Як зібрати мембрану (солюбілізація і реконструкція мембран)

Л. І. Барсуков

Московський фізико-технічний інститут, Долгопрудний Московської обл.

Мабуть, сьогодні не треба переконувати кого-небудь в тому, що дослідження біологічних мембран являють собою один з найважливіших напрямків сучасної біології. Граючи ключову роль у регуляції потоків речовини, енергії та інформації в клітці, мембрани залучені в усі без винятку сторони її життєдіяльності. З цієї причини увагу багатьох учених у всьому світі вже давно залучено до проблем мембран, і загальна кількість публікацій на цю тему величезне. Статті, присвячені біологічних мембран або окремим внутрішньоклітинним мембранним системам, широко представлені і в цьому журналі (див., наприклад: МОР. 1996. Ъ 3, 4, 6; 1997. Ъ 1, 3, 5-10; 1998. Ъ 1, 3-6).

Дослідження мембран значною мірою базуються на двох основних методичних прийомах: це розбирання нативної (тобто природного) мембрани на складові її елементи і подальша повна або часткова збірка штучної мембрани з використанням всіх або частини компонентів вихідної мембрани. Стосовно мембранам ці прийоми отримали назву "солюбілізація" і "реконструкція", і саме про них піде далі мова.

Слід сказати, що розбирання досліджуваних об'єктів на складові елементи і їх подальша складання з метою відтворення або всього об'єкта цілком, або окремих його фрагментів, найбільш важливих для підтримання структури та прояву характерних функцій, є улюбленим методом молекулярної біології клітини. Досить згадати успішні експерименти з реконструкції вірусів, рибосом та бактеріальних флагелл з входять до їх складу субодиниць, щоб оцінити всю пізнавальну міць та інформативність цього методу дослідження. Ще більше значення цей підхід має стосовно до біологічних мембран, оскільки вони являють собою надзвичайно складні багатокомпонентні системи, які виключно гетерогенних за своїм складом та структурної організації.

Перші зусилля з розділення мембран на окремі функціональні одиниці були початі в 60-і роки XX в., і протягом довгого часу цей напрямок розвивалося емпірично, за принципом проб і помилок. Були випробувані різні способи впливу на мембрану, включаючи механічну обробку, дія ультразвуку, використання органічних розчинників і різноманітних хімічних агентів. Хоча в ряді випадків за допомогою цих методів були досягнуті певні позитивні результати, однак частіше за все така обробка або була малоефективною, або приводила до деструкції мембранного матеріалу і, що гірше за все, до необоротної денатурації мембранних білків. І тільки лише після введення детергентів в практику мембранних досліджень було знайдено той золотий ключик, за допомогою якого вдалося розкрити головні секрети структури і функцій біологічних мембран.

Трохи про детергенту

Перш ніж мембрану зібрати, треба зуміти розібрати її на складові частини. Виявилося, що легше всього це зробити за допомогою детергентів.

Детергенти (від лат. detergere - мити, очищати) є поверхнево-активні речовини з миючим дію, що обумовлено їх здатністю утворювати в воді стійкі колоїдні розчини. Поверхнева активність детергентів, то є здатність адсорбуватися на межі розділу фаз (типу вода-повітря або вода-масло), пов'язана з амфіфільних їх молекул. Амфіфільних (від грец. Філо -- люблячий і амфі - обох) називають речовини, в молекулах яких є чітко розмежовані гідрофільні і гідрофобні області, завдяки чому такі молекули володіють спорідненістю не тільки по відношенню до води, а й до неполярних органічних розчинників.

В воді молекули детергентів прагнуть асоціювати один з одним, даючи міцели. Ці агрегати складаються з великого числа детергентних молекул (зазвичай від кількох десятків до кількох сотень), орієнтованих в міцели таким чином, що їх неполярні групи формують внутрішнє ядро гідрофобне міцели, а гідрофільні полярні угрупування знаходяться на її поверхні і контактують з оточуючими молекулами води. Саме завдяки наявності гідрофобного ядра міцели здатні солюбілізіровать, тобто переводити в розчин неполярні речовини, практично нерозчинні у воді.

