Біохімія нуклеїнових кислот
Д. Г. Кнорре
Новосибірський державний університет
Інформаційний зміст ДНК. Регуляторні райони і інтрони
В
попередньої статье1 було розказано лише про найголовніше інформаційному
зміст ДНК: ДНК містить програми для синтезу властивих даному
організму білків, які являють собою послідовності трійок
нуклеотидів на транскрібіруемой нитки. Безпосередньо вони програмують синтез
відповідного кодону мРНК. Наприклад, майбутній залишок фенілаланіну повинен
бути записаний на транскрібіруемой нитки ДНК як (3 ') dAdAdA (5'), якщо програмується ко-дон UUU, або як (3 ') dAdAdG (5'), якщо кодується
кодон UUC. Ділянка ДНК,
що містить всю інформацію про програмованому білку, називають геном для даного
білка. Генами називають і ділянки ДНК, які містять всю необхідну
інформацію про структуру РНК (Рибосомна і транспортні РНК), а також
допоміжні ділянки, необхідні для транскрипції гена. Насправді послідовністю
кодують три-нуклеотидів для синтезу білків або послідовністю
нуклеотидів, що кодують структуру тРНК або рРНК, що міститься в ДНК інформація
не вичерпується. Сьогодні вже ясно, що воно незмірно багатшою, а, мабуть,
багато чого ще і взагалі невідомо.
Для
створення певної РНК необхідно, щоб транскрипція почалася в
певній точці величезної молекули ДНК. Тут має бути й
розташуватися за потрібне для транскрипції чином РНК-полімераза. Для цього
існує спеціальна область, частіше за все знаходиться перед кодує
послідовністю, роль якої полягає в тому, щоб зв'язати й орієнтувати
певним чином РНК-полімерази. Цю область, якщо вона розташована уздовж
ланцюга близько від початку старту транскрипції, називають промотором.
Нове
несподіване був пов'язаний зі структурою генів еукаріотів. З'ясувалося, що
смислова послідовність, що кодує певну послідовність
амінокислот у білку або певну послідовність нуклеотидів у РНК,
необов'язково є безперервною. Вона може містити деякі Інтернейрони
послідовності, які отримали назву інтронів.
1
Кнорре Д. Г. Біохімія нуклеїнових кислот// Сорос-ський Освітній
Журнал. 1996. № 3. С. 11-16.
кодують
послідовності, розділені інтрони, в цьому випадку називають екзонів. При
транскрипції виходять РНК-копії, які містять і потрібні в кінцевій
(зрілої) молекулі РНК фрагменти, і зайві, які повинні бути видалені
(вирізані) з зрілої молекули. Кожне таке вирізування повинно супроводжуватися
возз'єднанням решт послідовних екзонів, між якими знаходився
Інтрон. Цей процес одержав назву "сплайсинг". Сплайсинг
відбувається з вибірковістю, характерної для процесів, що каталізуються
ферментами. До відкриття сплайсингу вважалося загальноприйнятим, що всі ферменти
мають білкову природу. Однак ніякі білки в деяких випадках у сплайсинг
не беруть участі, тобто РНК, що містить інтрони, може сама здійснювати
селективну реакцію, причому з досить великою швидкістю. У результаті довелося
визнати, що біологічними каталізаторами можуть служити не тільки білки, а й
РНК. За аналогією з ензимами такі каталізатори отримали
назва рібозімов.
