Міністерства вищої та середньої спеціальної освіти РОСІЇ
МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРВОНОГО ПРАПОРА ФІЗИКО-ТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ
ДИПЛОМНАџЯ РОБОТА
АТФ індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронах неокортексу щурів.
НАУКОВИЙ КЕРІВНИК академік Магура І.С.
КОНСУЛЬТАНТ к. б. н. Войтенко Н.В.рецензент к.б.н. Ісаєв Д
Дипломник Кругліков І.О.
Москва 1998
Зміст
1. ВСТУП 4
2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 5
2.1 Гомеостаз кальцію в нервових клітинах 5
2.1.1 кальцієві канали плазматичної мембрани 5
2.1.2 кальцієві буфери 7 < p> 2.1.3 кальцієві канали ЕПР 8
2.1.4 кальцієві насоси 11
2.1.5 кальцієві обмінники 13
2.1.6 Са2 +-зв'язують органели 13
2.2 ВліЯяніе АТФ на кальцієвий гомеостаз 14
2.2.1 Будова і властивості АТФ 15
2.2.2 Номенклатура і субклассіфікація пурінорецепторов. 16
2.2.3 Р1 пурінорецептори. 16
2.2.4 Р2 пурінорецептори 17
2.2.5 Рекласифікація пурінорецепторов. 20
3. ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 21
3.1 Підготовка препарату 21
3.2 Характеристика кальцієвого зонда 22
3.3 Фарбування зрізів флуоресцентним барвником 24
3.4 Структура експериментальної установки дляЯ двох-хвильового виміру концентрації кальцію 24
3.5 Розчини та зміна розчинів 27
4. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ 28
5. ОБГОВОРЕННЯ 39
6. ВИСНОВКИ 41
7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 42
ВСТУП
Молекула АТФ давно відома як повсюдно розповсюджене джерелоенергії для внутрішньоклітинного метаболізму. Але її властивості якнейротрансмітера були виявлені порівняно недавно. Сьогодні вже незалишилося жодних сумнівів, що АТФ є нейротрансмітером в автономнихнейром'язовий сполуках, гангліях і центральній нервовій системі. ДоНаприклад, було показано, що АТФ залучена в генерацію больових сигналівчерез Р2Х1 і Р2Х2 рецептори. Однак роль і розподіл пурінорецепторов вкорі головного мозку і особливо в моторному корі до цих пір залишається слабовивченою. Тому вивчення механізмів дії АТФ в корі головного мозкупредставляє безперечний інтерес. Ми вивчали дію АТФ за допомогоювиміру концентрації внутрішньоклітинного кальцію, - одного з найбільшважливих і універсальних регуляторів клітинних функцій.
Мета роботи полягала у вивченні механізмів генерації АТФ --індукованих внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів у нервових клітинахмоторної кори.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1 Гомеостаз кальцію в нервових клітинах
Концентрація цитозольного кальцію в клітинірегулюється трансмембранним транспортом і цитоплазматичних зв'язуваннямкальцію. Рух іонів кальцію через мембрану контролюється: 1) двомародинами Са2 + каналів, як то: кальцієвими каналами плазмалемми ікальцієвими каналами, розташованими в мембрані ендо (Сарко) плазматичногоретикулуму (ЕР або СР), які формують шляхи входу кальцію в цитоплазму;
2) виведенням кальцію з цитоплазми завдяки активності кальцієвих насосівплазмалемми та/або кальцієвих обмінників; і 3) акумуляцією іонів кальціювнутрішньоклітинними кальцієвими депо і мітохондріями. Останні служатьсистемами кальцієвого буфера, здатними акумулювати та накопичувати іоникальцію, підтримуючи таким чином гомеостаз кальцію в цитоплазмі.
1 кальцієві канали плазматичної мембрани
Нервові клітини експресують різні типи кальцієвих каналівплазмалемми, які можуть бути активовані різними впливами.
Грунтуючись на механізми активації, кальцієві канали можуть бути розділеніна кілька типів потенціал - керованих і рецептор - керованихканалів.
