Холера

Етіологія

Збудник холери відноситься до роду Vibrio. Це вигнута, грам, не утворює спори паличка, яка має один полярно розташований джгутик. За чутливості до специфічного фагу (IV тип по Мукерджі) розрізняють два біотипів холерного вібріона - класичний (збудник азіатської холери) і Ель-Тор. Кожен з них по 0-антигену підрозділяється на 3 серологічних типу: Огава (АВ), Інаба (АС) і рідко зустрічається Гікошіма (АВС), що деякі автори розглядають як варіант серотипу Огава. Н-антиген холерних вібріонів - спільний для всіх серотипів.

Холерні вібріони утворюють термолабільних екзотоксин - холероген (відносна молекулярна маса - 82-84 кд). Він складається з комплексу важкої субодиниці А, що активує аденілатциклазу, і субодиниці В, представленої 4-6 легкими ланцюгами і забезпечує зв'язування холери-гена з рецепторами епітеліальних клітин тонкої кишки.

Біолого-патогенетичні властивості збудника

Минувши шлунковий бар'єр, вібріони потрапляють у тонку кишку зі сприятливою для них середовищем і заселяють (колонізують) поверхня кишкового епітелію. Процес колонізації включає в себе хемотаксис вібріонів до шару слизу, що покриває верхівки ворсинок тонкої кишки, проникнення через цю слиз, адгезію до рецепторів на покреслений облямівка кишкових епітеліоцитів і розмноження на поверхні епітелію ворсинок і крипт. У хворих на холеру збудник може бути виявлений на всьому протязі шлунково-кишкового тракту. У шлунку при рН не менше 5,5 вібріони не виявляються, в калі їх концентрація досягає 106-107 (іноді ^-Ю9).

розмножилися до певної концентрації, збудник викликає захворювання за допомогою виробляється їм холерогена. Основну роль у розвитку хвороби відіграють вібріони, які знаходяться в тісному зв'язку зі слизовою оболонкою тонкої кишки, тому що вони виділяють холероген в безпосередній близькості від його рецепторів на епітеліальних клітинах - ган-гліозіда GM1. Після прикріплення холерного токсину до гангліозид субодиниця А проходить через мембрани всередину епітеліальної клітини, де відбувається вивільнення фрагмента А1. Останній ензиматичні розщеплює НАД і передає його АДФ-рібозную половину на регуляторний протеїн аденілатціклазного комплексу, що знаходиться на внутрішній стороні мембрани епітеліоцитів. У результаті відбувається активація аденілатциклази, що приводить до підвищення вмісту цАМФ - одного з внутрішньоклітинних стимуляторів кишкової секреції. Зв'язування холерного токсину з рецепторами на епітеліальних клітинах відбувається надзвичайно швидко (через 1-3 хв); біохімічні нзмененія в клітці є незворотними.

виникає захворювання супроводжується втратою величезних кількостей рідини з низьким вмістом білка і високою концентрацією іонів натрію, калію, хлоридів, гідрокарбонатів. Ця рідина за складом відрізняється як від ексудату, так і від транссудату і ближче до складу кишкового секрету.

Сприйнятливість

До холерного вібріона сприйнятливі люди різного віку. Найчастіше і важче хворіють на холеру особи, що зловживають алкоголем або перенесли резекцію шлунка. Кислотність шлункового соку відіграє важливу роль у визначенні мінімальної інфікувати дози - в дослідах на добровольцях при нейтралізації шлункового соку гідрокарбонатом натрію кількість вібріонів, необхідних для відтворення специфічного процесу у людини, зменшується з 10 "до 104-10Ь мікробних клітин.

Клінічні особливості

Інкубаційний період при холери триває від 1 до 5 днів. Клінічні прояви холери дуже варіюють, і тяжкість клінічного перебігу визначається ступенем зневоднення. Захворювання зазвичай починається раптово. Першим клінічно вираженим ознакою холери є понос. Типові холерні випорожнення представляють собою водянисту, мутнувато-білувату рідина з плаваючими пластівцями, нагадують за зовнішнім виглядом рисовий відвар і не мають запаху. М'язова слабкість і судоми в литкових м'язах - ранні симптоми холери. Слідом за рідким стільцем з'являється рясна повторна блювота, швидко приводить до декомпенсованому ексікозу. Шкірні покриви стають ціанотичний, холодними на дотик, риси обличчя загострюються, очі й щоки западають. Шкіра кистей рук зморшкувата ( "руки прачки"), голос сиплий, аж до афонії. У хворих з тяжкою формою холери відзначається гіпотермія. Через її сталості термінальна форма холери (IV ступінь дегідратації) отримала назву "алгідная". Алгід (декомпенсованій зневоднення) супроводжується порушенням діяльності основних систем організму - серцево-судинної, дихальної, сечовидільної.

