Анаеробні співтовариства мікроорганізмів, що руйнують ароматичні ксенобіотики

Біологія

Московський державний університет ім.М.В. Ломоносова

Біологічний факультет

Кафедра мікробіології

Реферат

Анаеробні співтовариства мікроорганізмів, що руйнують ароматичні ксенобіотики.

Виконала студентка 4-го курсу каф. мікробіології

Линькова Юлія

Керівник семінару:

А. И. Нетрусов

Москва

2002

Зміст.

1.Вступ

2.Біодеградація

3
3.Аеробний і анаеробний метаболізм ароматичнихз'єднань

5
3.1.Ароматіческіе субстрати та шляхи їх руйнуванняв анаеробних умовах

4.Сінтрофние асоціації та консорціуми, розкладаючі аміноароматіческіе речовини. 7
5.Технологіческій аспект
11
6.Заключеніе

12
7.Спісок використаної літератури 13

1.Вступ.
З розвитком хімічної промисловості в біосферу стало надходити більшетисячі різних ксенобіотиків, які в значній мірі забруднюютьнавколишнє середовище. Відомо, що з'єднання, що вносяться людиною внавколишнє середовище останнім часом (інсектициди, гербіциди, детергенти іінші ксенобіотики) окрім того, що дуже токсичні, ще й стійкі всередовищі (що становить небезпеку для людини і тварин). В данийчас навантаження на природні процеси самоочищення біосферинадмірною, і паралельно з деструкцією забруднень йде їх поступовенакопичення в навколишньому середовищі. Деградація ксенобіотиків мікроорганізмамиє однією з важливих проблем захисту біосфери.

2.Біодеградація.

Біоразрушеніе (біодеградація) - це перетворення складних речовин здопомогою біологічної активності. Це широке поняття включає трибільш вузьких процесу: 1) трансформацію, або незначні змінимолекули; 2) фрагментацію, або розкладання складної молекули на більшпрості з'єднання і 3) мінералізацію, або перетворення складногоречовини в найпростіші (Н2О, СО2, Н2, NH3, CH4 і т.д.). Основнимибіологічними агентами, що здійснюють біоразрушенія, ємікроорганізми, що володіють величезною різноманітністю ферментних систем івеликий лабільністю метаболізму. Саме вони здатні розкладатиширокий спектр хімічно стійких сполук, тим самим повертаючиосновні поживні елементи в глобальні цикли і запобігаючинакопичення «мертвих» залишків на поверхні Землі.
Найбільш активно беруть участь в руйнуванні ксенобіотиків бактерії ігриби, основна кількість яких виділено з грунту і води.
Представники бактерій відносяться до різних родів Грам-негативнихі Грам-позитивних аеробних і анаеробних організмів. З найбільшважливих аеробних Грам-негативних бактерій слід зазначити видиродів Pseudomonas, Sphingomonas, Burkholderia, Alcaligenes,
Acinetobacter, Flavobacterium, метанокісляющіе і нітріфіцірующіебактерії, а з Грам-позитивних - представників родів
Arthrobacter, Nocardia, Rhodococcus і Bacillus.

Деякі види нітрат-і сульфатредуцірующіх бактерій, а такожметаногенние археї беруть активну участь у анаеробної деградаціїксенобіотиків. Гриби, здатні аеробно руйнувати такі з'єднання,відносяться до пологів Phanerochaete (збудники «білої гнилі»),
Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium (Шлегель, 1987).