Потенціал - керовані канали роблять істотний внесок як урегуляцію входу кальцію в цитоплазму, так і в нейрональний електрогенез.
Білки, що утворять кальцієві канали, складаються з 5 субоедениц (a1, a2, b, g,d). Головна субоедениц a1 формує власне канал і містить місцязв'язування для різних модуляторів кальцієвих каналів. Було виявленокілька структурно різних a1 субоедениц кальцієвих каналів в нервовихклітинах ссавців (позначених як A, B, C, D і E). Функціональнокальцієві канали різних типів відрізняються один від одного активацією,кінетикою, провідністю одиночного каналу і фармакологією. У нервовихклітинах описано до 6 типів потенціал - керованих кальцієвих каналів (T-,
L-, N-, P-, Q-, R-канали). Активність потенціал - керованих каналівплазмалемми регулюється різними внутрішньоклітинними вториннимипосередниками і мембранозв'язаних G-білками (33,26).
Другий важливий шлях потоку іонів кальцію через мембрану пов'язаний зактивацією агоніст - керованих каналів. Багато агоніст - керованіканали мають значну кальцієвої проникністю при фізіологічнихумовах. Таку кальцієву проникність виявляють нейрональніацетилхолін (Ach)-керовані, глутамат-керовані (NMDA і AMPA/Каінаттипи) і пурінорецептори (10,18,49,34). Крім кальцієвих каналівплазмалемми, керованих зовнішніми впливами, в клітинібуло відкрито також кілька типів кальцієвих каналів, контрольованихвнутрішньоклітинними вторинними посередниками. Зокрема, IP3-керованікальцієві канали були виявлені в нейронах Пуркіньє мозочка (34), а IP4 -керовані кальцієві канали - в клітинах ендотелію (35).
Третій, недавно виявлений, особливий тип Са2 + каналів, якийконтролює заповнення внутрішньоклітинних кальцієвих депо, здійснюючитаким чином прямий зв'язок між звільненням Са2 + в цитоплазму з депо івхід до неї Са2 + через плазмалемму.
2 кальцієві буфери
Більша частина іонів Са2 +, що входять в клітину, практично негайнозв'язується цитоплазматичними місцями зв'язування кальцію. Показано, щотільки менше 1% іонів кальцію, які проникають в цитозолі, залишається внезв'язаному стані (11). Цитозольних кальцієві буфери представленіголовним чином Са2 +-зв'язуючими білками, такими як парвальбумін,кальмодулін, тропоніна-С, кальретінін, кальціунеурін, білок S-100 (25).
Крім того, цитозольних буферна ємність може бути опосередкована АТФ,яка здатна зв'язувати значну кількість Са2 + (64). 20-50%цитозольних кальцієвих буферів можуть бути вилучені з цитоплазми приперфузірованіі клітини, що показує їх мобільність, у той час якрешта Са2 +-зв'язує ємності відноситься до фіксованихбуфера. Мобільні кальцієві буфери можуть відігравати важливу функціональнуроль, сприяючи дифузії іонів Са2 + в цитоплазмі та розповсюдження Са2 +сигналу по клітці. Внутрішньоклітинний введення ендогенних Са2 + буферів
(кальбіндіна D28k і парвальбуміна) через мікропіпетку призводило дозбільшення швидкості наростання [Ca2 +] i на кілька порядків і істотновпливало на кінетику зміни [Ca2 +] i, що підтверджує роль мобільних Са2 +буферів з низькою молекулярною вагою в ефективному регулюваннівнутрішньоклітинної концентрації кальцію.
3 кальцієві канали ЕПР
Са2 + канали ЕР є олігометріческімі протеїнами, вбудованими вмембрану ЕР. Ці канали можна відносно легко виділити з клітини дляподальшого структурного аналізу завдяки тому, що білки каналузв'язуються специфічно і з високою спорідненістю з IP3 (для IP3-керованихканалів) і з ріанодіном (для Са2 +-керованих каналів).