Імунологічна діагностика

Виявлення антигену. Збудник холери і його специфічні антигени (корпускулярний, розчинна, холероген) виявляють у фекаліях, блювотних масах, крові, дуоденальному і кишковому вмісті, жовчному міхурі, в об'єктах навколишнього середовища (змиви з різних предметів), у воді відкритих водоймищ, стічних водах, гідробіонтах та ін

Із сучасних методів індикації антигенів холерного вібріона найбільшого поширення набула РНГА, чутливість якої з антитільний еритроцитарних діагностикумами становить 105-101 'бактерій в 1 мл або 0,04 мкг/мл 0-антигену. При клінічно виражених формах холери, коли в екскрементах хворих міститься величезна кількість вібріонів (10'-109 в 1 мл), пряма дослідження фільтратів прогрітих на водяній бані випорожнень в РНГА з антитільний діагностикумів дозволяє дати відповідь про наявність специфічного антигену вже через 2 - 3 ч. блювотні маси хворих, випорожнення вібріононосітелей і контактних осіб, що містять меншу кількість вібріонів, доцільно досліджувати після попереднього 6-годинного підрощування на 1% пептонов воді. При дослідженні випорожнень і блювотних мас виявилося, що лише в 52% випадків діагноз холери був підтверджений бактеріологічно у хворих, в анамнезі значної частини яких було вказівка на вживання антибіотиків при появі перших ознак захворювання. За допомогою РНГА захворювання холерою вдалося додатково встановити ще у 21% хворих [Поляков И. И. и др., 1973]. При дослідженні випорожнень, вмісту кишечника і жовчного міхура померлих від гострих кишкових захворювань, випорожнень здорових осіб і проб води зазвичай в практичних умовах спостерігали повний збіг результатів серологічного і бактеріологічного методів дослідження, що дозволяє вважати РНГА з антитільний еритроцитарних діагностикумів досить надійним експрес-методом при масовому обстеженні на холеру.

Деякими авторами при індикації специфічних антигенів холерного вібріона віддається перевага РТНГА. Холерні діагностикуми для цієї реакції готують з баранячих або людських О (I) групи еритроцитів, сенсибілізованих холерними 0-антигенами. Чутливість методу - 104-106 бактерій в 1 мл при дослідженні нативних випорожнень і 10'-105 - після попереднього підрощування. Мінімальна кількість 0-антигену, виявляється за допомогою РТНГА, так само 0,04-0,16 мкг/мл. РТНГА дає позитивні результати у 91% хворих на холеру, у 40% ре-конвалесцентов і 12% контактували з хворими, 0-антиген холерного вібріона може бути визначений через 1 міс від початку захворювання у фекаліях у всіх перехворіли на людей, а через 5-6 міс - у половини обстежених, що, очевидно, свідчить про більш тривалої екскреції специфічного антигену в нежиттєздатною формі. Збіг результатів бактеріологічного методу і РТНГА, за різними даними, спостерігається у 63-100% випадків. Наявні матеріали дають підставу вважати за доцільне широке випробування РТНГА.

Позитивну оцінку при діагностиці холери отримав МФА, що дозволяє виявляти холерні вібріони при утриманні їх не менше 10 ° в 1 мл. Використовувати МФА доцільне при дослідженні нативного матеріалу від хворих і трупів. У хворих на холеру позитивні результати за допомогою МФА були отримані протягом 2 годин у 70-90% спостережень при повному збігу з результатами бактеріологічного аналізу. Застосування МФА при дослідженні води і змивів можливо лише після попереднього підрощування або концентрування матеріалу. Представляється перспективним використання іммунотушевой забарвлення холерних вібріонів.