В Нині відомо кілька сот різних детергентів. Всі вони поділяються на два основні класи: іонні та неіонні детергенти залежно від наявності або відсутності заряджених груп у гідрофільній області їх молекул. У свою чергу, за типом заряду іонні детергенти діляться на катіонні, що мають позитивний заряд, аніонні, що володіють негативним зарядом, і цвіттер-іонні, у яких є як позитивний, так і негативний заряд, і тому в цілому молекула є електрично нейтральною.

В Як параметри, що характеризують здатність детергентів до міцеллообразованію, зазвичай використовують критичну концентрацію міцеллообразованія (ККМ) і число агрегації. ККМ - це та концентрація, при якої детергент починає утворювати міцели. До цього він знаходиться у воді в мономерний формі в стані істинного розчину. Число агрегації показує, скільки молекул детергенту припадає на одну міцели.

В мембранних дослідженнях використовують досить обмежене коло детергентів. У табл. 1 представлені ті з них, які найчастіше застосовуються для солюбілізаціі та реконструкції мембран. Для цих детергентів характерні досить високі значення ККМ (10 - 4-10 - 2 М) і те, що вони належать до розряду так званих м'яких миючих засобів, тобто таких, які не порушують активності мембранних білків і не викликають їх денатурації або роблять це у мінімальній ступеня.

Взагалі кажучи, вибір детергенту для реконструкції мембрани, як правило, представляє складне завдання, оскільки заздалегідь важко передбачити, наскільки вдалим виявиться даний детергент для даної конкретної мембрани і для даного конкретного білка. Крім того, нерідко вимоги до детергент, що використовується для солюбілізаціі мембрани, відрізняються від вимог, що пред'являються до детергент при реконструкції. Тому іноді доводиться в ході експерименту заміняти одна детергент на інший або використати суміші різних детергентів.

Чому і як детергенти руйнують мембрану

Велика частина тих речовин, з яких побудовані біологічні мембрани, а це головним чином білки і ліпіди, практично нерозчинні у воді. Це пов'язано не з тим, що ці речовини є абсолютно гідрофобними. Навпаки, і мембранні ліпіди, і мембранні білки містять в складі своїх молекул досить великі області, утворені гідрофільними угрупованнями, а тому, як і детергенти, є амфіфільних. Весь секрет полягає в балансі гідрофільних і гідрофобних залишків в молекулах цих сполук. А він такий, що величини ККМ для цих речовин дуже малі (10-10-10 - 9 М), і в воді їх молекули проявляють потужну тенденцію до агрегації. Однак з огляду на особливості своєї будови (див. нижче) вони утворюють у воді не маленькі міцели, а протяжні мембранні агрегати. У цих структурах неполярні ділянки молекул формують гідрофобні область мембрани, яка ізольована від води гідрофільними групами, розташованими на протилежних один одному поверхнях мембранного бішару.

Чому ж детергенти руйнують мембрану? Та тому, що молекули, що утворюють міцели, і молекули, схильні до формування мембран, висувають різні вимоги до геометрії утворюваних ними асоціатів (рис. 2).

Молекули детергентів, що володіють досить об'ємною гідрофільній областю і щодо невеликим гідрофобним ділянкою, в цілому мають форму конуса і тому легко упаковуються в структури з високою кривизною поверхні типу сферичних або циліндричних міцел. У свою чергу, в ліпідних молекулах, що утворять мембрани, відмінності в розмірах гідрофільній і гідрофобною області не настільки великі. У силу цього вони мають форму циліндра (або бруска) і краще всього упаковуються в протяжні ліпідні бішару мінімальної кривизни. Тому при одночасному присутності детергенту і ліпіду у складі одного агрегату виникає конфлікт між прагненням детергенту прийняти міцелярно конфігурацію і тенденцією ліпіду зберегти біслойную упаковку молекул в мембрані.

