Історія та методологія клонування

Ця тема чудово відображена в статті Конюхова Бориса Володимировича - доктора біологічних наук, завідувача лабораторією генетики розвитку Інституту загальної генетики імені Н.І. Вавілова. Тут я просто приведу її текст:

Доллі - випадковість чи закономірність?

Термін "клон" походить від грецького слова "klon", що означає - Гілочка, втеча, держак, і має відношення перш за все до вегетативного розмноження. Клонування рослин живцями, нирками чи бульбами в сільському господарстві, зокрема в садівництві, відомо вже більше 4-х тис. років. Починаючи з 70-х років нашого століття для клонування рослин стали широко використовувати невеликі групи і навіть окремі соматичні (нестатеві) клітини.

Справа в тому, що в рослин (на відміну від тварин) у міру їх зростання в ході клітинної спеціалізації - диференціювання - клітини не втрачають так званих тотіпотентних властивостей, тобто не втрачають своєї здатності реалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі. Тому практично будь-яка рослинна клітина, зберегла в процесі диференціювання своє ядро, може дати початок новому організму. Ця особливість рослинних клітин лежить в основі багатьох методів генетики та селекції.

При вегетативного розмноження і під час клонування гени не розподіляються по нащадкам, як в разі статевого розмноження, а зберігаються в повному складі протягом багатьох поколінь. Всі організми, що входять до складу певного клона, мають однаковий набір генів і фенотипно не розрізняються між собою.

Клітини тварин, диференціюючись, позбавляються тотіпотентності, і в цьому - одне з істотних їх відмінностей від клітин рослин. Як буде показано нижче, саме тут - головна перешкода для клонування дорослих хребетних тварин.

Перші досліди на амфібія

Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана на початку 50-х років в дослідах на амфібії. Американські дослідники Бріггс і Кінг розробили мікрохірургічних метод пересадки ядер ембріональних клітин за допомогою тонкої скляної піпетки в позбавлені ядра (енуклеірованние) яйцеклітини [1]. Вони встановили, що якщо брати ядра з клітин зародка на ранній стадії його розвитку - бластули, то приблизно в 80% випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється на нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра, просунулася на наступну стадію - гаструла, то лише менше ніж у 20% випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. Ці результати пізніше були підтверджені і в інших роботах.

Великий внесок у цю область вніс англійський біолог Гердон. Він першим в дослідах з південноафриканських жабами Xenopus laevis (1962) в якості донора ядер використав не зародкові клітини, а вже цілком спеціалізувалися клітини епітелію кишечника плаваючого пуголовка [2]. Ядра яйцеклітин реципієнтів він не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовими променями. У більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десята частина з них утворювала ембріони. 6,5% з цих ембріонів досягали стадії бластули, 2,5% -- стадії пуголовка і тільки 1% розвинувся в статевозрілих особин (рис. 1). Однак поява кількох дорослих особин в таких умовах могло бути пов'язано з тим, що серед клітин епітелію кишечника розвивається пуголовка досить тривалий час присутні первинні статеві клітини, ядра яких могли бути використані для пересадки. У наступних роботах як сам автор, так і багато інші дослідники не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.

Пізніше Гердон модифікував експеримент [3]. Оскільки більшість реконструйованих яйцеклітин (з ядром клітини кишкового епітелію) гинуть до завершення стадії гаструли, він спробував витягнути з них ядра на стадії бластули і знову пересадити їх у нові енуклеірованние яйцеклітини (така процедура називається "серійної пересадкою" на відміну від "первинної пересадки"). Число зародків з нормальним розвитком після цього збільшувалася, і вони розвивалися до більш пізніх стадій в порівнянні з зародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер.

Потім Гердон разом з Ласки (1970) стали культивувати in vitro (поза організмом в живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер [4]. Приблизно 25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули. При серійних пересадках вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка. Таким чином було показано, що клітини трьох різних тканин дорослого хребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвиток принаймні до стадії пуголовка.

В сною чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантації ядра недслящіхся і полносгью диференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana pipiens [5]. Після серійної пересадки таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка. Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок (більше 100 клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка не розвивалися.

Таким чином, у багатьох роботах показано, що у разі амфібій донорами ядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку. Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча правильніше називати їх клонуванням ембріонів амфібій, тому що в цьому випадку ми розмножуємо безстатевим шляхом не дорослих тварин, а зародків.