Са2 +-керовані Са2 + канали ЕР. Ці кальцієві канали були впершевиділені з скелетних та серцевих м'язів. Виявилося, що Са2 + канали ЕР вцих м'язових тканинах мають молекулярні відмінності і закодовані різнимигенами. Са2 + канали ЕР в серцевих м'язах безпосередньо пов'язані звисокопороговимі Са2 + каналами плазмалемми (L-тип) через кальційзв'язуючийбілки, створюючи, таким чином, функціонально активну структуру - «тріаду».
У скелетних м'язах деполяризація плазмалемми прямо активує звільнення
Са2 + з саркоплазматичного ретикулуму завдяки тому, що Са2 + каналиплазмалемми служать потенціал - чутливими передавачами активуючогосигналу безпосередньо Са2 + каналів ЕР через що зв'язують білки (44). Такимчином, Са2 + депо скелетних м'язів володіють механізмом звільнення Са2 +,викликуваним деполяризації (RyR1-тип). На відміну від скелетних м'язів,саркоплазматичний Са2 + канали кардіоміоцитів не пов'язані з плазмалеммой, ідля стимуляції звільнення Са2 + з депо потрібне збільшення концентраціїцитозольного кальцію (RyR2-тип). ДНК, що кодує білки двох типів каналів
Са2 + звільнення, була клонована з тканин людини та кролика, що даломожливість експресувати Са2 +-керовані Са2 + канали в модельніклітинні системи. Білки, вбудовані в ліпідний бішар, формуютьчутливі до ріанодіну канали, що активуються іонами Са2 + (50 нмоль/л) вприсутності АТФ (29). Крім цих двох типів Са2 +-активуються Са2 + каналів,недавно був ідентифікований третій тип Са2 + каналів ЕР (RyR3-тип), якийє продуктом іншого гена. Цей третій тип Са2 + каналів ЕР, як булопоказано, не чутливий до кофеїну (21). Експерименти, проведені нанервових тканинах, продемонстрували присутність всіх трьох типів Са2 + --керованих Са2 + каналів ЕР в мозку ссавців, проте RyR2-тип єдомінантним (38). Са2 +-керовані Са2 + канали ЕР є гомотетрамерамі,складаються з мономерів з молекулярною вагою 500 КД (39)
IP3-керовані Са2 + канали ЕР. Існування IP3-керованих Са2 +каналів вперше було виявлено в нейронах Пуркіньє. Пізніше було показано,що вони вбудовані в мембрану ЕПР. Структура IP3 -керованих Са2 + каналів схожа із структурою Са2 +-керованих Са2 + каналів
ЕР. Вони також є гомотетрамерамі з молекулярною вагою мономеру 260
КД. 50% цих каналів активується 15 мкмоль/л IP3 і блокується рутеніємчервоним і La3 +. IP3-керовані Са2 + канали були виділені з мозкуссавців, і їх амінокислотна послідовність була розшифрована.
Було показано, що сімейство генів, експресуються IP3-керовані Са2 +канали, складається з трьох або чотирьох різних генів; вони характеризуютьсярізною чутливістю до IP3 і по-різному розподілені в мозкуссавців (45). Поріг активації цих каналів варіює між 0.2 - 0.5мкмоль/л у нейронах Пуркіньє мозочка і зростає до 9 мкмоль/л уастроцитів.
4 кальцієві насоси
Існує два сімейства Са2 + насосів, відповідальних за усуненняіонів Са2 + з цитоплазми: Са2 + насоси плазмалемми і Са2 + насосиЕПР. Хоча вони відносяться до одного сімействабілків (так званому P-класу АТФ-аз), ці насоси виявляють деяківідмінності в будові, функціональної активності та фармакології.
