Одноклітинні альтруїсти

А. В. Гордєєва, Ю. А. Лабас

Альтруїзм (від лат. Аlter - інший) - моральний принцип, що полягає в безкорисливому служінні іншим людям, в готовності жертвувати для їхнього блага особистими інтересами. Таке визначення альтруїзму дав французький філософ Огюст Конт. "Vivre pour altrui "(жити для іншого) має російський аналог:" Сам гинь, а товариша виручай ".

Альтруїстичне поведінка властива не лише людям, але і вищим тваринам. Зазвичай тварини виявляють альтруїзм, попереджаючи побратимів про небезпеку. Особа, яка подала сигнал до втечі, часто привертає до себе увагу хижака і стає його жертвою.

Виявилося, що альтруїсти зустрічаються на всіх рівнях організації живої матерії, починаючи з клітинного. Заради блага організму гинуть не тільки окремі клітини, а й цілі органи. Цей процес ми бачимо кожного разу, коли спостерігаємо перетворення пуголовків в жабенят, ловимо ящірок або гуляємо по осінньому лісі. Альтруїзм властивий, наприклад, клітинам яблучної плодоніжки. Адже якщо б всі яблука залишалися на гілках, як би вони розмножувалися? Запрограмована смерть клітин отримала назву "апоптоз", що в перекладі з грецького означає "Листопад".

В останні роки з'ясувалося, що здійснюють самогубство і одноклітинні організми. Які в них механізми і призначення цього процесу? Як клітини "Навчилися" організовано гинути "за командою" і за якою саме? Цим питань і присвячена наша стаття. Але спочатку розглянемо, навіщо, чому і яким чином здійснюють самогубства клітини багатоклітинних.

Навіщо і чому

Для чого багатоклітинного організму може знадобитися загибель окремих його клітин? Приклади її використання на благо цілого організму ми вже наводили, коли говорили про осінніх листах і яблуках, про хвостах пуголовків і ящірок. Білі кров'яні клітини - макрофаги - заковтують хвороботворних бактерій і, роблячи самогубство, вбивають їх разом з собою. Освіта пальців у ембріона походить від того лише, що гинуть клітини в міжпальцевих перегородках. Коли клітини сполучної тканини починають перетворюватися на ракові, здорові сусідні клітини примусово відправляють їх в апоптоз.

Зрозуміло, не завжди запрограмована смерть клітин приносить явну користь. В окремих випадках, таких як масова загибель ще не сформувалися яйцеклітин в яєчниках ембріонів, її призначення незрозуміло. Апоптоз клітин головного мозку при хвороби Альцгеймера (старече слабоумство) явний завдає шкоди організму. Але в переважній більшості випадків апоптоз відповідальний за формообразовательние процеси, за позбавлення від клітин зі зміненим генетичним матеріалом або заражених. Отже, для нормальної життєдіяльності він дійсно необхідний.

Як відрізнити клітку-самогубця? Такі клітини відокремлюються від позаклітинного матриксу, їх мембрани зморщуються, ядра стискаються, молекули ДНК рвуться на дрібні шматочки і в підсумку утворюються так звані апоптозние тільця - мембранні пухирці з клітинним вмістом. Беручи фатальне рішення, клітина завчасно сама готує себе до поховання: викликає "ритуальних агентів", роль яких виконують макрофаги або сусідні клітини. Один з ліпідів внутрішнього шару клітинної мембрани, фосфатидилсерин, переходить у зовнішній шар. Макрофаги постійно виділяють особливий глікопротеїн MFG-E8 (milk fat globule-EGF-factor 8 - фактор зростання епідермальних клітин-8 з жирових глобул молока), який специфічно зв'язується з фосфатидилсерин на поверхні клітин, що впадають в апоптоз. Утворені комплекси фосфатидилсерин з MFG-E8 і служать тими позначками, за яким дізнаються майбутніх самогубців. Макрофаги збігаються до таких клітин і швидко поглинають утворилися апоптозние тільця.

Схема, ілюструє морфологічні зміни клітини при апоптозу.