Особливу актуальність руйнівна здатність мікроорганізмів придбала востанні десятиріччя в зв'язку з збільшується, у біосферістійких забруднювачів антропогенного походження, причому нерідко вмасштабах, що перевищують природне самоочищаються здатність. Справа в тому, щолюдині вдалося створити такі з'єднання, які не руйнуються в природіу звичайних умовах. Це різні синтетичні полімери, барвники,пестициди, фармацевтичні препарати, мийні засоби і т.д. Цічужорідні речовини (ксенобіотики) мають унікальну біологічнуактивність вже на рівні мікродомішок. У широкому сенсі до ксенобіотикамиможуть бути віднесені і речовини природного походження, але отримані всверхколічествах і переміщені в невластиві їм місця (наприклад,нафта). Більшість таких сполук володіє значною стабільністю, ідля їх повного розкладання при звичайних умовах потрібні сторіччя.
Відбувається безперервний перенесення цих речовин по харчових ланцюгах і їхнакопичення на кінцевих етапах, до яких відноситься і людина. Величезначисло ксенобіотиків надзвичайно токсична і проявляє мутагенну,канцерогенну, алергену і тератогенних активності. Однак зрозуміло, щолюдство не може повністю відмовитися від використання таких речовин,так як вони застосовуються практично у всіх областях діяльності. Томуна перший план виходить використання біоразрушающей здібностімікроорганізмів для очищення навколишнього середовища від антропогеннихзабруднювачів.

3.Аеробний і анаеробний метаболізм ароматичних сполук.
Існує два типи метаболізму ароматичних субстратів, аеробний іанаеробний. Аеробне деградація простих ароматичних сполукініціюється введенням у молекулу однієї або двох гідроксильних группід дією моно-або діоксігеназ. Далі катехол піддається орто -або мета-розщепленню ароматичного кільця з утвореннямвідповідних похідних муконовой кислоти. Ці неароматіческіепродукти далі окислюються з використанням реакцій загальнихметаболічних шляхів до води і вуглекислоти. Якщо на бензольному кільціє заступники, то вони можуть перетворюватися і відщеплюються якдо, так і після розкриття кільця. Розкладання ароматичних кислотможе починатися з неокіслітельного декарбоксилювання, що приводитьдо утворення фенолів, які потім окисляються в лінійнінеграничні дикарбонових кислот (Elder, 1994; Heider, 1997). Основнимимікроорганізмами, що руйнують в аеробних умовах простіароматичні з'єднання, є представники родів Pseudomonas,
Alcaligenes, Bacillus і гриби роду Aspergillus, широкопоширені у грунтових та водних екосистемах.
В анаеробних умовах, за відсутності такого окислювача як кисень,руйнування ароматичних речовин відбувається більш складно, вбагатоетапний процес за участю різних ферментів. Мікроорганізмиздатні використовувати широкий набір ароматичних субстратів в нітрат-
, Сульфат-, залізо-і карбонат-відновлювальних умовах. Основнимиетапами процесу біодеградації є активація бензольногокільця, його розрив і освіта С1-та С2-сполук. Активаціякільця може бути результатом реакцій карбоксилювання, анаеробногогідроксилювання і освіти КоА-тіоефіров ароматичних кислот. Уостанньої реакції беруть участь розчинні, неспецифічні, індуцібельние
КоА-лігази або КоА-трансферази. Центральним інтермедіатів процесубіодеградації ароматичних сполук є бензоіл-КоА, якийпіддається серії послідовних відновлень під дієюбензоіл-КоА-редуктази і гідролітичного розщеплення утворивсяпохідного циклогексану. Першим неароматіческім продуктом єпімеліл-КоА. Далі відбувається ряд окислення і декарбоксилюванняглутаконіл-КоА з утворенням в кінцевому рахунку ацетил-
КоА (Heider, 1997; Kleerebezem, 1999; Lochmeyer, 1992). Лише деякімікроорганізми, здатні до біодеструкції ароматичних сполук,виділені у вигляді чистих культур. Це Pseudomonas sp., Thaueraaromatica, T. chlorobenzoica, Desulfobacterium anilini, Azoarcusevansii, Magnetospirillum sp., Delftia acidovorans, Rhodopseudomonaspalustris, Syntrophus gentinae і S. buswellii. Значно більшевідомостей про біодеградації таких з'єднань анаеробними мікробнимиспільнотами. У метаногенних умовах кінцеві стадії біодеструкціїпредставлені археями пологів Methanobacterium, Methanospirillum,
Methanosarcina, Methanosaeta.
Біодеструкції поверхнево-активних речовин типуалкілбензолсульфонатов, що мають у алкільних ланцюга від одного до трьохатомів вуглецю, починається з сульфонатних групи, а у сполук збільшим числом атомів - з бічного ланцюга. В аеробних умовах такіз'єднання розкладаються бактеріями та грибами, здатними до деструкціїароматичних сполук. Під час відсутності кисню розрив CS-зв'язкусульфоароматіческіх сполук можуть проводити бактерії з бродильнихтипом метаболізму. Процеси анаеробної деградаціїалкілбензолсульфонатов ефективніше йдуть в співтоваристві, що міститьмікроорганізми родів Clostridium, Desulfovibrio, Methanobacterium,
Methanosarcina.