кальцієвий насос плазмалемми. Са2 + насос плазмалемми, який видаляєіони Са2 + з цитоплазми в міжклітинний простір, був відкритий в 1966році. Молекулярні властивості Са2 + насосів плазмалемми описані в декількохоглядах (18), однак достовірних даних про швидкість виведення Са2 + та регулювання
Са2 + насосів в нервових клітинах небагато. Нещодавно був розробленийдвухфлуоресцентний мікрокрапельні метод (58), що дозволяє одночасновимірювати [Ca2 +] i і вихід Са2 + назовні на одиночних клітинах. Дослідження,проведені за допомогою даного методу на нейронах молюска і секреторнихклітинах, показали, що активність Са2 + насоса плазмалемми контролюєтьсябезпосередньо [Ca2 +] i: збільшення концентрації цитоплазматичногокальцію активує Са2 + насос (58). У нейронах молюска близько 40% іонівкальцію, що входять в клітину у відповідь на деполяризацію мембрани, виводиться знейрона вже під час фази наростання [Ca2 +] i, відображаючи таким чиномактивацію кальцієвого насоса плазмалемми збільшенням концентраціїцитозольного Са2 + (58).
кальцієвий насос ЕПР. У багатьохклітині, поряд з Са2 + насосом плазмалемми, існуєкальцієвий насос Сарко (ендо) плазматичного ретикулуму (SERCA). В данийчас описано принаймні 3 різних ізоформи SERCA-насосів в клітинахссавців. SERCA1-підтип зосереджений виключно в швидких скелетнихм'язах, SERCA2-насоси широко поширені в інших тканинах. Значимість
SERCA3-насосів менш чітка (13). Білки SERCA2-насосів розділяються на двірізні ізоформи: SERCA2а, характерні для кардіоміоцитів і гладеньких м'язів,і SERCA2b, характерні для тканин мозку. Передбачається, що насоси SERCAрізними способами регулюються цитоплазматичної і інтралюмінальнойконцентраціями Са2 +: Збільшення [Ca2 +] i активує захоплення іонів кальцію в
ЕР, в той час як збільшення вільного кальцію усередині ЕР інгібуєнасоси SERCA (12). Насоси SERCA ефективно та селективно блокуютьсятапсігаргіном в наномолярних концентраціях (37) і мікромолярниміконцентраціями ціклопіазоновой кислоти. Однак, тапсігаргін викликає такожблокаду потенціал - керованих кальцієвих каналів плазмалемми, як цепоказано на клітинах коркового шару наднирників і на сенсорних нейронах
(Shmigol et al., 1995), тому його слід використовувати з деякоюобережністю.
5 кальцієві обмінники
Додатковим механізмом, відповідальним за виведення іонів кальцію зцитоплазми, є натрій-кальцієвий обмінник, який виводить Са2 +,використовуючи енергію натрієвого електрохімічного градієнта. Наявність Na + -
Са 2 + обмінника було показано в різних типах збудливих і невозбудімихклітин; в клітинах нервової системи він був виявлений в кінці 60-х років (9).
У нейронах молюска, вміщених у середу зі зниженим натрієм (тобто ззворотним натрієвих градієнтом), спостерігалося збільшення [Ca2 +] i, щоє результатом роботи обмінника в інвертованою формі. Однак,внесок Na + - Са 2 + обмінника в регулювання [Ca2 +] i в нейронах ссавців досих пір не оцінений. У деяких роботах було показано, що обмінникприймає незначну участь у видаленні цитоплазматичного Са2 +, в тойчас як в інших роботах представлені дані про те, що обменник граєістотну роль у перенесенні Са2 + через мембрану (57).