Є і інший вид запрограмованої смерті, ще недавно не вважався таким, -- некроз. При некрозі клітина не зменшується, а, навпаки, набухає; той же відбувається і з усіма її органелами. Це призводить до порушення цілісності всіх мембранних структур, в першу чергу лізосом, і, як наслідок, до автолізом. Вміст клітини разом з активними протеолітичними ферментами виливається в міжклітинний простір, пошкоджуючи все навколо себе. Цей процес супроводжує запальні захворювання, опікову хвороба і т.д., інакше кажучи, всі випадки, коли згубні стимули занадто сильні для того, щоб клітина встигла гідним чином підготуватися до смерті. Такий спосіб самогубства навряд чи можна вважати альтруїстичним, тому ми не будемо на ньому зупинятися.

Чому ж клітина вирішує померти? За наведених прикладів можна судити про причини, спонукають клітину до суїциду. Вбивають себе або вже хворі клітини, або ті, загибель яких в даному місці в даний час вигідна організму. Якщо хвора клітка "не хоче" сама здійснювати самогубство, її можуть спонукати до цього сусіди.

Не перелічити знарядь самогубства

Клітка дізнається, що повинна покінчити собою, отримавши "повідомлення про майбутню смерті". Роль таких повідомлень виконують спеціальні сигнальні білки, до числа яких входить і фактор некрозу пухлин, що виділяється макрофагами. Приймачами сигнальних молекул служать рецепторні білки, розташовані на поверхні клітин і звані "рецепторами смерті". Дія цих сигналів опосередковано особливими протеолітичними ферментами (каспаз) і адаптерних білками, які допомагають їм зв'язатися з рецепторним комплексом.

рецепторний шлях апоптозу.

Сигнальна молекула (1) зв'язується з "рецептором смерті" (2) і далі через адаптерний білок (3) - з прокаспазой-8 (4), після чого вона перетворюється в активний фермент каспаз-8 (5). Вона активує в свою чергу прокаспазу-3 (6), яка, ставши чинним ферментом (7), розщеплює клітинні білки, і клітина гине.

У ссавців сімейство каспаз складається з 14 постійно синтезованих білків. Неактивна каспаз, або прокаспаза, побудована з чотирьох частин: N-кінцевого домену, великої і малої субодиниць і короткою сполучною області між ними. Щоб прокаспаза перетворилася в активний фермент, що пов'язує область і N-кінцевий домен відщеплюються, і утворюється гетеродімер з великої та малої субодиниць. З двох таких димерів і формується активна каспаз. При апоптозу спочатку активуються ініціаторние каспаз (-2, -8, -9, -10, -12), а потім, з їх допомогою, ефекторні (-3, -6, -7). Ці останні розщеплюють опорно-рухові структури клітини, пригнічують біосинтез білків і приводять в дію ендонуклеази - Фермент, що розщеплює ДНК. Решта каспаз (-1, -4, -5, -11, -13, -14) беруть участь у розвитку запальних процесів, а також, поряд з ефекторними каспаз, у формуванні епітеліальних клітин кришталика, кератиноцитів (клітин верхнього шару шкіри) і т.д.

Після того як сигнальна молекула зв'язалася з "рецептором смерті", за допомогою адаптерних білка до них приєднується прокаспаза-8. Ставши в результаті цього працюючим ферментом, вона активує прокаспазу-3, що стоїть на перетині двох шляхів запуску апоптозу - рецепторного і мітохондріального. Роль каспаз-3 -- розщеплення опорних клітинних структур.

Схема будови мітохондрії.