3.1.Ароматіческіе субстрати та шляхи їх руйнування в анаеробнихумовах.
Мікроорганізми-денітріфікатори можуть використовувати п-крезол, ванілат,катехол, анілін, нітробензол, хлорбензоат, бензиловий спирт, толуол,етилбензол, а також амінокислоту фенілаланін.
Сінтрофние метаногенние асоціації (Syntrophus buswellii, S.gentianae) розкладають бензоат, кротонат, гентізат і гідрохінон.
Thauera aromatica і Azoarcus evansii використовують 2 - і 4 --амінобензойної кислоти та їх тіоефіри. Крім цього, можуть бутивикористані толуол, фенол, фенілпіруват, фторзамещенная ароматика,фенілацетальдегід, фенілгліоксілат, алкілбензоли, терефталат та ін (
Kleerebezem, 1999; Lochmeyer, 1992).

4.Сінтрофние асоціації та консорціуми, розкладаючі аміноароматіческіеречовини.
Сінтрофізм-особливий випадок симбіотичної кооперації міжметаболічно різними типами бактерій, які залежать один від одногопри руйнуванні субстратів.
Термін "консорціум" використовується для опису різних коопераціймікроорганізмов.В примітці до до Правила 31 в "Міжнародному кодексіноменклатури бактерій "(1978) йдеться:" Консорціум-це сукупністьабо асоціація двох або більше організмів ". Таким чином, в цейпоняття входять і такі форми співтовариств мікроорганізмів, якасоціація і змішана культура.

Прикладом консорціуму може служити "Methanobacillus omelanskii" (2організму-партнера, штам S і штам М.о.Н. ).:

Штам S: 2 EtOH + 2H2O = 2CH3COO - + 2 H + + 4 H2
? Gє = 19 кДж/2 моль EtOH
Штам M.о.Н.: 4H2 + CO2 = CH4 + 2 H2O

? Gє =- 131 кДж/1 моль CH4
Спільнота: 2 EtOH + CO2 = 2CH3COO - + 2 H + + CH4

? Gє =- 112 кДж/1 моль CH4

У даному випадку 2 штаму кооперуються для перетворенняетанолу в ацетат і метан, що при цьому відбувається міжвидової перенесення водню.
Штам S не може рости на етанолі у відсутність штаму MoH,споживає водень, тому що реакція за стандартних умов ендотермічна.Такім чином, ніодин з партнерів не може рости самостійно на етанолі, і деградаціяетилового спирту залежить від кооперації двох штамів (Schink, 1997).

Рис.1. Загальна схема потоку вуглецю і електронів у трофічних зв'язкахмікроорганізмів, що беруть участь в метаногенной деградації органічних речовинв анаеробних умовах.
1-первинні бродільщікі; 2-водородокісляющіе метаногени; 3 --ацетатпотребляющіе метаногени; 4-вторинні бродільщікі; 5-ацетогенниебактерії. (Schink, 1997).

Дана схема застосовується і до анаеробних спільнотмікроорганізмів, що розкладають аміноароматіческіе субстрати.

Поділ метаболічних функцій та їх розподіл середметаболічно різних мікроорганізмів є компенсацією відсутностіефективних механізмів деградації в аеробних умовах.
Метаболічні взаємодії кооперованих спільнот залежать відперенесення метаболітів між партнерами. Потік Н2 назадпропорційний відстані між водородобразующімі бактеріями іводородпотребляющімі метаногенамі. Оптимальна швидкість переносуметаболітів досягається у разі тісного контакту партнерів:безпосереднього сусідства, освіти агрегатів або "флокков".
Подібні флоккі утворюються, наприклад, у бактерій, що розкладають жирнікіслоти.Образованіе таких структур вимагає часу (іноді навітьмісяців) (Schink, 1997).