6 Са2 +-зв'язують органели
Крім швидкого зв'язування цитозольного Са2 + внутрішньоклітинними Са2 + --зв'язують білками, іони кальцію, що потрапляють в цитозолі, можутьакумулюватися апаратом Гольджі або клітинним ядром, захоплюватисямітохондріальними Са2 + депо, що мають досить невисоку спорідненість до Са2 +,або швидкими депо, пов'язаними з ЕР або СР, які мають високу спорідненість до
Са2 +. Однак якщо [Ca2 +] i перевищує 0,5 мкмоль/л, спостерігається істотнеперерозподіл [Ca2 +] i в область мітохондрій. Буферні системимітохондрій беруть участь у видаленні надлишкового Са 2 + з цитоплазми вклітинах кишечнику, деяких типах нервових клітин (59) і в секреторнихклітинах після підвищення [Ca2 +] i, стимульованого агоністами. Зв'язуваннякальцію мітохондріями забезпечується активністю систем, розташованих навнутрішньої мітохондріальної мембрани. Са2 + надходить в мітохондрії поелектрохімічного градієнту; різниця потенціалів, що забезпечуєтранспорт кальцію, створюється перенесенням електронів під час клітинногодихання і пов'язаного з ним перенесенням протонів. Перенесення електронів подихального ланцюга є основним механізмом, що забезпечує енергетикутранспорту кальцію. Придушення дихального ланцюга карбоніл-ціанід-м -хлорофеніл-гідразоном (СРСР) ефективно блокує акумуляцію кальціюмітохондріями (41).
2 Вплив АТФ на кальцієвий гомеостаз
Останні дослідження показали, що АТФ займає міцне місце в рядінейромедіаторів центральної та периферичної нервової систем (Burnstock
1990). Не викликає сумніву, що АТФ є не тільки найважливішимвнутрішньоклітинним метаболітом, але і є важливим об'єктом міжклітинноївзаємодії.
1 Будова і властивості АТФ
АТФ (див. рис.1) являє собою нуклеотид і як всякий нуклеотид складаєтьсяз трьох компонентів: азотистої основи, цукру пентози і фосфату. Уяк азотистого заснування в нуклеотидах присутні похідні пуринуі піримідину. Фосфати з'єднані в поліфосфатную ланцюг, кількість яких вприродних нуклеотидах не перевищує трьох. Однак синтезованінуклеотиди, що містять лінійні ланцюги з більш ніж 3-х фосфатів, приміромаденозінтетра-і аденозінпентафосфати.
Назви нуклеотидів, що містять в якості цукру рибозу, складаються зназви відповідного нуклеозиду, приставки, що позначає кількістьфосфатних груп у нуклеотидів та слова фосфат. Для найбільш поширенихнуклеотидів прийняті скорочені назви, наприклад АТФ дляаденозинтрифосфату, ГТФ - для гуанозінтріфосфата, ІМФ - інозінмонофосфата.
В області нейтральних значень pH нуклеїнові підстави і рибоза врозчині не заряджені (Мартін, Маріам, 1982). Нуклеотиди, через наявністьфосфатів, являють собою сильні кислоти. АТФ містить чотири ОНг?? уппи, здатні до іонізації, три з яких мають pKa нижче 3, а pKaчетвертій - 6,5 (Ленінджер, 1976). Таким чином, при pH 7,4 переважнабільшість молекул АТФ представляють собою четирехзарядние аніони АТФ4-,крім того, в розчині присутня невелика кількість АТФ3-.
2 Номенклатура та субклассіфікація пурінорецепторов.
Перше розділення пурінорецепторов на Р1 і Р2 типи грунтувалося нанаступному критерії: нуклеозиди такі як аденозин активували Р1пурінорецептори, у той час як АТФ стимулювала Р2 пурінорецептори, аметилксантини (кофеїн, теофілін) є селективними антагоністами Р1пурінорецепторов. Також Р1 пурінорецептори пов'язані з аденілатциклази, аактивація Р2 пурінорецепторов може приводити до вироблення простогландінов
(Burnstock 1978).
3 Р1 пурінорецептори.