Мітохондрії, ці клітинні органели з подвійною мембраною, мають, як відомо, власним геномом і здатні автономно розмножуватися. Внутрішня мембрана утворює глибокі складки - Крісті. В обмеженому просторі нею, мітохондріальному матриксі, знаходяться ферменти енергетичного метаболізму. Мітохондрії забезпечують всю клітинну життя, оскільки служать енергетичними станціями: тут енергія поживних субстратів запасається в доступній для клітини формі, у вигляді аденозинтрифосфату (АТФ). Він синтезується за рахунок енергії, що вивільняється при переносі електронів з атомів водню, що утворилися при переробці субстратів, на кінцевий акцептор - кисень. Білки, що переносять електрони, вбудовані у внутрішню мембрану мітохондрій і утворюють електронтранспортную ланцюг (ЕТЦ). Її кінцевий елемент - цитохром с-оксидаза - і передає електрони від цитохрому с на кисень (ця клітинна дихання).

Схема окисного фосфорилювання (ліворуч), в ході якого синтезується АТФ. Високоенергетичні електрони проходять по переносить їх ланцюга, і частина вивільняється при цьому енергії використовується для відкачування протонів з матриксу. На внутрішній мембрані виникає електрохімічний протонний градієнт, завдяки чому Н + знову повертаються в матрикс через АТФ-синтетазу. Цей фермент використовує енергію протонного струму для синтезу АТФ з АДФ і неорганічного фосфату (P). На малюнку наведено також схема будови АТФ-синтетази (в середині) і модель дії цього ферменту.

Протони, що залишилися після відриву електронів від атомів водню, за рахунок енергії електронного транспорту виштовхуються з матриксу в міжмембранну простір. Виникає при цьому різниця концентрацій (градієнт) іонів Н + створює мембранний потенціал мітохондрій (Dym), енергія якого і використовується для фосфорилювання аденозиндифосфату (АДФ).

Фермент АТФ-синтетазу, що каталізує утворення АТФ з АДФ і неорганічного фосфату, є вбудоване у внутрішню мембрану грибоподібна тільце з каналом в центрі. Коли іон Н + проривається з цього каналу в матрикс, енергія протонного струму йде на синтез АТФ. Інших шляхів повернення в матрикс у протона немає, оскільки у нормальному стані внутрішня мембрана непроникна для іонів. Процес синтезу АТФ за рахунок енергії перенесення електронів називається окислювальним фосфорилюванням.

В матриксі протони з'єднуються з киснем, відновленим під час роботи електронтранспортной ланцюги, і утворюється вода. Але якщо він відновлюватися не повністю, з'являються активні форми кисню (АФК): супероксидних радикал (О2 · -), перекис водню (Н2О2) і гідроксильний радикал (ОН ·). У мітохондріях освіта АФК, цього побічного продукту, посилюється при підвищенні швидкості потоку електронів, збільшення концентрації кисню і роз'єднання дихання та окисного фосфорилювання речовинами, які викликають проникність внутрішньої мембрани.

органели, що забезпечують життєдіяльність клітини, забезпечують і її смерть. При сильному стресовому впливі (переохолодженні; нагріванні; стимуляції утворення АФК іншими структурами клітини, крім мітохондрій; перекисне окислення ліпідів плазматичної мембрани - найчастіше при опроміненні) в цитоплазмі різко підвищується концентрація іонів кальцію. Якщо кальцієві депо клітини не справляються з його утилізацією, відкривається так звана мітохондріальна пора діаметром 2.6-2.9 нм. Вона являє собою канал, що проходить через обидві мітохондріальних мембрани і складається з трьох білків: транслокатора аденінових нуклеотидів, потенціалзалежні аніонного каналу (порина) і бензодиазепинового рецептора. Коли цей комплекс зв'язується з Са2 +, через мембранну пору можуть проходити речовини з невеликою молекулярною масою. Це призводить до падіння мембранного потенціалу і набухання матриксу, цілісність зовнішньої мембрани неминуче порушується, і з міжмембранну простору в цитоплазму виходять білки апоптозу. Їх декілька: фактор, що індукують апоптоз (APOptosis-inducing factor - AIF), вторинний мітохондріальний активатор каспаз (second mitochondria-derived activator of caspases - Smac) і деякі прокаспази. Індукують фактор прямує прямо в ядро, де викликає деградацію ДНК.