Диференціація клітин у ході розвитку хребетних супроводжується інактивацією непрацюючих генів. Тому клітини втрачають тотіпотентность, диференціювання стає незворотною. Зрештою, в одних клітин відбувається повне репресування геному, в інших - у тій чи іншій мірі деградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Однак поряд з диференційованими Кочетков культивовані in vitro клітинні популяції містять малодиференційовані стовбурові клітини, які й можуть бути використані як донори ядер для клонування ссавців.

Досліди з амфібіями показали, що ядра різних типів клітин одного і того ж організму генетично ідентичні і в процесі клітинної диференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадки ядер і культивування клітин in vitro в якоюсь мірою збільшує цю здатність.

Невдачі експериментів з мишами

Успішні досліди з амфібіями змусили учених задуматися про клонування ембріонів ссавців, зокрема мишей. МакКіннел в одній зі своїх робіт зазначав, що всі необхідні для цього методи вже існують, і незрозуміло, чому миша до досі не клонована. На його думку, першими об'єктами повинні були стати саме дрібні тварини, такі як миша або кролик. Однак пророкування МакКіннелла не збулося, хоча наприкінці 70-х років досліди на мишах дійсно почалися і протікали дуже драматично. До того часу, зауважу, дуже грунтовно були вивчені біологія і генетика ранніх етапів розвитку ссавців, і, зокрема, миші як модельного об'єкта.

Робота методично виявилася досить важким, насамперед тому, що обсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у амфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані. Експериментатори навчилися мікрохірургічних видаляти пронуклеус [6] з зигот (запліднених яйцеклітин) миші і пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів. Проте всі отримані різними способами зародки мишей розвивалися лише до стадії бластоцисти [7].

6. Пронуклеус - одне з двох гаплоїдний ядер в яйці ссавців у період після проникнення сперматозоїда, але до злиття чоловічого і жіночого пронуклеус в ядро зиготи в процесі запліднення. Чоловіче ядро формується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче - з хромосом яйцеклітини.

7. Бластоциста (бластула) - зародок ссавців на одній з ранніх стадій розвитку, ще до його імплантації в матку.

В 1977 з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Ілменсі про те, що вони отримали сім дорослих самок мишей, п'ять з яких мали голько магерінскій, а два - батьківський геном [8]. Це, нібито, залежало від гого, який пронуклеус був залишений в яйці - жіночий або чоловічий, він і визначав розвиток особи але типу гіногенеза або андрогенеза. Їх успіх був пов'язаний, але опису авторів, з гем, що, видаляючи один нронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощували отримані диплоїдні гомочіготние (з двома однаковими наборами генів) зародки in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самки-реципієнта для подальшого розвитку.

Здавалося, тепер можна буде швидко отримувати ссавців зі 100%-ної гомозиготних по всім генами. Це особливо важливо в селекції, так як для отримання сільськогосподарських тварин, зокрема, великої рогатої худоби, з закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібні десятки років роботи.

Однак, на жаль, дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося, хоча багато хто намагалися це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способом диплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишей гинуть на тих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетичного (що розвиваються, з незаплідненої яйцеклітини) ембріони.

Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх в клітку, МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високий вихід живих мишей вони отримали, коли як донорів ядер використовували зиготи, але якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як і раніше, розвивалися лише до стадії бластоцисти [9].

Метод МакГрата і Солтер став широко використовуватися різними експериментаторами. Так, Манн і ловель-Бадж виділяли пронуклеус з яєць, активованих до партеногенезу, і пересаджували їх енуклеірованние зиготи мишей [10]. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо ж навпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць і пересаджували в партеногенетичного активоване і позбавлені ядра яйця, то такі зародки розвивалися нормально до народження. Сурані зі співавторами встановили, що якщо додати жіночий пронуклеус з зиготи миші до гаплоїдном набору хромосом яйцеклітини, то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічого ядра призводить до нормального розвитку [11]. З іншого боку, рекомбінації чоловічого та жіночого пронуклеус з різних запліднених яйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація двох чоловічих або двох жіночих пронуклеус зупиняє розвиток ембріона [12].

Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавців потрібні два набори хромосом - батьківський і материнський. Тому ні в одного з відомих видів ссавців не описаний партеногенез. Тому роботи Хоппе і Ілменсі не вдалося повторити.