Поки детергенту в мембрані мало, його присутність виявляється лише у виникненні дефектів упаковки молекул у ліпідному Біслі з утворенням пір, проникних для водорозчинних сполук. Але в міру зростання вмісту детергенту зміни упаковки стають все більш значними і в кінцевому рахунку викликають порушення цілісності мембрани, що призводить до її розривів і навіть до фрагментації на окремі частки. Однак ці частки все ще зберігають мембранну організацію, і вся система в цілому як і раніше може розглядатися як розчин детергенту в мембрані.

Коли ж концентрація детергенту в мембрані досягає деякої критичної величини і подальше збереження біслойной організації молекул стає енергетично невигідним, мембрана починає руйнуватися з утворенням змішаних ліпід-детергентних і білок-детергентних міцел, які фактично представляють собою розчин компонентів мембрани в надлишку детергенту (рис. 3). Це і є момент солюбілізаціі, яка призводить до різкого зменшення розміру часток і як наслідок цього - до зниження каламутності мембранної суспензії та зменшення кількості матеріалу, що осідає при центрифугування.

Для солюбілізаціі краще використовувати детергенти з низькою ККМ, тому що такі детергенти легше вбудовуються в мембрану і швидше викликають її розпад до змішаних міцел. У цій якості найбільш ефективні іонні детергенти, але їх недоліком є те, що нерідко вони викликають денатурацію білків. Особливо часто це відбувається у випадку катіонних детергентів. Іноді денатурацію можна запобігти додавши ліпід в білковий солюбілізат. Неіонні детергенти менше ефективні як солюбілізірующіх агентів і іноді не повністю відділяють ліпіди від білків. Але, можливо, саме тому в присутності неіонних детергентів білки краще зберігають свою активність.

В солюбілізірованном стані мембранні білки можна легко відокремити від основної маси ліпідів і піддати подальшого фракціонування з метою виділення індивідуального білка або групи білків з цікавлять дослідника типом активності. Методи такого фракціонування в даний час добре відпрацьовані і включають спеціальні прийоми розділення білків за допомогою гель-фільтрації, хроматографії та електрофорезу у водному буфері, що містить детергент в концентрації, яка дорівнює або перевищує його ККМ. У деяких випадках солюбілізірованние препарати виділених мембранних білків можна використовувати для проведення структурно-функціональних досліджень, але частіше за все для цього необхідні реконструйовані препарати, тому що багато мембранні білки можуть проявити свою функціональну активність тільки тоді, коли вони знаходяться в повноцінному мембранному оточенні.

Чому і як мембрана збирається

Власне кажучи, збірка мембран відбувається у відповідності з тими ж принципами, що і їх розбирання. Якщо зміст детергенту у змішаних міцели зменшувати, то прагнення солюбілізірованних в них молекул до мембранних типу упаковки змусить міцели зливатися один з одним і в якийсь момент, коли залишився детергенту стане вже недостатньо для збереження високої кривизни поверхні в укрупнилися міцелярно агрегатах, вони перетворюються на мембранні структури.

Таким чином, процеси солюбілізаціі та реконструкції мембрани дзеркально симетричні в сенсі оборотності перетворень, що відбуваються при зміні змісту детергенту в суміші. Більш того, вони протікають мимоволі, якщо концентрація детергенту стає вище або нижче певної межі. Єдине, що потрібно, щоб запустити процес реконструкції, - це знати, яким чином можна видалити детергент з наявного солюбілізата.

В принципі з цим теж немає великих проблем, оскільки зараз є широкий набір різних способів видалення детергентів. Вибір відповідного способу визначається завданнями реконструкції, а також типом детергенту, який необхідно видалити. Найчастіше використовуються чотири основних способи видалення детергенту: діаліз, гель-фільтрація, сильне розведення солюбілізата і адсорбція детергенту на гідрофобних полімери.

Самий простий спосіб - це видалення детергенту за допомогою діалізу через напівпроникну целофанову мембрану. Оскільки молекули детергенту достатньо малі, щоб пройти через пори діалізної мембрани, а концентрація його мономерів у воді, що залежить від ККМ, порівняно висока, то детергент поступово переходить з солюбілізата в діалізу розчин. При цьому його вміст у змішаних міцели зменшується і, коли воно стає досить низьким, міцели трансформуються в мембранні структури. Цей спосіб хороший для детергентів з високою ККМ, таких, наприклад, як октілглюкозід або холато натрію. Але неіонні детергенти з низькою ККМ типу тритона Х-100 при діалізі видаляється не повністю. Інший недолік цього методу полягає в його тривалості, тому що навіть у кращому випадку видалення детергенту може зайняти кілька діб.

