Вірус синдрому набутого імунного дефіциту.
1. Введення
Ще якихось два десятки років тому людство перебувало у впевненості, що інфекційні хвороби не більше не становлять небезпеки для цивілізованого світу. Однак з появою на початку 80-х років синдрому набутого імунного дефіциту (СНІДу) ця впевненість суттєво похитнулася. СНІД не є рідкісним захворюванням, від якого можуть випадково можуть постраждати деякі люди. Провідні спеціалісти визначають у даний час СНІД як "глобальна криза здоров'я", як перший дійсно всеземную і безпрецедентну епідемію інфекційного захворювання, що дотепер по закінченні першої декади епідемії не контролюється медициною і від нього вмирає кожен заразилася людина.
СНІД до 1991 року був зареєстрований у всіх країнах світу, крім Албанії. У самій розвитий країні світу - Сполучених Штатах вже в той час один їх кожних 100-200 чоловік інфікований, кожні 13 секунд заражається ще один житель США і до кінця 1991 року СНІД у цій країні вийшов на третину місце по смертності, обігнавши ракові захворювання. Поки що СНІД змушує визнати себе хворобою зі смертельним результатом у 100% випадків.
Перші хворі на СНІД люди виявлені в 1981 році. Протягом минулої першої декади поширення вірус-збудника йшло переважно серед певних груп населення, які називали групами ризику. Це наркомани, повії, гомосексуалісти, хворі уродженої гемофілії (тому що життя останніх залежить від систематичного введення препаратів з донорської крові).
Проте до кінця першої декади епідемії у ВОЗ накопичився матеріал, що свідчить про те, що СНІД вийшов за межі названих груп ризику. Він вийшов в основну популяцію населення.
З 1992 року почалася друга декада пандемії. Очікують, що вона буде суттєво важче, ніж перша. В Африці, наприклад, у найближчі 7-10 років 25% сільськогосподарських ферм залишаться без робочої сили через вимирання від одного тільки СНІДу.
СНІД - руйнівна хвороба, що викликається інфекційним агентом, що належать до групи ретровірусів. Лякаюче загадкова епідемія тільки починалася, але наука миттєво відгукнулася на неї. За два роки, з 1982 по 1984 р., була з'ясована загальна картина хвороби. Виділено збудник - вірус іммудефіціта людини (HIV - від англ. Human Immunodeficiency Virus), розроблено метод аналізу крові, що виявляє наявність інфекції, встановлені специфічні мішені вірусу в організмі.
Хоча вже зрозуміла загальна картина синдрому набутого імунодефіциту і пов'язаних з ним захворювань, а також виявлено та досліджено вірус імунодефіциту людини, її походження залишається загадкою. Є переконливі серологічні дані на користь того, що на західному і східному узбережжях Сполучених Штатів інфекція з'явилася в середині 70-х років. При цьому випадки асоційованих зі СНІДом захворювань, відомих у центральній Африці, указують на те, що там інфекція, можливо з'явилася ще раніше (50-70 років). Як би там не було, поки не вдається задовільно пояснити, звідки взялася ця інфекція. За допомогою сучасних методів культивування клітин було виявлено кілька ретровірусів людини і мавп. Як і інші РНК-віруси, вони потенційно мінливі; тому в них цілком у них цілком ймовірні такі зміни в спектрі хазяїв і вірулентності, які могли б пояснити появу нового патогена. Існує кілька гіпотез:
1) вплив на раніше існуючий вірус несприятливих факторів екологічних факторів;
2) бактеріологічна зброя;
3) мутація вірусу в наслідку радіаційного впливу уранових покладів на передбачуваної батьківщині інфекційного патогена - Замбії і Заїрі.
Після першого сплеску дослідження, хоча й трохи повільніше, але стійко просувалися вперед. Проте в деяких відносинах вірус переганяв науку. До цих пір по суті немає засобів лікування або попередження СНІДу, а епідемія тим часом продовжує розповсюджуватися. На багато питань, пов'язаних з цією хворобою, відповіді поки немає, але так само деякі питання піддалися успішному вирішенню.
2. Будова і життєвий цикл вірусу СНІДу
Інфекція вірусом імунодефіциту людини, що викликає СНІД, багатолика. Спочатку цей вірус зазвичай інтенсивно розмножується, і вільні віріони (вірусні частки) з'являються в рідині. Заповнюють порожнини головного і спинного мозку, а так само в кровотоку. Перша хвиля реплікації HIV може супроводжуватися жаром, висипом, явищами, подібних симптомів грипу, і іноді неврологічними розладами. Потім на кілька тижнів кількість вірусу, що циркулює в крові і цереброспинальной рідини, значно зменшується. Тим не менше вірус, як і раніше присутня в організмі. Його можна виявити не тільки в Т-4 лімфоцитах, які на початку вважалися його єдиною мішенню, але і в інших клітинах імунної системи, у клітинах нервової системи та кишечнику, а також, ймовірно, в деяких клітинах спинного мозку.