Однак ці дослідники ще двічі розбурхували наукове співтовариство. У 1982 році вони пересадили ядра клітин партеногенетичного бластоцист мишей в енуклеірованние зиготи Деякі з цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито були отримані чотири дорослих самки. У світлі вищесказаного ці результати досить малоймовірні.

Загибель партеногенетичного (гіногенетіческіх) і андрогенетичним зародків у ссавців пов'язана з різною активністю в онтогенезі материнського і батькового геномів. Механізм, який регулює ці функціональні відмінності, був названий геномних імпрінтінг [13] і вивчався у ряді робіт, де було показано, що для нормального розвитку ссавців потрібна наявність чоловічого геному. Інша стаття Ілменсі і Хоппе [14] мала ще більший резонанс.

Автори повідомили про пересадку ядер клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти в енуклеірованние зиготи мишей та одержання трьох дорослих мишей (двох самок і самця), генетично ідентичних донорської лінії мишей. Введення ядер-донорів і видалення пронуклеус з зиготи проводили за один прийом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самок. З 16-ти пересаджених бластоцист три розвинулися у дорослих тварин. У наступній роботі (1982) ці ж автори використовували в як донорів ядер клітини ембріонів ще більш пізніх стадій (7 діб) і нібито отримали трьох статевозрілих мишей. Однак ніхто з працюючих у тому ж напрямі не зміг досягти таких результатів, і достовірність даних Ілменсі і Хоппе була знову поставлена під сумнів.

МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, що передує стадії бластоцисти [15]. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. У той же час 19% реконструйованих яйцеклітин, містять ядра 2-клітинних зародків, змогли досягти стадії морули або бластоцисти.

Ці і багато інших дані показують, що в ембріогенезі у мишей клітинні ядра рано втрачають тотіпотентность, що пов'язано очевидно, з дуже ранній активацією геному зародка - вже на стадії 2-х клітин. У інших ссавців, у Зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16-клітинної стадії. Можливо тому перші значні успіхи в клонування ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Тим не менш, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю, значно розширили наші уявлення про методології клонування ссавців.

Кролики, корови і свині

Американські ісследонателі Стік і роблю, використовуючи методику МакГрата і Солтер, отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8клеточних ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи [16]. Фенотип народилися повністю відповідав фенотипу донора.

Однак лише 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися в нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, практично не дозволяє розраховувати на отримання таким методом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи тим не менш в тому. що вона показала можливість клонування ембріонів кроликів.

Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин, корів або овець, йде трохи по-іншому. Їх спочатку культивують НЕ in vitro, a in vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (перший) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (друга) реципієнта -- корови чи вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до народження дитинча. Уіладсін запропонував укладати реконструйовані яйцеклітини в агарових циліндр, який він потім трансплантували в перев'язаний яйцепровід вівці [17]. За даними одних авторів реконструйовані зародки краще розвиваються в яйцеклітини, ніж в культуральной середовищі, хоча деякі дослідники отримали непогані результати і при культивуванні.

Американці Роблю і його працівники, використовуючи ощадливий спосіб витягання ядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропонований МакГрат і Солтер, пересаджували в зиготи так звані каріопласти - чоловічий і жіночий пронуклеус разом з навколишнім їх цитоплазмою, а також ядра 2 -, 4 - або 8-клітинних ебріонов корови [18]. Спочатку зиготи центріфугіровалі щоб звільнити пронуклеус від оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра було добре видно під мікроскопом (мал. 2а), що значно полегшувало їх видалення (рис. 2б). За допомогою маніпулятора і загостреною скляній мікропіпеткі витягували один із бластомерів разом з ядром з ранніх зародків (рис. 2в) і переносили його в енуклеірованную зиготу (рис. 2г).

Реконструйовані зародки були укладені в агарових циліндр і пересаджені в перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару і досліджували. Реконструктурірованние зародки в цій роботі розвивалися лише в тих випадках, коли в зиготи пересаджували пронуклеус: 17% таких зародків досягли стадії морули або бластоцисти. Два зародка були пересаджені другу реципієнту - в матку корови, і розвиток їх завершилося народженням живих телят. Якщо як донори використовували ядра 2 -, 4 - або 8-клітинних?? зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися навіть до стадії морули.