Говорячи
про інформаційний зміст ДНК, не можна не сказати про те, що інформаційне
зміст ДНК може змінюватися як у результаті помилок при реплікації, так і
при дії різних зовнішніх факторів - опромінення та обробки деякими
хімічними реагентами. Зміни в структурі ДНК якого-небудь організму носять
назва мутацій. Мутація може полягати в тому, що одна пара нуклеотидів в
двох ланцюгах перетворюється в іншу комплементарних пару. Це, природно,
відбувається не раз: спочатку виникає одна помилка, наприклад dC замінюється на dT. При реплікації dT відбере для введення в
нову ланцюг dA, а не dG, яке знаходилося в цьому
місці ланцюга у батьківського ДНК. У підсумку замість пари dC • dG в дочірній молекулі, а тим самим і у всіх подальших
поколіннях на цьому місці буде знаходиться пара dT • dA. Такі мутації отримали назву точкових. Відбуваються і більше
значні за масштабом мутації. Часто, хоча далеко не завжди, мутації мають
серйозні біологічні наслідки. Відомі, наприклад, гени, які відповідають
за контроль над розмноженням клітин, стимулюючи його до певної межі і
зупиняючи в потрібній для організму фазі. Деякі поодинокі зміни у такому
гені призводять до того, що здатність до контролю за процесом поділу клітин
втрачається і ген перетворюється на онкоген, то є ген, що сприяє
необмеженого розмноження клітин - клітини стають злоякісними та
виникає ракова пухлина.
Що сучасна хімія та біохімія вміють робити з нуклеїновими
кислотами
Хімія
і біохімія нуклеїнових кислот не тільки поглибили наші уявлення про величезну
групі найважливіших біологічних процесів, пов'язаних зі збереженням, розмноженням
і використанням спадкової інформації, закладеної в генетичному матеріалі
клітин, але дали потужний імпульс для становлення сучасної біотехнології з
важливими практичними виходами. Для того щоб не наосліп маніпулювати
нуклеїновими кислотами, було необхідно навчитися вивчати їх структуру, перш
всього складові їх послідовності нуклеотидів. Вперше ціною воістину
героїчних зусиль це було зроблено для декількох тРНК, що складаються з
кількох десятків нуклеотидів. Приємно відзначити, що на першому етапі
змагання за встановлення первинної структури тРНК в лідируючій п'ятірці була
і група радянських вчених, очолювана А.А. Баєв. Однак створені під час
цих робіт методи були настільки трудомісткі, що для прориву у дослідження ДНК
і великих молекул РНК вони були непридатні. Революційні рішення, принципово
відрізняються як один від одного, так і від перших методів, були знайдені в США
Алленом Максамом і Уолтером Гілбертом і в Англії Фредерік Сенгер. Ці
методи, особливо метод Сенгер, зробили можливим секвенування
нуклеїнових кислот загальним розміром в мільйони нуклеотидних пар.
Звичайно,
в рамках однієї статті розповісти в деталях про ці методи неможливо. Тому
доведеться обмежитися викладом найбільш принципових особливостей методу,
причому тільки методу Сенгеру. Особливістю проблеми є необхідність
визначити послідовне розташування дуже великої кількості залишків
нуклеотидів (за один прохід - кілька сотень). Зате властивості кожного залишку вже
добре вивчені. Основоположна Сенгеру ідея полягала в тому, щоб дослідити
послідовність не самої ДНК або, точніше, її досить довгого фрагмента,
а досліджувати структуру новосинтезованих ДНК, отриманої на досліджуваній ДНК
як матриці за допомогою ДНК-полімерази. Через комплементарності нової ДНК за її
послідовності нуклеотидів неважко відновити структуру матриці. При
це виявилося можливим частково замінити в суміші мономерів, з якої
синтезується нова ланцюг, один з них на так званий дідезоксінуклеотід. На
рис. 1 наведена хімічна формула нуклеотиду, а саме тімідінфосфата,
позначеного символом dT.
Залишком фосфорної кислоти він пов'язаний в ланцюзі з попереднім нуклеотидів. Його
ОН-група повинна приєднати наступний нуклеотид при продовженні росту ланцюга.
Виявилося, що при реплікації можна зробити невеликий обман ДНК-поліме-рази --
підмішати до суміші нуклеотидів дідезоксі-
Рис.