Тут має сенс дати короткий опис тієї системи організму, яку він виводить із ладу, тобто системи імунітету. Вона забезпечує в нашому тілі сталість складу білків і здійснює боротьбу з інфекцією і злоякісно перероджуються клітинами організму.
Як і всяка інша система, імунна система має свої органи і клітини. Її органи - це тимус (вилочкова залоза), кістковий мозок, селезінка, лімфатичні вузли (їх іноді неправильно називають лімфатичними залозами), скупчення клітин у горлі, тонкому кишечнику, прямій кишці. Клітинами імунної системи є тканинні макрофаги, моноцити і лімфоцити. Останні в свою чергу, поділяються на Т-лімфоцити (дозрівання їх відбувається в тимусі, звідки і їхня назва) і В-лімфоцити (клітини, що дозрівають у кістковому мозку).
Макрофаги мають різноманітні функції, вони, наприклад, поглинають бактерії, віруси і зруйновані клітини. В-лімфоцити виробляють імуноглобуліни - специфічні антитіла проти бактеріальних, вірусних і будь-яких інших антигенів - чужорідних високомолекулярних з'єднаннях. Макрофаги і В-лімфоцити забезпечують гуморальний (від лат. Humor - рідина) імунітет.
Так називані клітинний імунітет забезпечують Т-лімфоцити. Їхній різновид - Т-кілери (від англ. Killer - вбивця) здатні руйнувати клітки, проти яких вироблялися антитіла, або вбивати чужорідні клітини.
Складні і різноманітні реакції імунітету регулюються за рахунок ще двох різновидів Т-лімфоцитів: Т-хелперів (помічників), що позначаються також Т4, і Т-супресорів (гнобителів), інакше позначаються як Т8. Перші стимулюють реакції клітинного імунітету, другі гнітять їх. У результаті забезпечується нейтралізація і видалення чужорідних білків антитілами, руйнування проникнули в організм, і вірусів, а також злоякісних переродившись клітин організму, інакше кажучи, відбувається гармонійний розвиток імунітету.
У загальних рисах життєвий цикл HIV, такий же, як у інших вірусів цієї групи. Ретровіруси отримали свою назву в зв'язку з тим, що в їх розвитку є етап, на якому перенесення інформації відбувається в напрямку зворотному тому, яке вважається звичайним, нормальним. Генетичним матеріалом клітин є ДНК. У ході експресії генів спочатку відбувається транскрипція ДНК: утворюється копіює її мРНК, яка потім служить матрицею для синтезу білків. Генетичним матеріалом ретровірусів служить РНК, і, щоб відбулася експресія генів, повинна з'явитися ДНК-копія вірусної РНК. Ця ДНК звичайним шляхом забезпечує синтез вірусних білків.
Життєвий цикл HIV починається з того, що вірусна частка приєднується зовні до клітки і вводить всередину неї свою серцевину. Серцевина віріона містить дві ідентичні ланцюга РНК, а також структурні білки й ферменти, потрібні на наступних стадіях життєвого циклу. Фермент зворотній транскриптаза, що має декілька ферментативних активностей, здійснює етапи перенесення генетичної інформації вірусу - синтез ДНК. На першому етапі вона синтезує одноланцюжкові ДНК по РНК, потім розщеплюючи останню. Потім синтезується другий ланцюг, використовуючи перший як матрицю.
Генетична інформація вірусу, тепер вже у формі дволанцюжкової ДНК, проникає у клітинне ядро. За допомогою інтегразной активності того ж ця ферменту ДНК вбудовується в хромосомну ДНК. У такому вигляді вірусна ДНК, яка називається провіруси, буде відтворюватися разом з власними генами при діленні клітини і передаватися наступним поколінням.
Друга частина життєвого циклу HIV - виробництво нових віріонів - відбувається спорадично і тільки в деяких заражених клітинах. Вона починається, коли т.з. довгі кінцеві повтори (LTR, від англ. long terminal repeat; це особливі нуклеотидні послідовності на кінцях вірусного генома) ініціюють транскрипцію вірусних генів; при цьому ферменти, що належать клітині-хазяїнові синтезують РНК - копії провіруси.