Більше швидкий спосіб заснований на видаленні детергенту за допомогою гель-фільтрації, коли солюбілізат пропускають через інертний гель, розмір пор якого достатньо великий, щоб утримати молекули детергенту, але малий у порівнянні з утворюються мембранними частинками, які вільно проходять між гранулами гелю. Незважаючи на швидкість, цей метод не завжди зручний в роботі, особливо коли потрібно провести реконструкцію великої кількості зразків.

Ще швидше, а фактично майже миттєво реконструкцію можна здійснити методом швидкого розведення. Для цього солюбілізат розводять великим обсягом не містить детергенту середовища, в результаті чого зміст детергенту в міцели різко падає нижче граничного рівня, яким визначається момент початку формування мембрани. Цей метод універсальний і годиться для видалення практично будь-якого детергенту. Проблема лише в тому, що сам зразок при цьому сильно розбавляється, та й детергент видаляється з мембрани далеко не повністю, що може негативно позначитися на якості реконструйованого мембранного препарату.

З максимальною повнотою детергент може бути вилучений з мембрани шляхом його адсорбції на гідрофобних полімери. Цей спосіб особливо гарний для видалення залишкових кількостей детергенту з вже сформованих мембранних частинок. Однак для видалення детергенту з початкового солюбілізата він малопридатний, так як на початкових стадіях реконструкції видалення детергенту може супроводжуватися адсорбцією значних кількостей білка і ліпіду на полімері. Тому зазвичай цей метод використовують в комбінації з іншими способами на кінцевій стадії видалення детергенту.

Що можна вважати гарною збіркою

Що ж є реконструйовані мембрани? На рис. 4 наведені електронні мікрофотографії реконструйованих мембран, що містять білок смуги 3, який відповідає за транспорт аніонів в мембрані еритроцитів. Добре видно, що отримані препарати містять частки овальної форми розміром близько 100 нм, обмежені однією мембраною. На фотографіях, отриманих методом заморожування-сколювання при великому збільшенні, можна бачити, що в мембрану вкраплені ще більш дрібні частинки, які приймають за білки, впроваджені в ліпідний бішар. Як правило, реконструйовані белоксодержащіе мембрани являють собою замкнуті бульбашки (або везикули), які отримали назву протеоліпосоми (більш докладно про ліпосоми і везикул см: Барсуков Л.І.// МОР. 1998. Ъ 10. С. 2-9).

Звичайно, дуже бажано, щоб реконструйовані мембрани по своїй морфології, структурної організації, фізико-хімічними характеристиками та функціональної активності були б максимально близькі до своїх природних прототипів. Слід, однак, сказати, що наведені на рис. 4 мікрофотографії є на рідкість вдалими, і довелося чимало потрудитися, щоб знайти їх у величезній купі публікацій, присвячених реконструкції мембран. Чаще всього результати реконструкції бувають не такі гарні, тому що до цих пір реконструкція є швидше мистецтвом, ніж наукою. Справа в тому, що немає універсального методу реконструкції, ні універсального детергенту, які були б придатні на всі випадки життя. Тому досліднику, стикається з необхідністю отримати реконструйовані мембрани, часто доводиться покладатися на власну інтуїцію і досвід попередників, дотримуючись певного набору емпіричних правил.

З урахуванням сказаного вище не варто дивуватися тому, що, як правило, набагато легше сформулювати критерії ідеальної реконструкції, ніж успішно її здійснити. Очевидно, що така реконструкція повинна призводити до гомогенної популяції моноламеллярних (тобто одношарових) протеоліпосом одного розміру з однаковим співвідношенням ліпід-білок. Бажано, щоб реконструйована мембрана мала таку ж проникність, як і нативних, і щоб протеоліпосоми мали достатній внутрішній водний обсяг, що дозволяє виміряти вміст транспортуються в нього речовин. Мембрана протеоліпосом не повинна містити остаточного детергенту, а її ліпідний склад повинен бути оптимальним для прояви функціональної активності даного білка. Цей перелік можна було б продовжувати і далі, якби не ще одна принципово важлива проблема, якої ми поки що не стосувалися в нашій статті.