В даний час ведуться роботи з вивчення анаеробних мікробнихспільнот, що розкладають амінобензойної і аміносаліцилова кислоти та їхізомери (Калюжний, 1998; Савельєва та ін, 1999; Тян та ін, 1999). Ціречовини в окисних умовах полімеризуються в трудноразлагаемиемакромолекули, що ускладнює їх розклад, а аеробна деградаціяпризводить до утворення ряду токсичних проміжних продуктів.
Ці дослідження проводяться на які консорціуми, виділених змезофільних і термофільного мулів. Отримано стабільне метаногенноеспівтовариство, здатне споживати 2-АВА (2-амінобензойна кислота) звисокою швидкістю. В якості проміжних продуктів утворюютьсябензоат, ацетат і СО2. Передбачається, що ця культура єпервинним анаеробним деструкторами 2-АВА у виділеному з мезофільнімулу стабільному метаногенном співтоваристві (Савельєва та ін, 1999).
З того ж мезофільні мулу отримано стабільне анаеробнеспівтовариство, здатна розкладати 4-АВА з утворенням метану.
Проміжні продукти деградації ті ж, що й у випадку анаеробногорозкладання 2-АВА. З цього консорціуму виділена чиста культурапервинного деструктора 4-AVA (Савельєва та ін, 1999). В данийчас ведуться роботи з отримання стабільної накопичувальної культуриі виділення з неї чистої культури мікрорганізмов, що руйнують 5 -
ASA (5-амносаліціловой кислоти) і 3-АВА в термофільних умовах.
З стабільного консорціуму були отримані культури факультативниханаеробів, окисляючих 5-ASA і саліцилову кислоти в анаеробнихумовах з утворенням пропіонату, ацетату, СО2, іноді бутирата іводню. Вважається, що у всіх цих спільнотах первиннимдеструкторами є 1 і той самий мікроорганізм (Савельєва та ін,
1999; Тян та ін, 1999).
Подібні взаємини були описані в статті NCGTan (Tan etal., 1999) для анаеробного гранульованого мулу, розкладаючогоазокрасітелі.В процес деградації азосполук відбуваєтьсявідновлення азо-зв'язку з утворенням різних ароматичнихсполук (в т.ч. і з амінозаместітелямі). Даний консорціумвикористовує іншу стратегію деградації субстрату (в 2 етапи). Першийетап, анаеробний, відновлення азо-барвників до ароматичнихамінів, другий, аеробний, подальший розпад ароматичних сполук.
Другий етап здійснюється аеротолерантнимі мікроорганізмами, якімешкають на периферії анаеробного біотопу. Інтеграція аеробних іанаеробних умов є сприятливою для біомінералізацііазотвмісних ксенобіотиків (Tan. et al., 1999).
Метаногенние консорціуми беруть участь також в деградації такогосполуки, як толуол. До складу такого співтовариства входятьпредставники царств Бактерій і Архей. Філогенетичний аналіздомінуючих організмів показав, що до складу даного консорціумувходять два види архей, що відносяться до пологів Methanosaeta,
Methanospirillum, а також один з видів роду
Desulfotomaculum.Остальние представники спільноти не буливизначені, але їхній внесок у загальний метаболізм дуже важливий, тому що привідсутність будь-якого компоненту в співтоваристві змінюєтьсякількісний і якісний склад (Ficker еt al., 1999).
Крім цього, існують співтовариства мікроорганізмів, склад якихще повністю не відомий, але є дані про їхню здатністьрозкладати ароматичні субстрати. На електронних мікрофотографіяхпредставників таких спільнот видно тісне сусідство великих ідрібних клітин. Вони належать різним організмів, але їх розташуваннясвідчить про їх можливий зв'язок через метаболізм. Зазвичай цімікроорганізми важко виділяються в чисті культури (Ficker еtal., 1999).
Описано культура мікроорганізмів, що здійснює деградацію про -фталати (Kleerbezem, 1999). У культурі були присутні 2 основних типимікроорганізмів: короткі товсті палички і маленькі палички. Товстівідповідальні за ферментацію. Маленькі палички розташовувалися дуже близькодо товстих і, можливо, були метаногенамі, що споживають водень
(Methanobacterium). Іноді виявляються спорові палички, які, швидше заза все, виконують роль деструкторів (перший стадії деградації).
Ідентифікація до чистих культур не проводилася (Kleerbezem et al., 1999).
Щербакової В.А. було досліджено співтовариство, виделенноез напівпромислового