Кожна вірусна частка збирається з безлічі копій двох різних білкових молекул, співвідношення яких складає приблизно 20:1. Структура віріона досить проста і складається з двох оболонок: зовнішньої - сферичної, і внутрішньої - пулевідной. Остання містить у собі два ланцюги РНК і ферменти: зворотний транскриптазу, протеїназ та інтеграли. На зовнішній оболонці містяться білки, молекули якого виступають з мембрани на зразок шипів. Кожен шип утворений двома або трьома ідентичними субодиниця, які у свою чергу, складаються з двох зв'язаних компонентів, що представляють собою глікопротеїни. Один компонент, що позначається gp120 (глікопротеїн з молекулярною масою 120000), виступає над поверхнею клітини, а інший - gp41 - на зразок стрижня занурений у мембрану. Ці глікопротеїни комплекси визначають здатність HIV заражати нові клітини.
хитромудро організовані генетичні регулятори визначають, чи почнеться цикл реплікації вірусу, і яка буде інтенсивність розмноження. Крім трьох генів для білків серцевини і оболонки в геномі HIV є щонайменше шість генів. Деякі з них, а можливо і все, регулюють виробництво вірусних білків: один ген забезпечує прискорення синтезу білків в цілому, другий - тільки певних білків, а третій - придушення синтезу білків. Оскільки регуляторні гени самі кодують білки, кожен з них впливає не тільки на структурні гени, але і на регуляторні гени, в тому числі і на самого себе.
Регуляторний ген tat (від англ. t rans- a ctivator of t ranscription) відповідальний за спалах реплікації, яка спостерігається, приміром , в Т-4 клітинах, коли вони активуються при зустрічі з антигеном (чужорідної молекулою, що викликає імунну відповідь). Ген tat незвичайний як за структурою, так і за своєю дією. Він складається з двох нуклеотидних послідовностей, розташованих досить далеко один від одного. У результаті його транскрипції утворюється РНК (первинний транскрипт), яка повинна піддатися сплайсинг (проміжний сегмент вирізається і кодують послідовності з'єднуються), щоб вона перетворилася на мРНК і по ній синтезувати білок. вплив білка - продукту гена tat дуже велике: він може підвищити рівень експресії вірусних генів в 1000 разів у порівнянні з тим, що спостерігається у мутантів HIV без цього гена. Стимулюючий ефект поширюється на всі вірусні білки - як на структурні компоненту віріонів, так і на регуляторні білки, включаючи білок кодується самим геном tat. Завдяки такій позитивного зворотного зв'язку, як тільки механізм за участю гена tat активувався, дуже швидко утворюється величезна кількість вірусних часток.
У той час як ген tat посилює синтез всіх вірусних білків без розбору, другий регуляторний ген, rev (від англ. regulator of virion-protein expression - регулятор експресії білків віріона) має виборчою дією, завдяки якому виробляються або регуляторні білки, або компоненти віріона. Білок - продукт гена rev, як і у випадку гена tat, кодується роз'єднаними нуклеотидними послідовностями, які з'єднуються в результаті сплайсингу РНК. У регуляції цим білком беруть участь ще два послідовності. Одна з них діє як репресор: перешкоджає трансляції транскриптів, які її містять. Інша послідовність взаємодіє з білком rev і знімає ефект першої послідовності.
Послідовність - репресор, звана CRS (від англ. cis-acting repression sequence), мається на мРНК, по яких синтезуються білки, які формують віріони - серцевинні білки, ферменти реплікації і білок оболонки; мРНК регуляторних білків - продуктів генів tat і самого rev - не містять CRS. Під час відсутності білка - продукту гена rev - послідовність CRS не дає накопичуватися довгим мРНК, по яких синтезуються білки для віріонів. Навпаки, короткі мРНК, що кодують регуляторні білки не мають CRS, стабільні і транслюються.
У присутності білка - продукту гена rev відбувається "перемикання". Цей білок діє на послідовність CAR (від англ. Cis-acting rev-responsive sequence), яка теж міститься в довгих мРНК. При цьому нейтралізується CRS і починають накопичуватися повнорозмірні мРНК, і замість регуляторних білків синтезуються білки, з яких збираються нові віріони. Таким чином, механізм за участю гена rev може визначати перехід від прихованої інфекції до активного розмноження вірусу.
Проте під час реплікації взаємодія між механізмами rev і tat може стримувати розмноження вірусу, нейтралізуючи один одного. Продукт гена tat посилює синтез самого себе і білка гена rev, тоді як продукт гена rev уповільнює власний синтез і синтез білка кодованого геном tat. В результаті встановлюється свого роду гомеостаз, який характеризується постійними рівнями білків, кодованих генами tat і rev, і помірним виробництвом вірусних частинок. Обмежена реплікація дозволяє вірусу відтворюватися роками, не вбиваючи заражені клітини, тому такий тип генетичної регуляції може бути адаптивним ознакою ретровірусів, господарями яких є види з довгим часом життя, такі як людина.