Пізніше були і більш успішні роботи. Уіладсін, зокрема. повідомив, що йому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнской породи в результаті пересадки в реціпіентние яйцеклітини ядер бластомерів одного 32-клітинного зародка [19] (рис. 3). Автор стверджував, що більшість ядер зберігає тотіпотентность на 32-клітинній стадії, а значна їх частина навіть на 64-клітинної стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії ранньої бластоцисти в яйцепровід вівці. Після пересадки в матку корів - остаточних реципієнтів, як вважає автор, вони можуть і далі нормально розвиватися.

Бондіолі і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16-64-клітинні зародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в матку синхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих теляти [20]. Сім з них були генетично ідентичні, являючи собою клон, отриманий в результаті пересадки ядер клітин одного донорського ембріона.

Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби досить довго зберігають тотіпотентность і можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичні труднощі клонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені. Але залишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіють тотіпотентностью, для клонування дорослих тварин.

Клонування ембріонів свиней присвячена тільки одна невелика робота [21]. Мізерність даних, відімо.і пов'язана з певними труднощами роботи з цим об'єктом.

Клонування овець

Уіладсін ще в 1986 році показав, що і в ембріонів овець на 16-клітинній стадії розвитку ядра зберігають тотіпотентность [22]. Реконструйовані яйцеклітини, які містять ядра бластомерів 16-клітинних зародків, розвивалися нормально до стадії бластоцисти в перев'язаному яйцепровід вівці (в агарових циліндрі), а після звільнення від агару і пересадки в матку вівці - другий реципієнта - ще 60 днів. В іншому випадку донорами служили ядра 8-клітинних зародків і були отримано 3 живих ягняти, фенотип яких соотнетстіовал породу овець - донорів.

В 1989 Сміт і Уілмут трансплантували ядра клітин 16-клітинного ембріона і ранньої бластоцисти в позбавлені ядра незапліднених яйцеклітини овець [23]. У першому випадку було отримано два живих ягняти, фенотип яких відповідав породу овець - донорів ядер. У другому випадку один повністю сформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип також відповідав породу - донору. Автори вважали, що в ході диференціювання ембріональних клітин відбувається інактивація деяких важливих для розвитку генів, в результаті якої ядра бластоцисти вже не можуть репрограмміроваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальний розвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, як донорів ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони або культивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра яких мають тотіпотентностью.

Пізніше, у 1993-1995 роках, група дослідників під керівництвом Уілмут отримала клон овець - 5 ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних клітин [24]. Клітинну культуру одержували наступним чином: виділяли мікрохірургічних ембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластоцисти) і культивували клітини in vitro протягом багатьох пасажів (по принаймні до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стовбурових недиференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2-3-х пасажів, клітини ставали ущільненими і морфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин з 9-денного зародка вівці була позначена як TNT4.

Щоб донорське ядро і реціпіентная цитоплазма знаходилися на схожих стадіях клітинного циклу, зупиняли поділ культивованих клітин TNT4 на певній стадії (GO) і ядра цих клітин пересаджували в енуклеірованние яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II). Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували в перев'язані яйцепровід овець. Через 6 днів ембріони вимивали з яйцепровода першого реципієнта і досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, які досягли стадії морули або бластоцисти і пересаджували їх в матку вівці - остаточного реципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося 5 ягнят (самок) з них 2 загинули незабаром після народження, 3-й у віці 10 днів, а 2 залишилися нормально розвивалися і досягли 8-9-місячного віку. Фенотипом всі ягнята були схожі з породою овець, від якої отримували вихідну лінію клітин TNT4. Це підтвердив і генетичний аналіз.

Ця робота, особливо в частині культури ембріональних клітин, - значне досягнення в клонування ссавців, хоча вона й не викликала такий галасливого інтересу, як стаття того ж Уілмут зі співавторами, опублікована на початку 1997 року, де повідомлялося, що в результаті використання донорського ядра клітини молочної залози вівці було отримано клонального тварина - вівця на прізвисько Доллі [25]. Остання робота методично багато в чому повторює попереднє дослідження 1996 року, але в ній вчені використовували не тільки ембріональні, але ще й фібробластоподібних клітини (фібробласти - клітини сполучної тканини) плода і клітини молочної залози дорослої вівці. Клітини молочної залози отримували від шестирічної вівці породи фін дорcет, що знаходиться на останньому триместрі вагітності. Всі три типи клітинних культур мали однакове число хромосом -- 54, як зазвичай в овець. Ембріональні клітини використовували як донори ядер на 7-9-м пасажах культивування, фібробластоподібних клітини плоду - на 4-6-м пасажах і клітини молочної залози - на 3-6-м пасажах. Ділення клітин всіх трьох типів зупиняли на стадії GO і ядра клітин пересаджували в енуклеірованние ооцити (яйцеклітини) на стадії метафази II. Більшість реконструйованих ембріонів спочатку культивували в перев'язаному яйцепровід вівці, але деякі і in vitro в хімічно певному середовищі. Коефіцієнт виходу морула або бластоцист при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічі вище, ніж при культивуванні в яйцепровід. (Тому, мабуть, немає рядка необхідності в проміжному реципієнті і можна обійтися культивуванням in vitro. Однак для повної впевненості в цьому потрібні додаткові дані.)