У 1979 році (Van Calker et al 1979) показали, що аденозинові, Р1 --пурінорецептори можна підрозділити на дві групи. Рецептори однієї з нихмали дуже високою спорідненістю до аденозину (константа дисоціації Кd = 3 -
10 нМ). При взаємодії аденозину з цією групою рецепторів спостерігалосяінгібування аденілатциклази і, отже, зменшувався рівеньвнутрішньоклітинного цАМФ. Цей клас рецепторів був названий А1-рецепторами (Riрецептори по (Londos et al 1980)). Аденозинові рецептори, що відносяться додругої групи, мали більш низьку спорідненість з аденозину (Кd комплексуаденозину з рецептором 5-10 мкм). Активація цього типу рецепторів приводиладо стимуляції аценілатціклази. Ці рецептори Ван Колкер назвав А2 -рецепторами (Ra рецептори по (Londos et al 1980)). Були виявлені також іпотужні антагоністи для А1 - R-N6-Фенілізопропіладенозін (R-PIA). Для А2сильнішим антагоністом був 5'-N-етілкарбоксамідаденозін (NЕСА). Такожіснують роботи, в яких описуються аденозинові рецептори, непов'язані з аденілатциклази ці пурінорецептори було запропоновано назвати А3
(Ribeiro and Sebastiao 1986). Передумовою до поділу А2 пурінорецепторовна А2А і А2b підтипи стало відкриття різного спорідненості NECA до Р1пурінорецептору, - високого в стріатуме (А2А) і низького в фібробластах
(А2b) (Bruns et al 1986).
4 Р2 пурінорецептори
Накопичені фармакологічні докази, як-то: тип відповіді, порядокактивності агоністів, десенсітізація, що викликається АТФ та її структурнимианалогами, послужили основою для першого субделенія Р2 пурінорецепторов. У
1985 Бернсток і Кеннеді (10) вказали на неоднорідність популяції Р2 -пурінорецепторов. Цей висновок був зроблений виходячи з того, що в деякихтканинах (наприклад поздовжня м'яз сліпої кишки) АТФ викликав розслабленнягладеньких м'язів, а в інших (м'язова стінка сечового міхура) - скорочення.
Перший підтип рецепторів був позначений як Р2у, а другий - Р2х. Для Р2хпурінорецепторов найбільш активним агоністом був (, (- метилен АТФ ((,(-Матв), а для Р2у - 2 - метілтіо АТФ (2-МеSАТP). Так як порядок активностілігандів може залежати від швидкості їх гідролізу до неактивних сполук,яка може значно відрізнятися в залежності від тканини, більш чіткимдоказом для підрозділу Р2 - рецепторів на підтипи служить наявністьселективних блокаторів. Зараз відомі селективні антагоністи як для
Р2х, так і Р2у-рецепторів для Р2х - (, (-Матфей (десенсітізірующее дія),арілазідамінопропіоніл АТФ (АНАПП3), пірідоксалфосфат-6-азофеніл-2 ', 4'-Дисульфідний кислота (PPADS), сурамін та інші; для Р2у пурінорецепторов --реактив синій 2, сурамін. У 1986 році Гордон (23) запропонував виділити зкласу Р2 пурінорецепторов ще два підтипи Р2t і Р2z. Перший рецепторрозташовується в тромбоцитах і управляє їх агрегацією. Він, на відміну відвсіх інших підтипів P2 - рецепторів, активується АДФ, і блокується
АТФ. Р2z рецептори розташовані в тучних клітинах. У них АТФ в дуже великихконцентраціях (> 100 мкм), а точніше четирехзарядний аніон АТФ4-, викликавкальційзавісімую секрецію гістаміну. Інші пуринові нуклеотиди, включаючинегідролізуемие аналоги АТФ, не активували рецептор. Також був виявленийНеселективний антагоніст даного типу рецепторів DIDS - аналог PPADS
(Soltoff et al 1993). У 1991 році O'Connor запропонував так званийнуклеотидних рецептор однаково чутливий як до АТФ, так і до УТФ, алене відчутний до 2 - MeSATP. Цей рецептор отримав позначення Р2u.
Можливим антагоністом даного рецептора є сурамін. Також буловиявлено, що аденін динуклеотид поліфосфати також присутні вфармакологічної периферії (Hoyle 1990). Hildermann (1991)індентіфіціровал сайт зв'язування для діаденозін тетрафосфат (Ap4A) вмозку щура, який отримав назву діпурінергіческого рецептора, апізніше Р2d (Pintor et al 1993). Антагоністи даного виду пурінорецепторовпоки не виявлені.
| пурінорецептори |
| | |
| Р1 - пурінорецептори | | Р2 - пурінорецептори |
| | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | | | | |
| A1 | | A2a | A2b | | A3 | | P2x | | P2y | | P2t | | P2z | | P2u | | P2d |
Таблиця 1. Класична схема субклассіфікаціі пуринів-рецепторів.