Крім активатора (tat) і виборчого регулятора (rev) у HIV є негативний регулятор. Який уповільнює транскрипцію вірусного генома. Ген негативного регуляторного фактора, що позначається nef (від англ. Negative-regulatory factor), можливо, визначає здатність HIV припиняти розмноження і переходити в стан спокою.
Послідовність, що є мішенню білка - продукту гена nef, розташована на початку вірусного генома в довгому кінцевому повторі. Вона називається негативним регуляторним елементом (NRE, від англ. Negative-regulatory element). NRE пригнічує транскрипцію навіть сама по собі; якщо вірусний LTR, позбавлений цієї послідовності, ввести в незаражену клітку, він забезпечує підвищений рівень транскрипції клітинних генів. Продукт гена nef підсилює ефект NRE. але яким чином він досягає цього - загадка.
Складні механізми регуляції розмноження HIV діють не в ізоляції: вони тісно пов'язані з метаболізмом клітини-господаря. Почати з того, що вірус використовує клітинний апарат для транскрипції своїх генів і синтезу білків. Зокрема, клітинні фактори явно грають роль у спалаху реплікації HIV, що відбувається за участю гена tat, коли заражена Т-клітина стимулюється антигеном. Особливості молекулярного "клімату" клітини-господаря також, ймовірно, якось впливають на швидкість розмноження вірусу, яка різна в різних типах клітини.
Можливо, для зв'язку клітинних і вірусних процесів має значення зв'язок клітинних білків з LTR на початку вірусного генома. Послідовності в LTR визначають сайт ініціації транскрипції вірусних генів - стартову точку, в якій починається синтез мРНК. Принаймні вісім білків, які в нормі беруть участь у клітинній транскрипції, зв'язуються з клітинної ДНК в сайте ініціації транскрипції або поруч з ним. Вони відіграють певну роль в процесі транскрипції. Один з білків, який дізнається ініціаторние послідовності, грає специфічну роль в Т-клітинах та інших лімфоцитах. Цей білок активується, коли лімфоцит стимулюється антигенами і починає розмножуватися. Вважається, що він сприяє розмноженню клітини, підсилюючи транскрипцію. Як з'ясувалося, при стимуляції заражених Т-клітин посилюється зв'язування цього білка з геномом провіруси. Таким чином активація цього білка може бути одним з шляхів прискорення розмноження HIV при стимуляції Т-клітини.
Ймовірно, набір клітинних факторів, що діє на вірусний геном, варіює в залежності як від умов, так і від типу клітини-господаря. Деякі клітини, перебуваючи в стані спокою. Чи можуть просто не мати білків, необхідних дЩоб ініціалізації транскрипції, так що інфекція залишається прихованою. В інших клітинах швидкість розмноження вірусу може бути обмежена з-за низької концентрації ініціаторних факторів або через надлишок білків, що інгібують синтез мРНК. Таким чином, клітина-господар за допомогою власних факторів транскрипції створює молекулярне оточення, що впливає на регуляторні механізми HIV.
Після того, як в результаті дії описаних вище механізмів почалося виробництво вірусних частинок, в гру вступає останній ген. Цей ген, названий vif (від англ. Virion infectivity factor - фактор інфекційності віріона), кодує невеликий білок, який виявляється в цитоплазмі заражених клітин і навколо них у міжклітинної середовищі, а так само у вільних вірусних частинок. Білок - продукт гена vif якимось чином підсилює здатність відокремлені віріона заражати інші клітини. У штамів HIV з мутаціями, інактивуючої vif, віріони мають нормальний вигляд, містять повний набір РНК і ферментів, але заражають клітини набагато менш ефективно.
3. Етапи зараження клітини вірусом СНІДу
Перший крок будь-якої вірусної інфекції - зв'язування вірусної частинки з компонентом мембрани заражаємо клітини. Для HIV роль такого рецепторного компонента відіграє білок, званий антигеном CD4. (Антиген - це молекулярна структура, яка пізнається антитілом.) З цього випливає, що розподіл CD4 в організмі має відповідати тропізми HIV, тобто спектру клітин і тканин, уражаються вірусом. Антиген CD4 зустрічається головним чином на лімфоцитах, званих Т-4 хелперами, які є важливим елементом імунної системи, а також на деяких інших клітинах.