Вихід морула або бластоцист в серії дослідів з культурою клітин молочної залози був приблизно втричі менше, ніж у двох інших серіях, коли як донорів ядер використовували культуру фібробластів плоду або ембріональних клітин. Число живих ягнят у порівнянні з числом пересаджених в матку остаточного реципієнта морула або бластоцист було також у два рази нижче. У серії дослідів з клітинами молочної залози з 277 реконструйованих яйцеклітин був отриманий тільки один живий ягня, що говорить про дуже низької результативності такого роду експериментів (0,36%). Аналіз генетичних маркерів всіх семи народилися в трьох серіях експериментів живих дитинчат показав, що клітини молочної залози були донорами ядер для одного, фібробласти плоду - для двох і ембріональні клітини - чотирьох ягнят. Вівця на прізвисько Доллі розвинулася з реконструйованої яйцеклітини, донором ядра якої була культивовані клітини молочної залози вівці породи фін дорсет і фенотипно не відрізняється від овець цієї породи, але сильно відрізняється від вівці-реципієнта. Аналіз генетичних маркерів підтвердив цей результат.

Успіх авторів цієї роботи, насамперед пов'язаний з використанням тривалих клітинних культур, тому що після багатьох пасажів у культурі клітин могли бути відібрані малодиференційовані стовбурові клітини, які, ймовірно, і були використані як донори ядер. Велике значення мав також той факт, що автори, з огляду на результати своїх попередніх робіт, синхронізували стадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнтів і клітин донорів.

Висновок

Отже, роботи з клонування хребетних було започатковано на амфібія на початку 50-х років і інтенсивно тривають ось уже більше чотирьох десятиліть. Що стосується амфібій, то, як було сказано у відповідному розділі, незважаючи на значні досягнення, проблема клонування дорослих особин залишається до цих пір не вирішеною. Встановлено, що в ході клітинної диференціювання у хребетних відбувається або втрата певних генних локусів або їх необоротна інактивація. Судячи з усього, втрачається та частину геному, яка контролює не ранні, а більш пізні етапи онтогенезу, зокрема, метаморфоз амфібій. Механізм цього явища поки що не піддається науковому поясненню. Але очевидно, що для клонування дорослих хребетних необхідно використовувати малодиференційовані що діляться клітини. Це методично важливе положення було враховано у більш пізніх роботах.

В 1979 американський біолог МакКіннел, що вніс великий внесок в роботу з амфібіями, стверджував, що отримані результати не дозволяють серьерно говорити про можливість клонування людини [26] - тоді це здавалося недоступним для експериментальних ембріологів. Однак ще в той час багато вчених, письменники і навіть політики стали активно обговорювати возможностт клонування людини, а деякі дослідники навіть приступили до таких експериментів. Наприклад, Шеттлз повідомив, що пересадив ядро сперматогоніальной клітини (диплоїдного попередника зрілого гаплоїдного сперми) в позбавлену ядра яйцеклітину людини [27]. В результаті три реконструйовані яйцеклітини почали дроблення, і виникли схожі на морули скупчення клітин, які пізніше деградували. Шеттлз вважав, що якщо трансплантувати такі групи клітин у матку жінки, то вони могли б нормально розвиватися. МакКіннел тоді справедливо заперечив, що таке припущення малоймовірне і абсолютно необгрунтовано.