1. Структури тимідину-5'-трифосфату і його дідезоксіаналога
рібонуклеотід,
у якого ця ОН-група відсутній. Його можна позначити в представленому
випадку символом ddT. З
якийсь ймовірністю ДНК-полімераза впізнає і приєднає до зростаючої ланцюга дуже
схожий ddT замість dT. Так як синтез йде в
суворій відповідності з принципом компле-ментарності, то це станеться навпаки
тієї точки матричної ДНК, де знаходиться комплементарний dA. Але через відсутність у ddT ОН-групи ця ланцюжок не
зможе розвиватися далі, станеться обрив ланцюга. Обрив з певною ймовірністю
може відбутися в будь-якій точці навпроти dA. Таким чином, вийде суміш новосинтезованих ланцюгів
різної довжини, причому довжини (числа НУК-леотідних залишків) всіх цих
ланцюгів точно відповідають номерам залишків dA матриці. Отже, у такому експерименті визначаються
точки розташування всіх залишків dA в досліджуваній ДНК. Якщо три аналогічних експерименту провести
з сумішами, що містять домішки інших діде-зоксінуклеотідов: ddA, ddC і ddG,
то аналогічно будуть розставлені по номерах всі інші три нуклеотиду на
досліджуваної ДНК. Розділити ж отримані суміші по довжині не становить труднощів
за допомогою електрофорезу - методу, заснованого на переміщенні заряджених молекул
під дією постійного електричного поля. Справа в тому, що кожен залишок
нуклеотиду містить залишок фосфорної кислоти, який несе негативний
заряд. Тому, будучи поміщені в електричне поле, фрагменти різної довжини
будуть переміщатися до анода з різними швидкостями. Так як електрофорез зазвичай
проводять в дуже вузький середовищі (гелі), то це середовище чинить опір
переміщення фрагментів, тим більше, чим більше розміром фрагмент. Цей фактор
пересилює дію поля, тому, чим довший фрагмент, тим повільніше він рухається,
але всі вони розташовуються в порядку, що відповідає їх довжині. Залишається тільки
"побачити" місце кожного фрагмента. До цих пір для цієї мети частіше
всього використовують радіоактивну мітку: у нуклеотиди, з яких синтезується
нова ланцюг, вводять радіоактивний фосфор. Тому після закінчення
гель-електрофорезу гель прикладають до рентгенівській плівці і на місці
знаходження фрагментів після прояву радіоавтографа з'являються темні плями.
На рис. 2 схематично показані такий радіоавтограф і читається з нього
послідовність маленького шматочка ДНК.
Рис.
2. Схема методу Сенгеру і схематичне подання фрагмента радіоавтографа
гелю з відповідною йому послідовністю НУК-леотідов.Хі X
-проізвольниекомплементарние залишки нуклеотидів. Пронумеровані індексами
залишки, що входили до складу праймера. dA - залишки дезоксіаденозінового нуклеотиду у складі
аналізованої ДНК. dT і
ddT - залишки тимідину
монофосфату і дідезоксітімідін монофосфату, які включилися в нові ланцюги ДНК,
отримані при реплікації за допомогою ДНК-полімерази
Слід
зазначити, що метод Сенгер, так само як і метод Максама-Гілберта, які вчинили
революцію у вивченні структури ДНК, виявився успішним завдяки порушення
основного канону аналітичної хімії, який можна сформулювати так: якщо
не можна безпосередньо визначити структуру деякої молекули, потрібно її кількісно
перетворити на іншу молекулу, будова якої відомо. На цьому принципі
побудований і чудовий метод Едмана для встановлення послідовності
амінокислот у поліпептиду (фрагментах білків). Автор знайшов хімічну реакцію,
яка дозволяє відщеплять з одного, визначеного кінця поліпептиду один
залишок амінокислоти, перетворивши його в так званий тіогідантоін і не руйнуючи
при цьому решту ланцюжок. Різним амінокислотам відповідають різні
тіогідантоіни, так що легко визначити, яка саме з 20 амінокислот,
що входять до складу білків, була відчеплюючи. Укорочений на одну амінокислоту
поліпептид може бути повторно використаний для визначення природи наступного
амінокислотного залишку. Однак кожен знайдений амінокислотний залишок --
результат окремої процедури, і таким шляхом у кращих випадках вдається виконати
кілька десятків кроків. У методі Сенгеру аналізується складна суміш продуктів
реплікації, так що з одного гелю (точніше, з чотирьох доріжок одного гелю) відразу
розставляються по своїх місцях сотні нуклеотид-них залишків.