Як було встановлено, зв'язування відбувається, якщо CD4 взаємодіє з білком оболонки вірусу gp120, який розподілений на зовнішній поверхні мембрани. Вдалося визначити специфічні фрагменти молекул CD4 і gp120, що беруть участь у зв'язуванні. Ці результати відкривають можливість подвійної боротьби з HIV: перешкоджати взаємодії вірусу з клітинним рецептором CD4 можна блокуючи сам рецептор або екрануючи вірусний білок gp120.
Внаслідок ураження клітин крові, які несуть антиген CD4, особливо Т-4 лімфоцитів, за його концентрації можна судити про зараження СНІДом. У клітинних культурах можна так само спостерігати ще один дуже зручний для дослідження ознака зараження - освіта багатоядерних сінцітіев. Сінцітій є гігантською клітину, що містить безліч ядер всередині однієї мембрани. Він формується в результаті злиття клітин, заражених HIV, зі здоровими клітинами, що несуть молекули рецептора.
Найбільш суворе доказ такого механізму взаємодії вірусу з клітиною став експеримент, проведений в 1984 р. в Колумбійському університеті США. Вдалося перенести ген, що кодує CD4, в клітини HeLa - лінію клітин ракової пухлини шийки матки. Ці клітини не містять CD4 і в нормі не заражаються HIV. Тоді як змінені клітини HeLa, що несуть CD4, можуть бути заражені HIV, після чого вони швидко зливаються в гігантські сінцітіі.
Цей експеримент дав, крім того, один несподіваний результат, який до цих пір повністю не пояснений. Людський ген CD4 був введений в мишачі Т-клітини, які тим самим придбали здатність виробляти відповідний білок. Частинки HIV зв'язувалися з цими зміненими клітинами, проте ознак інфекції не було: не утворювався ні сінцітій, ні інфекційні вірусні частинки. Це було дивно, так як мишачі клітини взагалі-то здатні підтримувати розмноження HIV за деяких умов. Як видно, мишачі клітини не можуть бути заражені частками HIV навіть у присутності рецепторів HIV. До зараження мишачих клітин також виявилися нездатні деякі споріднені віруси. Ці факти дозволяють припускати, що необхідний ще якийсь компонент клітинної поверхні для того, щоб вірус, прикріпили до клітинній мембрані зміг проникнути всередину клітки. Природа такого додатковий фактор поки не ясна.
Зв'язування вірусного gp120 з клітинним CD4 - це тільки перший етап проникнення вірусу в клітину. Наступні етапи поки менш зрозумілі. Наприклад, як потрапляє в клітку вірусний генетичний матеріал? Проста і найбільш ймовірна можливість полягає в тому, що оболонка віріона зливається з клітинною мембраною і вміст вірусної частинки (включаючи генетичний матеріал) виявляється всередині клітини. Інший можливий шлях - ендоцитоз, тобто освіта невеликого впячіванія клітинної мембрани, яке потім відокремлюються всередину, перетворюючись на замкнутий мембранний бульбашку. Бульбашка повністю оточує вірусну частинку і переносить її всередину клітини. Там мембрана, що утворює бульбашка (тепер він називається ендосомой), закісляется. Це призводить до конформаційних змін, злиття її з вірусною мембраною і звільненню вмісту вірусної частки у внутрішньоклітинний простір.
Незалежно від того, що насправді відбувається - пряме злиття або ендоцитоз - вірусна мембрана має зазнати злиття з клітинної. Як же це здійснюється? Згідно з однією з гіпотез, видається цілком правдоподібною, зв'язування gp120 з CD4 викликає зміну конформації білка gp120, внаслідок чого оголюється частину іншого білка оболонки, gp41, в нормі прихованого під молекулою gp120. Ця область gp41 гідрофобна і тому повинна впроваджуватися в мембрану, а не залишатися зовні, у водному середовищі, що оточує клітину. Опинившись відкритою, гідрофобна область gp41 взаємодіє з прилеглою частиною клітинної мембрани і індукує її злиття з вірусною мембраною. Поки не ясно, чи потрібен для зв'язування з gp41 ще якийсь рецептор клітинної поверхні, крім CD4, або ж gp41 сам впроваджується прямо в клітинну мембрану.
Після того, як HIV проник в клітинну середовище і його генетичний матеріал інтегрувався в клітинний геном, він може залишатися неактивним і ніяк себе не виявляти, а може і виявитися одним з трьох способів.
По-перше, вірусний геном може викликати персистируючу інфекцію; при цьому утвориться деяка кількість вірусних частинок, але клітин гине небагато. По-друге, інфекція може призвести до утворення сінцітія, який незабаром гине. Поява сінцітіев - головний результат впливу HIV на культуру клітин. В організмі інфікованої людини сінцітіі іноді можна спостерігати на пізніх стадіях інфекції * особливо в мозку). Незрозуміло, проте, чи вони відіграють якусь роль у ранньому патогенезі СНІДу.