UASB-реактора.В руйнуванні бензолсульфоната і п-толуолсульфоната (ТЗ)беруть участь 9-10 мікроорганізмів, 5 з яких вдалося виділити вчисті культури.Чтоби визначити ключові групимікроорганізмів, що беруть участь в руйнуванні ТЗ до метану, було вивченозміна мікробної популяції під час процесса.В першу добу ростуосновну частину популяції становив спороутворюючих організм штам 14 (68.5
%). Під другу добу його чисельність зменшилася, однак в співтовариствіпереважали клострідіальние штами (80.5%). Надалі спостерігалосязбільшення чисельності штаму SS (спороутворюючих організм). З третьої добиспостерігалося активне спорообразованіе у клострідіальних штамів, починавсязростання чисельності у метанобразующие мікроорганізмів, і до кінця першого тижняїх сумарна чисельність становила близько 60% загальної популяціі.Скачок вспоживанні п-толуолсульфоната можна співвіднести зі зростанням чисельності штаму
SS в популяції мікробів на третю добу процесу. Під час розвиткуспільноти відбувалося, поряд з утворенням метану, накопичення леткихжирних кислот. Зміст ацетату в культуральному рідко?? ти було на порядоквище, ніж концентрація інших. Так, на початкових етапах n-толуолсульфонатвикористовується бактеріями роду Clostridium як джерело вуглецю ісірки, бактеріями роду Desulfovibrio як акцептор електронов.А відразу післяпояви ацетату толуолсульфонат використовується метаносарціной якстимулюючої органічної добавкі.Толуол є проміжним продуктомдеградації толуолсульфоната.Другім важливим інтермедіатів процесу єізобутірат. Крім виділеного в чисту культуру Methanobacterium formicicum штам МН, що утворює метан із СО2 і Н2, важливу роль у досліджуваномуспівтоваристві грає інший метаногени роду Methanospirillum.Ето найбільшпоширені партнери в сінтрофних організаціях, здатні рости принизьких парціальних тисках водню (Щербакова, 2000).
Щоб грамотно використовувати процеси анаеробної деградації вбіотехнологічних цілях, необхідно розуміти внутрішні взаємозв'язки вспівтоваристві.
5.Технологіческій аспект.
В даний час дослідження з біодеградації забруднень враховуються прирозробці різних очисних споруд. При цьому використовуютьсярізноманітні технологічні схеми біореакторів для очищення водойм,атмосфери, грунтів (Deriell et al., 1999).
Біореактори - це моделі біологічних систем. Спочатку в нихвикористовувалися природно склалися консорціуми мікроорганізмів, якіспоживали субстрат і видавали продукт, без урахування видового складу тавзаємодій між різними видами мікроорганізмів всередині консорціуму.
У деяких випадках процес деградації відбувається більш ефективно, якщослідом за анаеробної фазою слід анаеробна, в якій можуть брати участь,наприклад, аеротолерантние мікроорганізми (O'Neill et al., 2000). У ційстатті описаний UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket)-реактор, який використовуєтьсядля деградації азо-барвників. У процесі культивування та накопиченняпевних продуктів мікроорганізмами вивчається мулу чергувалисяанаеробні і аеробні стадії (O'Neill et al., 2000).
У роботах з вивчення біодеградації амінобензойної або аміносаліциловакислот у біореакторах основним "робочим елементом" був мезофільні аботермофільний мул очисних споруд, адаптований до певногосубстрату (Kalyuzhnyi et al., 1998).
В даний час ведуться активні дослідження в напрямку вивченняскладу різних сінтрофних асоціацій, деградуючих конкретний субстрати,і збільшення ефективності процесу.
6.Заключеніе.
Аміноароматіческіе ксенобіотики-трудноразлагаемие макромолекули,що мають властивість накопичуватися в екологічних нішах. Про мікробнихспільнот, які їх руйнують, відомо сравнітедьно небагато, особливо профункції компонентів, зв'язку їх між собою, таксономічній приналежностімікроорганізмів. Анаеробні мікроорганізми є первиннимидеструктора гетероциклічних і ароматичних сполук. Переробляючискладні субстрати, вони утворюють продукти, що споживаються сінтрофнимімікроорганізмами. На кінцевих етапах деградації субстратів важливу роль усінтрофних консорціумах грають сульфатредуктори, метаногени і ацетогени.Оніспоживають одно-і двухуглеродние субстрати і водень, виділяючи кінцевіпродукти, таким чином беручи участь у поверненні вуглецю та інших компонентіваміноароматіческіх субстратів в кругообіг речовин в біосфері.