Ще 5-6 років тому ніхто з учених, а їх працювало досить багато в цій галузі, не ставив питання про використання в якості донорів ядер клітин дорослих ссавців. Роботи зводилися, в основному, до клонування ембріонів домашніх тварин, і багато хто з цих досліджень були не дуже успішні. Тому так вразило, що з'явилося на початку 1997 року несподіване для всіх повідомлення авторського колективу під керівництвом Уілмут, що їм вдалося, використовуючи соматичні клітини дорослих тварин, отримати клонального тварина - вівцю на прізвисько Доллі. Насправді, однак, дослідники пройшли довгий шлях, і Уілмут з співробітниками довелося зібрати воєдино всі існуючі на той час досягнення, перш ніж вони змогли повідомити про сенсаційне результаті своєї роботи.

У цього першого успішного експерименту є істотний недолік - дуже низький коефіцієнт виходу живих особин (0,36%), і якщо врахувати також високий відсоток загибелі розвиваються реконструйованих яйцеклітин в плодовий період розвитку (62%), який в 10 разів вище, ніж при звичайному схрещуванні (6%), то постає питання про причини загибелі зародків. Чи всі пересаджені донорські ядра володіли тотіпотентностью? Зберігався чи повністю їх функціональний геном (набір генів, необхідних для розвитку), чи всі потрібні для розвитку гени були дерепрессіровани? Це дуже важливі питання, і по одному тварині не можна зробити остаточні висновки. Тим більше, що результати досліджень на амфібія говорять про необоротний характер інактивації, репресії генів в ході клітинної диференціювання. Можливо, авторам крупно повезло, і вони досить випадково в трьох різних клітинних популяціях відібрали за короткий термін стовбурові клітини, для яких характерна низька диференційованість і здатність до поділу. Щоб підтвердити результат цієї, в буквальному сенсі слова с.енсаціонной роботи, необхідні додаткові дослідження.

В найближчі роки головне завдання дослідників, що працюють в даній області -- це, мабуть, створення культивованих in vitro ліній малодиференційовані стовбурових клітин, що характеризуються високою швидкістю поділу. Ядра саме таких клітин повинні забезпечити повне і нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин, формування не тільки морфологічних ознак, але й нормальних функціональних характеристик клонованої організму.

Дослідження Уілмут і співробітників мають не тільки практичне, але й велике наукове значення для генетики розвитку. По суті, вони знайшли умови, при яких цитоплазма ооцитів ссавців може репрограмміровать ядро соматичної клітини, повертаючи їй тотіпотентность. Після публікації цієї роботи відразу і широко став дискутуватися питання про можливість клонування людини. Щоб його обговорювати, має сенс виділити два аспекти: методичний та етичний.

З викладеного вище випливає, що методично або технічно клонування дорослих ссавців розроблено ще недостатньо, щоб можна було вже зараз ставити питання про клонування людини. Для цього необхідно розширити коло досліджень, включивши до нього. крім овець. представників та інших видів тварин. Уілмут зі співробітниками, наприклад, планує продовжити свої роботи на корів і свиней. Такі роботи необхідні, щоб встановити, чи не обмежується Чи є можливість клонування дорослих ссавців особливостями або специфікою якого-небудь одного або декількох видів.

Потім необхідно суттєво підвищити вихід життєздатних реконструйованих ембріонів і дорослих клонованих тварин, з'ясувати, чи не впливають методичні прийоми на тривалість життя, функціональні характерстікі і плодючість тварин. Для клонування людини дуже важливо звести до мінімуму ризик, який, тим не менше, певною мірою все одно залишиться, ризик дефектного розвитку реконструйованої яйцеклітини, головною причиною якого може бути неповне репрограммірованіе геному донорського ядра.

Що стосується етичної строни справи, клонування людини викликає ще більше заперечень. По-перше, становлення людини як особистості, базується не тільки на біологічній спадковості, воно визначається також сімейної, соціальної і культурним середовищем. При клонуванні індивіда неможливо відтворити всі ті умови виховання і навчання, які сформували особистість його прототипу (донора ядра). По-друге, при безстатевому розмноженні спочатку жорстка запрограмованість генотипу зумовлює меншу різноманітність взаємодій організму, який розвивається до мінливих умов середовища (по порівняно з статевим розмноженням, коли у формуванні індивіда беруть участь два геному, складним і непередбачуваним чином взаємодіють між собою та з навколишнім середовищем). По-третє, практично всі релігійні вчення наполягають, що поява людини на світ - в "руках" вищих сил, що зачаття і народження має відбуватися природним шляхом.