Для виявлення антигенів холерного вібріона застосовують агрегат гемаг-глютінаціонную пробу (АГГ). В основі її лежить використання для агрегації і фіксування білків імунної сироватки на еритроцитах хімічної речовини з групи Діазосполуки у вигляді препарату діазоль чорного С. Еритроцити, сенсибілізовані агрегованими білками холерної 0-сироватки, володіють високою специфічністю і чутливістю. З їх допомогою вдається визначити 0,01-0,005 мкг/мл "цілісного" розчиненого антигену, виготовленого за методом Буавен, і 4000-480 000 клітин холерного вібріона в мікробних суспензії. Це дозволяє вважати АГГ одним з найбільш чутливих імунологічних методів, який виправдав себе під час обстеження людей. За допомогою АГГ 0-антиген холерного вібріона виявлено у 88,2% хворих на холеру і 78,3% вібріононосітелей, причому в титрах 1: 40 і вище 0-антиген визначений у 76,1% хворих і у 57,1% вібріононосітелей. Серологічно активний компонент ендотоксин виявляють у високих титрах, частіше у важких хворих і в перші 3-5 днів хвороби. У період реконвалесценції кількість антигену в сироватці крові знижується, але у 33% хворих він зберігається до 20-25 днів [Покровський В. І., Малєєв В. В., 1978]. Для визначення холерогена, крім біопроб, використовують та імунологічні методи - РНГА і АГГ. У дослідах з безклітинним супернатантамі культур холерних вібріонів поріг чутливості обох методів становив 0,01-0,005 мкг/мл.

антитільний відповідь. Інфікування людини холерним вібріоном веде до місцевого і системного відповіді. Клінічно виражене захворювання холерою супроводжується зростанням рівня сироваткових антимікробних (аглютинативна і вібріоцідних) і токсіннейтралізующіх антитіл, як правило, вже до кінця 1-го тижня після появи симптомів хвороби. Аглютиніни до холерного вібріона до 4-го дня захворювання виявляють у 35,7% хворих, на 8-й день - практично у всіх (98,6%). Рівень аглютиніни досягає максимуму на 2-му тижні захворювання (на 11-15-й день титри, рівні 320 і вище, реєструють у 71% хворих), а потім різко падає. Титри вібріоцідних антитіл також збільшуються до 8-10-го дня захворювання і після 3 тижнів (іноді дещо раніше) починають знижуватися, досягаючи початкового рівня через 2-7 міс. У дітей до 4 років падіння вібріоцідних титру антитіл відбувається швидше, ніж у старшій віковій групі (5-14 років), досягаючи вихідного рівня вже через 3 міс. Динаміка титрів токсіннейтралізующіх антитіл має подібний характер - з'являючись в кінці 1-го тижня, вони досягають максимуму між 2-й і 3-й тижнями, а з 21-го дня знижуються.

Зміст сироваткових IgM і I gG протягом хвороби можна порівняти з аналогічними показниками в контрольній групі, хоча є дані про збільшення рівня IgM у гострій стадії і зниженні його в період реконвалесценції. Деякі дослідники не встановили різниці у вмісті IgA при надходженні хворих у стаціонар і в стадії реконвалесценції; інші відзначають підвищення його рівня у перехворіли [Покровський В. І., Малєєв В. В., 1978; Адамов А. К., 1981]. Сказане не дає достатніх підстав стверджувати, що зміна рівня сироваткових імуно-глобулінів при холері носить специфічний характер.

Специфічна активність імуноглобулінів різних класів залежить від форми та тривалості інфекційного процесу при холеру. Антитіла в сироватці крові перехворіли належать, переважно до IgM. У вібріононосітелей продукуються, навпаки, високоактивні IgG-антитіла. Активність IgA-антитіл в сироватці крові вібріононосітелей незначно вище в порівнянні з хворими. Чим важче протікає захворювання, тим вище активність продукуються антитіл, що відносяться до іммуноглобулі-нам класу М, і нижче активність IgG-антитіл.