7.Спісок використаної літератури.
1. Савельєва О.В., Котова И.Б., Нетрусов А.І., 2000.Сборнік праць наукової конференції "Проблеми екології та фізіології мікроорганізмів". МГУ, Діалог,

2000.
2. Тян А.Т., Брюханов А.Л., Котова И.Б., Нетрусов А.І.2000. Збірник праць наукової конференції "Проблеми екології та фізіології мікроорганізмів". МГУ, Діалог, 2000.
3. Щербакова В. А. Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня канд. біол. наук. Пущино, 2000.
4. Шлегель Г. Загальна мікробіологія.М., Світ, 1987.
5. Elder DJE, DJKelly.The bacterial degradation of benzoic and benzenoid compounds under anaerobic conditions: Unifying trends and new perspectives.Microbiology Reviews, 1994, vol.13, p.441-468
6. Deriel E., Comeau J., Villemur R. Two-luquid-phase bioreactors for enchanced degradation of hydrophobic/toxic compounds.Biodegradation, 1999, vol.10, p.219-233.
7. Ficker M., Krastel K., Orlicky St., Edwards E. Molecular characterization of a toluene-degrading methanogenic consortium// Applied and Environmental microbiology, 1990, p.5576-5585.
8. Heider J., Fuchs G. Microbial anaerobic aromatic metabolism.

Anaerobe, 1997, vol.3, p.1-22.
9. Kalyuzhnyi SV, Sclyar VI, Mosolova TP, Kucherenko IA, Degtyarova

NN, Russkova I., Kotova IB, Netrusov AI Methanogenic biodegradation of selected aminobenzoates.INTAS-1999-1809.
10. Kleerebezem R., Look W. Hulshoff Pol, Gatze Lettinga. Anaerobic degradation of phthalate isomers by methanogenic consortia.Applied and evironmental microbiology, 1999, vol.65, № 3, p.1152-1160.
11. Kleerebezem R., Look W. Hulshoff Pol, Gatze Lettinga. The role of benzoate in anaerobic degradation of terephthalate. Applied and evironmental microbiology, 1999, vol.65, № 3, p.1161-1167.
12. Lochmeyer C., Koch J., Fuchs G. Anaerobic degradation of 2-aminobenzoic acid (anthranilic acid) via benzoyl-coenzym A and cyclohex-1-encarboxyl-

CoA in a denitrifying bacterium.J. Bacteriol, 1992, vol.174, p.3621-3628.
13. O'Neill C., Lopes A., Esteves S., Haw Kes FR, Hawkes DL, Willox S. Azo-dye degradation in an anaerobic-aerobic treatment system opeating on simulated textile effluent. Appl Microbial Biotechnol, 2000, vol.53, p.249-

254.
14. Schink B. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation.Microbiology and Molecular Biology reviews, 1997, p.262-280.
15. Tan N.C.G. , Prenafeta-Boldu FX, Opsteeg JL, Lettinga G., Field JA

Biodegradation of azo-dyes in cocultures of anaerobic granular sluge with aerobic aromatic amine degrading enrichment cultures.Appl Microbial

Biotechnol, 1999, vol.51, p.865-871.