5 Рекласифікація пурінорецепторов.
Из - за всезростаючих труднощів та неузгодженостей в класичній схемікласифікації Р2 пурінорецепторов і збільшується числі підтипіврецепторів, стало очевидним, що класична схема вимагає перегляду. У
1994 Abbracchio and Burnstock запропонували нову схему класифікації Р2
- Пурінорецепторов. З усіх Р2 - пурінорецепторов вони виокремили триосновних сімейства: Р2Х сімейство, пов'язане з іонотропнимі каналами,яке включало чотири підтипи; Р2У - пов'язана з активацією G - білків,що включає сім підтипів і сімейство Р2Z - родина неселективних пір. Їхгіпотеза грунтувалася в основному на вивченні літературних джерел іаналізі фармакологічного профілю новообнаруженниж агоністів. Надалітеорія підтвердилася клонуванням різних підтипів Р2 --пурінорецепторов. В даний час сімейство Р2Х нараховує шість, а Р2У
- Сім підкласів. Завдяки інтенсивним дослідженням, практично незалишається сумнівів в тому, що дані сімейства будуть рости і далі (Colloet al 1996).
| Р2 - пурінорецептори |
| | | |
| | P2Z - неселективні пори | |
| | | |
| Р2Х - родина | | Р2У - родина |
| іонотропних | | метаботропних |
| рецепторів | | рецепторів |
| | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | |
| Р2Х1 | Р2Х2 | Р2Х3 | Р2Х4 | Р2Х5 | Р2Х6 | Р2У1 | Р2У2 | Р2У3 | Р2У4 | Р2У5 | Р2У6 | Р2У7 |
Таблиця 2. Сучасна класифікація Р2 типу пурінорецепторов.
ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
1 Підготовка препарату
Дослідження проводилися на пірамідальних нейронах моторної областінової кори в тонких зрізах мозку, виділеного з 14 денних щурів. Післядекапітаціі мозок містився в холодний сольовий розчин (0 - 40С). Процедуравід початку декапітаціі до виділення мозку тривала не більше 60-90 секунд.
Потім мозок закріплювався поліакриламідних клеєм на підкладці вібротома
(Campden, Campden Instruments LTD, UK); камера вібротома заливаласяхолодним сольовим розчином. Зрізи нарізалися сагітальному товщиною 250 - 300мкм; швидкість подачі леза - 1 см/с з частотою 10 Гц. Після приготуваннязрізи містилися в розчин постійно насичуємо карбогеном (5% СО2 + 95%
О2). Перед завантаженням флуоресцентним барвником зрізи інкубувати впостійно оксігеніруемом розчині 30 хвилин при температурі 32 градуси.
Забарвлення зрізу здійснювалася протягом 30 - 35 хвилин в СО2 насиченомутермостаті при температурі 35 градусів. Після фарбування зрізи відмивалися 1 -
1,5 години на постійно оксігеніруемом розчині при кімнатній температурі. Всіексперименти проводилися при температурі 32 градуси.
2 Характеристики кальцієвого зонда
Для кількісного визначення концентрації кальцію в пірамідальнихнейронах моторної області нової кори використовувався барвник Фура-2 AM
(малюнок 2) (16).
На малюнку 3 представлений спектр зонда Фура -2 AM. При зв'язуванні зкальцієм відбувається характерна зміна спектру порушення цієїбарвника: при збудженні світлом з довжиною хвилі 390 нм відбуваєтьсязменшення флуоресценції, а при збудженні світлом, з довжиною хвилі 340 нм --збільшення. Однак, 340 нм є вже ультрафіолетовим світлом, і для їївикористання необхідний мікроскоп з кварцовими лінзами. Оскільки в нашомувипадку був використаний звичайний мікроскоп, то друга хвиля була обранадовжиною 390 нм. 360 нм - це ізобестіческая точка зонда Фура -2, тобтофлуоресцентне сигнал при збудженні світлом цієї довжини хвилі не залежить відконцентрації Ca2 + і є функція лише концентрації зонда.