Підводячи підсумки, слід визнати, що говорити про клонування людини можна лише суто теоретично. По суті мова йде навіть не про клонування, а про отримання копії окремого індивіда, оскільки термін "клонування" припускає отримання якогось безлічі особин. Але слово вже прижилося, тому має сенс користуватися ним як і раніше. Очевидно, що сьогодні ймовірність негативних наслідків цієї процедури значно переважає її вигоди, тому, на мою глибоке переконання, роботи з клонування людини, як в даний час, так і в найближчому майбутньому проводити недоцільно.

Можливо, через якийсь час, коли будуть удосконалені всі етапи цього складного біотехнологічного методу, вчені, соціологи та інші зацікавлені особи зможуть повернутися до обговорення доцільності клонування людини. Однак це час, думаю, настане не скоро, і в будь-якому випадку вирішення питання про клонування тієї чи іншої людини буде регламентуватися строгими рамками і правилами, торкаючись, можливо, тільки деяких медичних проблем, скажімо непереборного іншими методами безпліддя.

В той же час, роботи з домашніми тваринами дуже важливі з практичної точки зору. Клонування цінних трансгенних тварин може швидко та економічно забезпечити людство новими лікарськими препаратами, що містяться в молоці, спеціально отриманих для цього геноінженерний методами овець, кіз або корів. Клонування високопродуктивних домашніх тварин, зокрема, молочних корів, може зробити революцію в сельском господарстві, так як тільки цим методом можна створити не окремі екземпляри, а цілі стада елітних корів рекордисток. Це ж відноситься до розмноження видатних спортивних коней, цінних хутрових звірів, збереженню рідкісних і зникаючих тварин у природних популяціях і т.д.

Нові технології, без сумніву, приносять користь людству, і їх необхідно всіляко заохочувати. Заборони потрібні в тих крайніх випадках, коли явно проглядається шкоду чи шкоду для здоров'я і благополуччя людей. Поки клонування людини можна віднести до цього розряду. Моральна сторона проблеми, тим не менше, вже стоїть в повний зріст. Нестримно оптимістичну позицію, як мені видається, займають лише люди, погано знають питання. Тим, хто знає його, зрозуміло: переносити ще не вирішених методично наукову розробку на людину аморально. Федерація наукових товариств експериментальних біологів США - а це понад 52 тис. членів - у жовтні 1997 року оголосила п'ятирічний мораторій на експерименти з клонування людини. Адже вони мають на увазі участь безлічі конкретних людей, які захочуть дати свої клітини, і сурогатних матерів, які повинні будуть виносити плід. А якщо така велика кількість ушкоджень ембріонів і мертвонароджень, якщо неясний взагалі кінцевий результат, чи етично навіть говорити про перенесення експерименту на живих людей? Більш того, знайдуться аморальні люди, які під маркою допомоги безплідним парам, наприклад, почнуть виманювати великі гроші, що скомпрометує саму ідею, науковий пошук.

Я зовсім не заперечую того, що в майбутньому, коли проблема буде повністю вирішена методично, людство визнає клонування як метод допомоги безплідним парам, які прагнуть мати рідного їм дитину. Хоча говорити, швидше, треба буде не про дитину як такому, а про однояйцеві близнюки батька чи матері, яким буде клонований дитина в біологічному сенсі. Але тоді тим більше буде потрібно заздалегідь вирішити етичні та юридичні питання, як це було для трансплантації органів в багатьох країнах світу. Норми біоетики висуваються зараз на перший план. Ті моральні заповіді, якими людство користується століття, на жаль, не передбачають нових закономірностей і можливостей, які вносить в життя наука. Тому людям і необхідно обговорювати і приймати нові закони гуртожитку, що враховують нові реальності.

Клони зі зміненою ДНК.

Ну от і сталося те, чого так довго чекали і чого деякі так боялися. З'явилося повідомлення, що вченим з уже відомої своєю вівцею Доллі шотландської фірми PPL Therapeutics (комерційного відділення Розлін Інституту в Единбурзі) вдалося отримати успішні клони овечок із зміненою ДНК. Шотландські вчені змогли здійснити клонування, при якому генетичний матеріал був клону "підправлений" з кращу сторону.

Але перш ніж продовжувати трубить у фанфари, трохи історії.

Якщо пам'ятаєте, все почалося з вівці Доллі, яка була клонована в 1996 році вченими з тієї ж шотландської лабораторії, що й сьогоднішні ів