Найпростішим і легко відтворюваним методом визначення антимікробних антитіл є РА з живими культурами холерного вібріона, але чутливість цієї реакції обмежена. Діагностичні титри (1:

: 40 і вище) з'являються, як правило, до кінця 1-го тижня захворювання, але лише у 19,7% хворих на холеру. Дослідження парних сироваток, отриманих з інтервалом 7-10 днів при наявності 4-кратного і більше наростання титрів антитіл збільшує частоту позитивних результатів до 89,6%

Набагато більше значення приділяється в даний час виявлення виб-ріоцідних антитіл. Вібріоцідний тест (Вт) є більш чутливим у порівнянні з РА, даючи високі титри, особливо у реконвалесцентів холери (до 1: 100 000). Треба, однак, мати на увазі, що вібріоцідние антитіла (титри до 1: 1000) можуть виявлятися і в сироватках невакцинованих здорових людей, ніколи не хворіли на холеру, і в осіб, інфікованих бруцели, Yersinia enterocolitica 09, цітробактером. Аглютиніни щодо менше чутливі до такої неспецифічної стимуляції. Як і РА, Вт дозволяє реєструвати підйом специфічних антитіл (4-кратний і більше) у 90-95% хворих з бактеріологічно підтвердженим діагнозом холери [Watanabe Y., 1974].

В якості антигену в РА і ВТ використовують холерні вібріони обох серотипів. При необхідності користуватися одним перевагу віддають серотипу Огава, який частіше, ніж Інаба, вступає в перехресні реакції з гетерологічним серотипів холерного вібріона і рідше дає неспецифічні реакції з мікробами інших родин.

Хоча ці серологічні реакції є найбільш чутливими, необхідність застосування в них живих вібріонів створює певні труднощі при масових обстеженнях. Тому найбільшої уваги заслуговують антигенні еритроцитарні діагностикуми, які дозволили впровадити в практику РНГА і РТНГА. Ці реакції володіють достатньою чутливістю і специфічністю, дозволяючи виявляти антитіла у хворих і перехворіли на холеру в титрах 1: 640-1: 1280. Спостерігаються відмінності в титрах при паралельному використанні РНГА і Вт обумовлені головним чином відмінностями у фізико-хімічної природи виявляються антитіл: IgG-антитіла більш ефективно виявляють бактерицидну методом (Вт), IgM-антитіла - в РНГА.

Для виявлення антитоксинів в сироватках застосовують РН, результати якої враховують по відсутності холерогенного ефекту в перев'язаною петлі тонкої кишки дорослих кроликів, у кишечнику крольчата-шмаркачів, на шкірі морських свинок (кроликів) в дослідах in vivo і по відсутності цітото-ного дії в культурі клітин СНТ і Y-1 - в дослідах in vitro. Найбільш стандартизовані шкірна проба і модель перев'язаною кишкової петлі. У 73% хворих в ендемічних по холері районі за допомогою шкірної проби виявлено діагностично значуще 9-кратне і більше збільшення титрів токсіннейтралізующіх антитіл. Частота сероконверсії вібріоцідних антитіл і аглютиніни в цій же групі хворих була вищою і склала 98 і 88% відповідно [Watanabe Y., 1974].

Аналіз титрів антитоксичних антитіл при діареї нехолерной етіології показав, що в пробах сироваток, взятих в гострій стадії хвороби, вони коливалися від <<10 до 270, але значуще наростання титрів в період рекон-валесценціі було відмічено лише у 2, 5% хворих. Маючи високу специфічність, метод визначення токсіннейтралізующіх антитіл декілька поступається по чутливості методів визначення вібріоцідних і аглютинативна антитіл. Високої роздільною здатністю володіють ІФМ і РИМ, що використовують мічений ензимом або радіоактивною речовиною антиген і дозволяють визначати зв'язування 0,001-1 нг імунного білка досліджуваної сироватки.

Титри антитоксичних антитіл, що реєструються ІФМ, вище титрів, які визначаються за допомогою внутрішньошкірного тесту, що обумовлено відмінностями в виявляються класах імуноглобулінів: шкірний тест документує нейтралізуючу активність тільки IgG-антитіл, ймовірно, в силу їх більшої авідності, у той час як ІФМ реєструє і рівень IgM-антитіл.

Таким чином, вивчення титрів і динаміки наростання циркулюючих антитіл у сироватці крові хворих при холері розширює можливості її лабораторної діагностики. Ретроспективний діагноз холери з більшим ступенем імовірності може бути встановлений в РА і ВТ, але лише на підставі вивчення парних сироваток хворих. Визначення рівня антитоксинів корисно в тих випадках, коли необхідно виключити попередню специфічну вакцинацію, тому що антитіла цього типу не індукуються існуючими холернимивакцинами і дуже рідко зустрічаються у здорових людей. Однак підйом антитоксичних титрів у хворих на фоні діагностично значущою сероконверсії вібріоцідних і аглютинативна антитіл підвищує достовірність серологічної діагностики холери.