Успішно
розвинені і методи хімічного синтезу великих фрагментів нуклеїнових кислот --
оліго-нуклеотидів. Як і у випадку секвенування, все почалося з надзвичайно
трудомістких методів. Розробивши і застосувавши на практиці ці методи, американський
вчений Гобінд Корану в 1970 році завершив синтез ДНК, що кодує
послідовність однією з тРНК дріжджів, специфічної до амінокислоті аланін.
Однак з процедури, яка вимагала багаторічної праці великої кількості фахівців
експериментальної вищої кваліфікації, в рутинний метод, що виконується на
спеціальних автоматичних синтезаторах, синтез перетворився істотно
пізніше. Це було пов'язано як зі зміною хімічних процесів, покладених в
основу послідовного приєднання до зростаючої ланцюга необхідних нуклеотидів,
так і у величезній мірі із введенням у практику так званого твердофазного
синтезу, загальний принцип якого був запропонований американським вченим Робертом
Мер-ріфілдом для синтезу білків з амінокислот.
Як
в білках, так і в нуклеїнових кислотах зв'язку між мономірні ланками,
скільки б їх не було, ідентичні. У нуклеїнових кислотах це завжди зв'язок між
залишком фосфорної кислоти, що належить одному ланці мономеру, і
гідро-ксільной групою (ОН) сусіднього мономеру. Щоб побудувати, наприклад,
фрагмент нуклеїнової кислоти довжиною в 100 нуклеотидів, потрібно послідовно 99
раз здійснити реакцію утворення зв'язку з цим, по черзі вводячи в реакцію один
мономер за одним. Сьогодні проблеми освіти такого зв'язку в хімії, можна
сказати, не існує. Питання в тому, щоб кожен раз проводити цю реакцію
як можна більш кількісно і з мінімальним накопиченням непотрібних (побічних)
вществ. Хімік вважає, що, провівши реакцію з виходом 80%, він має непоганий
результат. Але спільний вихід стостадійного процесу при виході 80% на кожну
стадію складе 0,8100 = 10 ~ 9, тобто одну мільярдну
частину від введеного в реакцію перший нуклеотиду. Очевидно, що такий вихід не
може бути основою для прогресивної технології. Тим часом, принаймні
частково, некількісними виходи відбуваються від того, що за хімічними
традицій при проведенні реакції в декілька стадій потрібно після кожної стадії
виділити отриманий продукт, очистити його від не вступили в хімічну реакцію
реагентів, від інших домішок і тільки потім приступати до наступної стадії.
Втрати, причому цілком відчутні, на кожній стадії неминучі.
Мерріфілд
запропонував відмовитися від цієї класичної хімічної традиції. Згідно з його
ідеєю, перша ланка створюваної ланцюга полімеру міцно, до самого кінця синтезу,
закріплюється хімічним зв'язком на твердому речовині-носії, який поміщається
в спеціальну трубку-реактор (колонку). Через реактор пропускається другу
мономер, причому в достатній надлишку, щоб перетворення закріпленого мономеру
було якомога більш повним. Потім надлишок другу мономеру і все
допоміжні речовини, потрібні для утворення хімічного зв'язку між
мономерами, відмиваються пропусканням через реактор відповідного розчинника.
Заодно відмиваються і побічні речовини, принаймні ті, які не пов'язані з
носієм. Після цього приступають до приєднання третього ланки. Процедуру
можна повторювати багато разів, хоча, звичайно, і не до нескінченності - якісь
втрати і забруднення неминучі. Ясно, що така процедура легко піддається
автоматизації. Синтезатор оліго-нуклеотидів (іноді його називають
ген-синтезатором) має кілька посудин, що містять окремі мономери, допоміжні
речовини, потрібні для синтезу, і розчинники для проміжних промивок
реактора. Всі ці речовини подаються по черзі в реактор, що містить носій і
зростаючу на ньому полімерну ланцюг за допомогою насоса, який вибирає кожен раз
потрібний посудину з введеної в прилад програмі. У програму вводиться і та
послідовність, яку слід синтезувати. Цим структура задається
майбутнього продукту. Залишається тільки після закінчення синтезу зруйнувати хімічну
зв'язок, за допомогою якої перша мономірні ланка був закріплений на носії, і
провести очищення синтезованого продукту від неминуче накопичилися домішок.