Третій імовірний результат зараження HIV - швидка загибель клітин без освіти сінцітіев. Яким чином HIV вбиває клітини поки не ясно. Можливо, якісь з продуктів, кодованих генами HIV, володіють прямим токсичною дією. Можливо, також руйнування клітинної мембранної системи з-за того, що впровадити в неї gp120, синтезований в результаті інфекції, взаємодіє з наявними в мембрані CD4. Доля зараженої клітини залежить і від імунної відповіді, оскільки імунна система здатна пізнавати вірусні білки на поверхні заражених клітин і вбивати ці клітини.
Розподіл заражених HIV клітин в організмі зумовлено головним чином тим, як розподілені клітини, що несуть CD4. Спочатку цей антиген був ідентифікований за його присутності на певних Т-лімфоцитах. І дійсно, його нормальні функції, очевидно, в основному пов'язані зі складною мережею взаємодій між клітинами імунної системи.
Т-лімфоцити, що несуть CD4, здатні взаємодіяти з клітинами, що представляють антигени. Ці останні знаходять чужорідні антигени, і експонують їх на своїй клітинній мембрані разом зі специфічними білками - глікопротеїнами MHC класу II (від англ. Major Histocompatibility Complex - головний комплекс гістосумісності). Коли Т4-хелпери дізнаються комбінацію антигену і глікопротеїну MHC II класу, вони ініціюють імунну відповідь проти чужорідних або заражених клітин, які несуть цей антиген. Вважається, що взаємодія між антигенами CD4 на Т-клітинах і глікопротеїнами MHC II класу на клітинах, що представляють антиген, важливий елемент контакту цих клітин.
Як зараз відомо, Т-лімфоцити не єдині клітини з вбудованим в мембрану антигеном CD4. Не менш 40% моноцитів периферичної крові (ці клітини є попередниками макрофагів - клітин-"сміттярів") і деякі клітини, що представляють антиген в лімфатичних вузлах, шкірі та інших органах, а також приблизно 5% всіх В-клітин організму (ці клітини виробляють антитіла ) несуть CD4 і можуть бути заражені HIV.
Але деякі види клітин заражаються HIV в культурі, а просто виділити в них CD4 не вдається. До них відносяться гліальні клітини головного мозку, клітини ряду злоякісних пухлин мозку, а також певні лінії клітин з ракових пухлин кишечника. Однак, хоча ці клітини і не виробляють CD4 в експериментально визначених кількостях, вони містять трохи інформаційної РНК, що кодує білок CD4, а отже, здатні синтезувати і сам CD4. Мабуть, для зараження HIV достатньо навіть дуже малої кількості CD4.
4. Препарати, що протистоять СНІДу
Усяке терапевтичний засіб проти інфекції незалежно від природи патогена - чи то вірус, бактерія, грибок або найпростіше - має або викликати загибель патогена, або припиняти його розмноження. При цьому препарат не повинен завдавати істотної шкоди зараженого організму. Як правило, такі ліки виконують своє завдання, діючи на біохімічні процеси, характерні тільки для патогенів. У випадку бактерій це досягається порівняно просто, так як за структурою і метаболізму клітини бактерій і клітини організму ссавця сильно розрізняються. Наприклад, пеніцилін порушує синтез клітинної стінки бактерій, а на клітини ссавців, у яких немає такої стінки, він не діє.
З вірусами ситуація набагато складніше. Віруси є просто генетичний матеріал, одягнений в оболонку з глікопротеїнів і ліпідів. Вони не здатні розмножуватися самостійно і замість цього заражають клітини іншого організму і узурпують їх апарат біосинтезу, який і забезпечує відтворення вірусу. Коли відбувається активна реплікація вірусу, часто буває важко розрізнити вірусні білки, які взаємодіють з кліткою і білки самої клітини. Тісний зв'язок багатьох етапів життєвого циклу вірусу з метаболізмом клітини-хазяїна ускладнює створення препаратів, які вибірково пригнічують реплікацію вірусу і в той же час мінімально впливають на клітину.
Суттєво також, що практично будь-який препарат (у тому числі і пеніцилін) володіє в тій чи іншій мірі побічною дією і токсичністю. Тому завжди потрібно враховувати не тільки ефект впливу на патоген, а й шкоду, яку завдають організму людини. Найважливішою характеристикою потенційного терапевтичного препарату є його "терапевтичний індекс": відношення токсичної дози до ефективної дози. Однак у випадку хвороб, що становлять загрозу для життя, таких як СНІД, припустимо використовувати і препарати з порівняно низькими значеннями терапевтичного індексу щонайменше, поки що не створено досконаліші.
