні маркери кардіоміоцитів (тропоніна 1 і важкий ланцюг