Поряд зі специфічно апоптознимі білками, з мітохондрії через відкриту пору виходить цитохром с, який в нормі є кінцевою ланкою електронтранспортной ланцюга. У цитоплазмі цей білок зв'язується з білком Apaf-1 (APOptotic protease activating factor-1 - активуючий протеазу фактор-1) і формує апоптосомний комплекс. Він за допомогою Smac і ще одного фактора (Omi/HtrA2) активує прокаспазу-9, та, ставши каспаз-9, перетворює два інших проферменту в каспаз-3 і -7; а вони вже розщеплюють структурні білки, приводячи до появи біохімічних і морфологічних ознак апоптозу. У числі перших можна назвати, зокрема, перехід фосфатидилсерин в зовнішній мембранний шар і фрагментації ДНК. З другого ознак найбільш характерні "відлущування" клітини від матриксу, зморщування мембрани, стиск ядра і формування бульбашок з клітинним вмістом - апоптозних тілець.

Цитохром з електростатично і гідрофобних пов'язаний з внутрішньою мембраною мітохондрій через фосфоліпіди, переважно через кардіоліпіну. Електростатичний взаємодіють між собою позитивно заряджені залишки амінокислоти лізину в цитохрому і негативно заряджені фосфатні групи в кардіоліпіну. За рахунок гідрофобного взаємодії між вуглецевої ланцюгом цього фосфоліпідів і гідрофобними ділянками молекули цитохрому ще більше зміцнюється зв'язок ферменту з мітохондріальної мембраною, що забезпечує навіть його часткове занурення в її шар.

Отже, для виходу цитохрому с в цитоплазму одного лише порушення цілісності мітохондріальної мембрани недостатньо. Електростатично пов'язаний цитохром с може відірватися від кардіоліпіну, якщо змінюється іонна сила, щільність поверхневого заряду або рН, а пов'язаний гідрофобною - за рахунок окисної модифікації мітохондріальних ліпідів. Останню реакцію як раз і викликають активні форми кисню, які неминуче утворюються при будь-яких сильних впливах (стреси), а відкривання пори посилює цей процес.

Однак цитохром з не завжди потрібен для запрограмованої смерті. Апоптоз в серцевому тканини, наприклад, взагалі протікає без цього ферменту, він так і не виходить з міжмембранну простору.

Фрагмент схеми апоптозу, що протікає по мітохондріальному шляху.

Під дією надлишку іонів кальцію мітохондрія розбухає, через пору з неї виходить цитохром с і два білки - AIF і Smac. Перший білок індукує апоптоз, а другий активує деякі прокаспази.

Цитохром с може вивільнятися у відповідь на підвищення концентрації іонів Са2 +, яке викликає відкривання пори. Але вихід ферменту "на волю" може і не залежати від цих іонів, тоді процес контролюють білки сімейства Bcl-2 (B-cell leukaemia-2 - лейкемія В-клітин-2). Саме вони регулюють апоптоз на рівні мітохондрій. Одні з білків цього великого сімейства (Bcl-2, а також Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Al і Boo) запобігають апоптоз; інші (Вах, Bad, Bok, Bcl-xS, Bak, Bid, Bik, Bim, Krk, і Mtd) сприяють самогубства. Ось один приклад роботи білків цього сімейства регуляторів. Цитозольних білок Bid розщеплюється каспаз-8, яка активується через "рецептори смерті", і лізосомних протеазами катепсини, чий вихід з лізосом стимулює ця ж каспаз. Утворився активний білок - усічений Bid (truncated Bid - t-Bid) - змінює конформацію іншого проапоптозного білка, Вах, після чого той вбудовується в зовнішню мембрану мітохондрій, де формує комплекс з порину. Разом вони вистилають канал, по якому з міжмембранну простору виходять цитохром с і проапоптозние білки. Але якщо в справу втручається Bcl-2, що діє як антиоксидант, вихід цитохрому блокується.

Фрагмент схеми апоптозу, що протікає під контролем білків сімейства Bcl-2, а також з участю p53.

Пояснення в тексті.