Складний життєвий цикл дозволяє HIV заражати клітини імунної системи і вислизати від їх дії. Але для боротьби з інфекцією така складність може бути не тільки лихом, а й благом, оскільки вона надає багато можливостей для дії противірусних засобів.
Перша стадія - зв'язування вірусу з клітиною (див. вище). Існує кілька можливостей пригнічувати цей процес. Можна отримати антитіла, які взаємодіють з відповідною частиною оболонки вірусу і тим самим нейтралізують здатність gp120 зв'язуватися з CD4. Можна з'єднати такі антитіла з молекулами якого-небудь токсину, тоді вони, зв'язуючись із зараженими клітинами, наприклад з макрофагами, що містять вірус і виробляють його білки, будуть вбивати їх. Можна отримати і антитіла до CD4, але цей підхід потенційно небезпечний, тому що такі антитіла будуть атакувати і здорові клітини імунної системи організму. Тому дослідження спрямовані головним чином на отримання антитіл до gp120.
Отримати ефективні антитіла, що нейтралізують gp120, з ряду причин важко. Не всі антитіла проти gp120 будуть блокувати ключовою ділянку зв'язування з CD4. У хворих, в організмі яких в процесі нормальної реакції на інфекцію HIV утворюються нейтралізуючі антитіла (як правило, лише в малій кількості), СНІД проте розвивається. Певного вирішення цієї проблеми поки що немає. Можливо одна з причин - висока швидкість мутірованія HIV. У деяких виникають в організмі варіантів вірусу може бути змінений глікопротеїн оболонки, і він не буде нейтралізовуватися наявними антитілами. Друга можлива причина полягає в тому, що молекули цукрів. Що входять до складу глікопротеїну оболонки HIV, схожі з аналогічними структурами на поверхні клітин людини, тому на оболонці вірусу недостатньо унікальних ділянок, які будуть розпізнаватися імунною системою як "чужі" і з якими могли б зв'язуватися антитіла. По-третє, в молекулах gp120 ділянку зв'язування CD4 розташований у поглибленні і тому мало доступний. Нарешті, не виключено, що важливі для зв'язування ділянки gp120 відкриті тільки в момент зв'язування, а більшу частину часу недоступні для імунної системи.
Щоб подолати ці труднощі застосовується кілька підходів. Один полягає в отриманні моноклональних антитіл. Для цього потрібно ідентифікувати антитіла, які дійсно зв'язуються з ключовим ділянкою вірусного білка, клонувати виробляють їх лімфоцити і вирощувати ці клітини in vitro.
Другий підхід використовує антіідіотіпіческіе антитіла, тобто "Антитіла проти ідіотіпа"; в даному випадку це антитіла проти антитіл до CD4. Ідея полягає в тому, що молекула моноклонального тіла проти CD4 за структурою може імітувати ділянку зв'язування CD4 в молекулі gp120, і тому антитіло (антіідіотіп) до цієї ділянки має зв'язуватися з gp120.
Третій підхід полягає у створенні розчинної, тобто не пов'язаної з клітинами форми CD4, яка здатна взаємодіяти з HIV, займаючи його ділянки зв'язування і тим самим перешкоджаючи його зв'язування з CD4 на поверхні Т4-хелперів. В даний час розчинна CD4 був отриманий методами генної інженерії. Цей препарат дійсно блокує ділянки зв'язування CD4 на оболонці HIV і пригнічує зараження Т-клітин. Ймовірно, вірусу важко буде змінитися таким чином, щоб втратити спорідненість до CD4, зберігаючи при цьому здатність заражати інші клітини.
У майбутньому, можливо, вдасться створити "химерні" молекули, у яких об'єднаються ділянка молекули CD4, що взаємодіє з HIV, і константних частина молекули імуноглобуліну людини. Такі антитіла "на замовлення" повинні володіти рядом переваг. Певні ділянки важких ланцюгів імуноглобуліну здатні активувати інші компоненти імунної системи, приводячи до руйнування вірусу. Химерна молекула діяла б подібно поліцейському з шукач: частина CD4 буде вистежувати вірус, а частина імуноглобуліну - викликати підмогу для нападу. Крім того, химерні молекули можуть довше перебувати в кров'яному руслі, ніж просто розчинна CD4, тому що певні імуноглобуліни володіють великим часом життя в кровотоку.