В умілих руках на надійно працюють ген-синтезаторах вдається отримувати
фрагменти довжиною до ста нуклеотидів і більше. Звичайно ж, біологічно цікаві
гени значно довше. Проте вже на зорі становлення штучного синтезу
нуклеїнових кислот Корану розробив спосіб з'єднання досить довгих
олігонуклеотиди між собою за допомогою зуществующего у всіх живих організмів
ферменту ДНК-лігази. Так що в даний час синтез генів є хоча і
трудомісткою, але цілком доступною процедурою.
Чудовою
здатністю ДНК є можливість її розмноження. В принципі для цього
потрібні лише належним чином підготовлені нуклеотиди і ДНК-полімераза. Тому,
отримавши деякий невеликий кількість ДНК, її можна розмножити. В даний
час ця процедура для невеликих молекул ДНК або певних шматків великий
молекули добре розроблена. Вона отримала назву ампліфікації, або
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Є лише один ускладнює, але без
особливих зусиль переборна проблема. Справа в тому, що особливістю всіх відомих
ДНК-полімерази є їхня нездатність почати синтез нових полімерних ланцюгів.
Вони можуть тільки подовжувати вже існуючу ланцюг, пов'язану з комплементарної
матрицею.
В
живих організмах ця трудність долається досить складним чином. Коли
приходить час для подвоєння ядерної або бактеріальної ДНК, вступає в дію
спеціальний фермент, що вибирає певні ділянки ДНК, з яких повинна
початися реплікація, і синтезує на них короткі початковий фрагменти РНК --
прайм-заходи. Фермент, по суті справи, є РНК-полі-меразой, але виконує
спеціальну функцію. Його часто називають ДНК-Праймаза. Після утворення праймера
ДНК-полімераза продовжує зростання ланцюга вже за допомогою дезоксірібонуклеотідов. Таким
чином, спочатку утворюється ДНК, що несе на 5'-кінці невеликий фрагмент РНК:
З
нездатності ДНК-полімерази починати синтез нових ланцюгів ДНК випливає, що для
здійснення ПЛР крім ДНК-полімерази і мономерів необхідні праймери. Якщо
мова йде про ампліфікації певної ділянки ДНК, то досить ввести в
систему праймери, комплементарні 3'-кінців обраних ділянок обох ниток. Це
роблять при помірній температурі, щоб дуплекс матриці з праймером був
досить міцним. Після проведення синтезу дочірніх копій обраного ділянки
нові дуплекси руйнують нагріванням до досить високої температури, щоб
розвести вихідну та новосинтезованих нитки, потім знову охолоджують до
температури, яке сприяє утворенню дуплексів з праймером і подальшої
реплікації. Ясно, що при кожному такому циклі кількість копій ампліфіціруемого
ділянки подвоюється, тобто за 20 циклів можна збільшити кількість
, що цікавить дослідника послідовностей в 220 = 106
разів.
Серед
численних застосувань ПЛР слід в першу чергу зазначити, що вона знайшла
застосування для виявлення мутантних генів, що має величезне практичне
значення для виявлення успадкованих захворювань. При проведенні ПЛР при цьому
вводяться такі праймери, щоб вони допомогли йому простимулювати ампліфікації
му-тантного гена, але не дали можливість ампліфіці-ровать незмінений ген.