В запуску апоптозу, викликаного ушкодженнями ДНК, активацією онкогенів і гіпоксією, бере участь білок-53 (р53), взаємодіючи з Вах, стимулюючи "Рецептори смерті" і апоптозние гени. р53 активує модулятор суїциду PUMA (p53 upregulated modulator of APOptosis), який потім пов'язує Bcl-2 і виводить з ладу цей перешкоджає апоптозу білок. Тим самим вихід цитохрому з з мітохондрій вже нічим не стримується.

Деякі білки, що зв'язують іони кальцію, наприклад ALG-2, що кодується однойменною геном (APOptosis-linked gene-2), теж беруть участь у запрограмованої смерті. Так, взаємодією ALG-2 і білка Alix (ALG-interacting protein X, відомий і як AIP1) здійснюється регуляція апоптозу. Частина складної молекули ALG-2 являє собою ще один апоптозний білок кальпоін.

Кальпоіни специфічно расще?? ляють білки, що містять області, звані PAST-мотивами і багаті залишками чотирьох амінокислот - проліну (P), аспарагінової кислоти (A), серину (S) і треоніну (T). (Серед цих білків - фермент ДНК-лігази, у якого такий мотив знаходиться в N-кінцевій області.) Крім того, кальпоіни звільняють каспаз від пов'язаних з ними інгібіторів апоптозних білків (inhibitors of APOptosis proteins, IAPs).

Вперше виявлені у вірусів, гомологи IAP пізніше були знайдені у всіх еукаріотів, від дріжджів до ссавців. В останніх відкрито вісім представників цього сімейства інгібіторів, і кожен має від одного до трьох 70-амінокислотних ділянок, які називаються BIR-доменами (baculoviruses inhibitor of APOptosis repeat domains - повторювані домени бакуловірусного інгібітора апоптозу). Кодується Х-хромосомою IAP (XIAP) і клітинні інгібітори апоптозних білків (cellular inhibitors of APOptosis protein; cIAP1, 2) містять по три N-кінцевих BIR-домену та С-кінцевий RING-домен, який кодується геном ring (really interesting new gene - дійсно цікавий новий ген). Ці білки інгібують каспаз-3, -7, -9: BIR-домени цілеспрямовано зв'язуються з ними, блокуючи їх активні центри; RING-домен забезпечує деградацію каспаз, пришиваючи до них "чорну мітку "- 76-амінокислотний білок убіквітин. Приєднавши його білки піддаються розщепленню Протеасома *.

* Про це специфічному шляху деградації білків см.: Абрамова Е.Б., Карпов В.Л. Протеасома: руйнування в ім'я творення// Природа. 2003. № 7. С.36-45.

Є та іншої ендогенний інгібітор каспаз - FLIP (FLICE-inhibitory protein). Він взаємодіє з посібниками суїциду - сигнальними комплексами, блокуючи активацію прокаспази-8 і передачу проапоптіческого сигналу від "рецепторів смерті ".

Як всі інгібітори протеаз, XIAP, cIAP1 і cIAP2 самі схильні до негативної регуляції. Зокрема, мітохондріальний поліпептид Smac/DIABLO (direct IAP-binding protein with low pI - білок з низькою pI, прямо зв'язує IAP), виходячи з мітохондрій в цитоплазмі, зв'язується з інгібіторами XIAP, cIAP1 і cIAP2 і заважає їм взаємодіяти з каспаз. Але XIAP, cIAP1 і 2 здатні протистояти інгібірує, Smac/DIABLO, приєднуючи до нього убіквітин - Сигнал для деградації. Одна з ізоформ Smac/DIABLO, Smac3, сама стимулює приєднання убіквітину до XIAP. У високих концентраціях каспаз-3 і -7 можуть розщеплювати XIAP і без посередників.