В основі розглянутих підходів лежить використання складних біологічних молекул, які зв'язуються з поверхневим глікопротеїном вірусу. Проте подібним чином можуть діяти й інші молекули. Було показано, що деякі великі негативно заряджені з'єднання, що містять сульфатні групи, пригнічують реплікацію HIV. Прототипом може послужити декстрансульфат, молекули якого з молекулярною масою в межах 7000 - 8000 дальтон пригнічують реплікацію HIV in vitro. Один з механізмів дії декстрансульфата, ймовірно, є пригнічення зв'язування вірусу. Встановлено також, що це з'єднання in vitro заважає утворенню сінцітіев, чого цілком можна очікувати для агента, що блокує зв'язування вірусу. Однак, токсичні та ефективні дози цього препарату поки недостатньо вивчені.
Коли HIV зв'язався з кліткою, вірусна мембрана зливається з клітинною мембраною, і вміст віріона потрапляє в цитоплазму. Тут його серцевинні білки частково видаляються, оголюючи РНК. Антитіла до gp41 могли б запобігати проникнення вірусу в клітину. Можливі також реагенту, що перешкоджають процесу "роздягання" РНК.
Однак як мішень для впливу на вірус найбільшу увагу привернув до себе наступний етап життєвого циклу вірусу - синтез вірусної ДНК зворотного транскриптазою. Тут бачаться особливі переваги, оскільки цей етап характерний тільки для ретро вірусів і не має отношен до клітини-господаря. У пошуках засобів проти ретровірусів з самого початку приділялася першорядну увагу цьому завданню. Зокрема досліджувалися з'єднання, звані дідезоксінуклеозідамі, які є інгібіторами зворотної транскриптази. Це аналоги нуклеозидів, тобто за структурою вони дуже близькі до нуклеотидах, службовцям мономерами ДНК і РНК.
Одне з таких з'єднань - 3 `-азид-2`, 3 `- дідезоксітімідін, або азидотимідин. Він був синтезований в 1964 р. і спочатку призначався в якості протиракового препарату. У 1985 р. було виявлено, що він є потужним інгібітором розмноження HIV в культурі Т-лімфоцитів в концентраціях 1 - 5 мкМ (0,25 - 1,25 мкг/мл). При цьому не спостерігалося помітною токсичності азидотимідин при концентраціях 20 - 50 мкм або менше. Незабаром було показано, що азидотимідин ефективно діє у хворих на СНІД при концентрації в організмі 1 - 5 мкМ, як і передбачалося на підставі дослідження в культурі Т-клітин.
Яким чином це з'єднання захищає клітини від HIV? Суть полягає в тому, що воно близьке за структурою до нуклеозиди тимідину, що входить до складу ДНК. У клітці азидотимідин піддається ферментативного фосфорилювання: до нього приєднується ланцюжок з трьох фосфатних груп. Азидотимідин трифосфат і є активна форма препарату. (Вводити в організм безпосередньо азідотімідінтріфосфат не можна, тому що клітини не здатні його поглинати.) Азідотімідінтріфосфат є аналогом тімідінтріфосфата - одного з мономерів ДНК. Мабуть, механізм придушення синтезу вірусної ДНК двоякий: конкурентне інгібування і термінації синтезу ланцюга ДНК.
Конкурентне інгібування полягає в тому, що азідотімідінтріфосфат зв'язується зі зворотним транскриптазою в тій ділянці, який в нормі пов'язує звичайні Нуклеозидтрифосфат. При термінації синтезу ланцюга ДНК зворотній транскриптаза помилково включає азідотімідінтріфосфат в зростаючу ланцюг вірусної ДНК замість тімідінтріфосфата, але приєднання наступного нуклеотиду неможливо, тому що в молекулі азідотімідінтріфосфата немає гідроксильної групи, яка необхідна для утворення зв'язку з наступним нуклеотидів. Вірус не в змозі виправити цю помилку і синтез грудня припиняється.
Інші дідезоксінуклеозіди, що володіють активністю проти HIV, діють, мабуть, таким же чином. Всі ці сполуки виявилися ефективними проти ряду ретровірусів (власне всіх, які вивчалися на цей предмет), але тільки у формі трифосфату. Тому їх ефективність як терапевтичних засобів визначається тим, наскільки легко вони проникають в клітини і фосфорилюється клітинними ферментами, званими кіназа. Наприклад, фосфорилювання одних дідезоксінуклеозідов відбувається краще, ніж інших. Так 2 `, 3` - дідезоксітімідін, який відрізняється від азидотимідин тим, що замість азідогруппи (N3) є атом водню, у клітинах людини погано фосфорилюється і тому менш ефективний проти HIV, ніж азидотимідин. Крім того, процес фосфорилювання цих сполук розрізняється у різних видів, так