Якщо що виявляється мутація присутній, то на останній стадії ампліфікації на
тлі різноманітних фрагментів ДНК, які не піддалися ампліфікації,
вийде велика кількість мутантного фрагмента, який легко виявити і
визначити, що це саме шуканий фрагмент, оскільки він має певний заздалегідь
відомий розмір. За наявності хороших реактивів і приладів вдається
зареєструвати спочатку незначні кількості певної
послідовності. ПЛР дозволяє проводити такі тонкі аналізи, як
пренатальну діагностику - визначення небажаної послідовності у плода
на перших тижнях вагітності. Залежно від характеру захворювання,
провокованого таким мутантним геном, можна прийняти спеціальні заходи для
нейтралізації негативного ефекту, що викликається цим геном, або в деяких не
піддаються профілактиці випадках рекомендувати жінці вчасно позбутися
від дефектного плоду і тим самим запобігти появі дефектної дитини.
Можливість
хімічно синтезувати, а також направлено вирізати з природних ДНК
різні гени привела до народження нової галузі біотехнології - генної
інженерії. З'явилися методи, що дозволили вставляти довільні гени в
невеликі молекули ДНК, здатні всередині певних клітин автономно
розмножуватися, або самокопіюватися синхронно з реплікацією клітинної ДНК.
З'явилася можливість вбудувати ген, не властивий даному організму, в
спадкові структури цього організму. А оскільки ген може програмувати
освіта кодованого їм продукту - білка або РНК, - то такий організм може
почати виробляти невластивий йому продукт. Виявилося можливим виробляти
в клітинах бактерій потрібні людині, або якому-небудь важливому для сільського
господарства тварині білки. Одним з найбільш вражаючих прикладів є
організація геноінженерний виробництва людського інсуліну. Це
надзвичайно важливий гормон, що виробляється підшлунковою залозою і абсолютно
необхідний для засвоєння цукру. Недолік, а тим більше повна відсутність
інсуліну призводять до важкої і широко поширеному захворюванню - діабету.
Основним засобом порятунку діабетиків є щоденне введення інсуліну.
Більша частина хворих може користуватися бичачим інсуліном, який добувають з
підшлункової залози великої рогатої худоби на м'ясокомбінатах. Однак
існують багато десятків тисяч діабетиків, які не можуть використовувати
чужорідний інсулін, дещо відрізняється по структурі від людського.
Створення гена людського інсуліну дозволило поставити виробництво
людського інсуліну за допомогою бактерій, тобто геноінженерний методами. У
даний час створені бактерії, що виробляють багато білки, потрібні в медицині
або сільському господарстві, такі, як гормон росту для підвищення продуктивності
м'ясного тваринництва і людський інтерферон для профілактики і лікування деяких
вірусних захворювань.
Новим,
поки що народжується напрямом біотехнології є антисмислової
технологія. Багато захворювань, у першу чергу онкологічні та вірусні,
пов'язані з появою в клітинах пацієнта чужорідної або несприятливо зміненої
успадковане інформації. Віруси, наприклад, вносять до заражені ними клітини свої
нуклеїнові кислоти і змушують клітини працювати за їх програмами,
відтворювати вірусних нуклеїнових кислот і вірусні білки. Якщо ввести в
заражені клітини нуклеїнових кислот або синтетичний олігонуклеотиди,
комплементарний який-небудь життєво важливої частини вірусної нуклеїнової кислоти,
можна сподіватися, що він утворює дуплекс з цією частиною і заблокує її
здатність програмувати роботу клітини в потрібному для вірусу напрямку. Так
як цю ділянку вірусної нуклеїнової кислоти має певний біологічний
сенс, то такі олігонуклеотиди і нуклеїнові кислоти одержали назву
антисмислової.
Список літератури
1.
Кнорре Д.Г., Мизіна С.Д. Біологічна хімія. М.: Висш. шк., 1992.
2. Щелкунов С.Н. Генетична інженерія.
Новосибирск: Изд-во Новосиба. ун-та, 1994.
3. Шабарова З.А., Богданов А.А. Хімія
нуклеїнових кислот та їх компонентів. М.: Хімія, 1987.
4. Овчинников Ю.А. Біоорганічна хімія. М.:
Просвещение, 1987.