Виникнення патологічного процесу, викликаного холерними вібріонами, веде до появи антитіл до цих мікроорганізмів і в зовнішніх секрети травного тракту - інтестинального рідини (ко-проантітела) і слині. Відмінною рисою динаміки копроантітел є їх рання поява (у 72% - на 2-3-й день хвороби, у 100% - на 4-й день) та швидке зникнення з кишкового вмісту. У інтестинального рідини видужуючих від холери людей антитіла проти вібріонів відносяться до імуноглобулінів A, G і М, але переважаючими є SIgA-антитіла, кількість яких у хворих на холеру зростає приблизно в 30 разів, але становить близько '/ 4 того, що спостерігається у хворих діарейним захворюваннями нехолерной етіології. Останнє пов'язано з адсорбцією SIgA на холерний вібріон, що призводить до стійкого зниження кількості вібріонів в калі хворих і скорочує тривалість їх виділення з кишечника. Концентрація цього імуноглобуліну і час його появи в кишковому вмісті не пов'язані з сироватковим IgA. Кількість IgG-і IgM-антитіл в кишковому вмісті реконвалесцентів холери також збільшується (в 5-7 разів), але у фекаліях антитіла класу IgM не виявляють.

Для виявлення антитіл в інтестинального рідини і фекаліях хворих можуть бути використані Вт, РИМ з холерними антигенами, міченими радіоактивним йодом, непрямий флюоресцентної-серологічний метод. Наростання специфічних антитіл вказує на наявність захворювання на холеру. Однак кишково-копрологіческая діагностика холери ще недостатньо розроблена.

У слині хворих і вібріононосітелей підвищений рівень IgA і IgG. Одночасно з'являються і специфічні антитіла (аглютиніни), зміст яких у хворих на холеру вище, ніж у віброноносітелей (30 АЕ і 14 АЕ відповідно). Діагностичний титр специфічних аглютиніни слини може виявитися значно нижче сироваткового.

Визначенню стану підвищеної чутливості при холері в реакції ГСТ присвячені поодинокі праці. Описано позитивні алергічні реакції у 89% перехворіли на холеру і вібріононосітелей (за відсутності їх у контрольній групі) у відповідь на внутрішньошкірне введення алергену з убитих холерних вібріонів. Однак наявних даних недостатньо, щоб висловити судження про алергічної перебудови організму при холеру або про діагностичної значущості застосовуваних тестів.

Імунітет

Після хвороби в людини виробляється виражений імунітет, який зберігається тривалий час, тому випадки повторних

захворювань холерою вкрай рідкісні. Досліди на добровольцях показали, що протягом 3 років (термін спостереження) люди, які перехворіли на холеру в результаті експериментального зараження, залишалися стійкими до повторного зараження холерними вібріонами [Levine M. et al., 1981].

Основна роль у імунітет до холері належить антитілам, продукуються місцево (у кишці), хоча певний внесок у захист вносять циркулюючі антитіла при високих концентраціях їх, коли вони проникають в просвіт кишки з крові, що підтверджено експериментами на тваринах. Більш високий рівень захисту спостерігається при синергічну дію антибактеріальних та антитоксичних антитіл в кишці. Основна роль антибактеріальних SIgA полягає в тому, щоб перешкоджати хемотаксису вібріонів до епітелію та їх прилипання до поверхні слизової оболонки кишечнику в результаті блокуючого дії на структури для прилипання (ліганди) на поверхні бактеріальних клітин. Зниження колонізації та адгезії холерних вібріонів сприяє швидшому їх виведенню з кишечника при перистальтики і тим самим зменшує можливість приживлення збудника в кишковому тракті.

Дія кишкових IgA-антитіл проти холерогена зумовлено головним чином блокадою його В-субодиниці, що перешкоджає зв'язування токсину з гангліозид GM1 на поверхні епітеліоцитів. Антитіла, що блокують токсичний сайт на А-субодиницею холерогена, роблять менший захисну дію.

Список використаної літератури

Л.Б. Хазенсон, Н.А. Чайка: Імунологічні основи діагностики і епідемологіческого аналізу кишкових інфекцій. "Медицина", 1987.

В.Д. Тімаков, В.С. Левашов, Л. Б. Борисов: Мікробіологія. "Медицина", 1983.