Як бачимо, клітина ніколи не впадає в апоптоз без "роздумів". Вона спочатку задає собі гамлетівське питання: "Бути чи не бути?". Відповідь на нього залежить від співвідношення про-і антіапоптозних білків; між ними йде боротьба, і перемагає та сторона, яка встигає навісити на іншу "чорну мітку" - убіквітин. А протеаза абсолютно все одно, на кому ця позначка - вони неупереджено розщеплюють мічені білки. Таким чином, вибір клітини між життям і смертю залежить не стільки від зовнішніх обставин, скільки від її власного внутрішнього стану. Навіть якщо організм наказує клітці загинути, вона підпорядковується йому тільки в тому випадку, коли сама розташована до такого результату. Бувають мутанти, які категорично не хочуть помирати, при тому що всі зовнішні обставини спонукають їх до суїцидів - як правило, це ракові клітини.

Загальна схема "класичного" апоптозу ссавців.

Ми перерахували всі види знарядь самогубства, якими клітина багатоклітинного організму користується, коли він наказує і коли вона сама того хоче. Але слід розуміти, що їхня дія неоднозначно. Наприклад, кальцій і активні форми кисню беруть участь в усіх без винятку процесах життєдіяльності як вторинні посередники в передачі сигналів і регулюють всі функції клітини: розмноження, дихання, обмін речовин, рух, ріст. Той же кальцій здатен, Зокрема, активувати антиоксидантні ферменти, що захищають клітину від окислювального стресу. АФК в мікромолярних концентраціях необхідні для проліферації клітин, їх рухливості і Хеморецепція, більше того, деякі види (наприклад, NO) навіть блокують апоптоз за допомогою виборчого нітрозілірованія ефекторних каспаз. Та й каспаз теж можуть виконувати цілком "Мирні" функції - керувати диференціюванням деяких типів клітин.

Таким чином, лише деякі з знарядь самогубства служать тільки цієї мети: більшістю з них клітина користується і в "домашньому побуті". Виникає питання: а чи то всі вони необхідні для здійснення суїциду? І якщо ні, то навіщо виробляти настільки непомірний арсенал знарядь? На ці питання ми зможемо відповісти, коли розглянемо специфіку протікання запрограмованої смерті в одноклітинних організмів.

Суїцид в одноклітинних

Практично у всіх найпростіших організмів зовнішні ознаки апоптозу ті ж самі, що у клітин багатоклітинних, і, як у них, до загибелі наводять різні причини. У одноклітинних водоростей її викликає відсутність світла або окислювальний стрес, а запобігають інгібітори каспаз і антиоксидантний фермент, що розщеплює Н2О2, - Каталаза (каспаз у них теж виявлено - з допомогою антитіл). Паразитичні жгутіконосци кінчають життя самогубством, якщо їм допомагають інгібітор протеїнкінази З ставроспорін (він же і стимулює апоптоз в клітинах ссавців) і перекис водню, а запобігають теж інгібітори каспаз. Екстракт цитоплазми паразитичного найпростішого Leishmania major в дослідах викликав характерні для апоптозу зміни в ізольованих ядрах ссавців, засвідчуючи про присутність у ньому AIF-подібних білків. Ізольовані мітохондрії L.major втрачали цитохром c при інкубації з рекомбінантним Вах людини навіть тоді, коли Вах був позбавлений трансмембранного домену, необхідного для вбудовування в зовнішні мембрани мітохондрій. Отже, у L.major є білки, здатні взаємодіяти з Вах.

У дріжджів знайдені практично всі знаряддя суїциду, наявні в багатоклітинних, крім лізосомальних катепсини представників сімейства Bcl-2. Тим не менше, гени проапоптозних білків ссавців при експресії в дріжджах викликають їх запрограмовану загибель, а Bcl-2 захищає пекарські дріжджі (Saccharomyces сerevisiae) від загибелі, викликаної окислювальним стресом. У Shizosaccharomyces pombe знайдений Rad9-білок, який містить послідовність амінокислот, необхідну для взаємодії з Bcl-2.

До апоптозу дріжджів призводять речовини, які вони самі ж і продукують: наприклад, оцтова кислота (продукт бродіння), перекис водню або a-фактор -- пептидний статевої феромон, що виробляється a-типом гаплоїдний клітин S.сerevisiae. При концентрації