Мова йде про топологічної асиметрії мембран. Справа в тому, що всі нативні мембрани асиметричні в тому сенсі, що їхні компоненти (як білки, так і ліпіди) неоднаковим чином розподілені між зовнішньою і внутрішньою сторонами мембрани. В ідеалі реконструйовані мембранні білки повинні мати строго певну орієнтацію в мембрані, яка відповідає їх орієнтації в нативної мембрані або відповідає завданням поставленого експерименту. У разі ліпідів також бажано мати можливість ставити їм потрібне трансмембранне розподіл. Однак на практиці ці вимоги здійснити дуже складно, тому що топологічна орієнтація мембранних компонентів залежить (іноді непередбачуваним чином) від багатьох параметрів, а також від методів, що використовуються для солюбілізаціі та реконструкції.

Всі це показує, що проблема полягає не в тому, щоб провести реконструкцію взагалі (як ми з вами тепер знаємо, вона відбувається мимоволі), а в тому, щоб зробити це правильно чи, кажучи іншими словами, зробити реконструкцію спрямованої на отримання мембран із заданою структурою і функціональними властивостями. Поки це завдання остаточно ще не вирішена, але вже є методичні підходи, що дозволяють змінювати в потрібному напрямку властивості реконструйованих мембран.

Висновок

В даний час багато проблеми, пов'язані з реконструкцією мембран, вже вирішені, свідченням чому є колосальна кількість статей, опубліковані на цю тему з початку 60-х років XX ст. Не буде перебільшенням сказати, що вражаючі успіхи, досягнуті сьогодні у вивченні мембранних білків, безпосередньо пов'язані із застосуванням методів солюбілізаціі та реконструкції. З допомогою цих методів багато білки були виділені в індивідуальному стані, що дозволило встановити їх хімічну будову і з'ясувати молекулярні механізми функціонування.

Реконструйовані системи дають прекрасну можливість вивчати принципи, що лежать в основі структурної організації біологічних мембран, і з'ясовувати тонкі деталі міжмолекулярних взаємодій у мембранах за допомогою різних фізико-хімічних методів.

Методами реконструкції вдається відтворювати складні системи, відповідальні за такі життєво важливі функції, як, наприклад, енергетичне забезпечення клітки, транспорт метаболітів, рецепція і передача інформації, а також регулювання внутрішньоклітинних процесів.

І нарешті, знання принципів самозбірки молекул в мембранні структури дає нам, з одного боку, можливість зрозуміти, як формуються мембрани всередині клітини, а з іншого - дозволяє застосувати ці принципи для побудови штучних систем, перспективних з точки зору можливостей їх практичного застосування. Саме в цьому напрямку йде сьогодні подальший розвиток досліджень в області реконструкції мембран.

Список літератури

1. Генніс Р. біомембран: Молекулярна структура та функції: Пер. з англ. М.: Мир, 1997.

2. Біологічні мембрани: Методи: Пер. з англ./Под ред. Дж.Б. Фіндлея, н.р. Еванза. М.: Світ, 1990. С. 196-250.

3. Овчинников Ю.А. Біоорганічна хімія. М.: Просвещение, 1987. С. 513-636.

4. Кагава Я. біомембран: Пер. з яп. М.: Висш. шк., 1985.

5. Рекер Е. Біоенергетичні механізми: Нові погляди: Пер. з англ. М.: Світ, 1979.

6. Rigaud J.-L., Pitard В., Levy D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: Application to energy-transducing membrane proteins// Biochim. et biophys. acta. 1995. Vol. 1231. P. 223-246.

7. Lasic D.D. Liposomes: From Physics to Applications. Amsterdam: Elsevier, 1993. P. 243-251.