Вимірювання флуоресценції при збудженні двома довжиною хвиль дозволяєлегко розрахувати [Ca2 +] i у клітці за формулою (24):
[Ca2 +] i = Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R) де Кd - константа дисоціації комплексу Фура -2 з кальцієм,
R = F360/F390 - поточне відношення флуоресцентних сигналів, Rmin =
F360/F390 | Ca0 - те ж відношення в розчині з низькою концентрацією Ca2 +,
Rmax = F360/F390 | CaҐ - те ж відношення в розчині з високою концентрацією
Ca2 +, b = F390 | Ca0/F390 | CaҐ - відношення флуоресцентних сигналів в низькій івисокої концентрації Ca2 + при порушенні довжиною хвилі 390 нм. Параметри
Rmin, Rmax і b визначали експериментально. Для цього були приготованібазовий розчин (в ммоль/л): KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH = 7.2), Фура -2 -
0.005; розчин з низькою концентрацією Ca2 + готувався без додавання Ca2 + здобавкою EGTA - 10; розчин з високою концентрацією Ca2 + - з добавкою CaСl2
- 10. Відношення величин флуоресценції визначалося в краплях наведенихвище розчинів, поміщених на дно експериментальної камери. У результатідля нашої системи Rmin = 0.33, Rmax = 8.9 і b = 12.8. Параметр Кd був взяв зроботи [Grinkiewicz et al, 1985] і дорівнював 224 нмоль/л.
3 Фарбування зрізів флуоресцентним барвником
Для введення кальцій - чутливого зонда в клітку, зрізиінкубувати в розчині Тіроде, що містить естеріфіцірованнуюнезаряджену форму барвника Фура-2 ацетоксіметілестер в концентрації 5мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиду з додаванням детергенту
Плуронік F-127 (0.02%). У такій формі барвник проникає в клітку, потімендогенними естеразами ефірні групи відщеплюються, зонд стаєзарядженим і залишити клітку не може. Забарвлення проводилася 20 хвилин притемпературі 35оС. Концентрація зонда в клітці визначалася шляхом титруваннязабарвлених клітин розчином барвника, який додавався у позаклітиннийрозчин. Оцінена таким способом концентрація зонда в клітці була вдіапазоні 30 - 70 мкмоль/л.
4 Структура експериментальної установки для двох-хвильового виміруконцентрації кальцію
Принципова схема установки представлена на малюнку 4. Основнимиелементами її є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп,
ФЕУ, модуль попередньої обробки сигналу та комп'ютер.
збудливого Джерелом світла служить ртутна лампа потужністю 50 ват.
Оскільки як кальцій - чутливого зонда використовували індикатор
Фура -2 АМ, що є за збудженням двохвильовому (див. вище), то длякількісного визначення [Ca2 +] i необхідно було одночасноіндукувати флуоресценцію обома довжиною хвиль. У нашій конфігураціїперіодична зміна фільтрів збудження була реалізована за допомогоюобертання колеса з вмонтованими в нього двома інтерференційними фільтрами
360 і 390 нм. Частота обертання була 5 Гц. Управління системою змінифільтрів здійснювалося за допомогою кальцій - вимірювального модуля фірми
Luigs und Neumann, Німеччина. Цей же модуль був інтерфейсомпопередньої обробки.
Оптична частина установки була змонтована на базі мікроскопа
Axioskop, Zeiss. Поділ потоків збудливого світла та флуоресценціїпроводилося за допомогою діхроіческого дзеркала. Світло, що пройшов черезфільтр для збудження флуоресценції, відхилявся діхроіческім дзеркалом іза допомогою високоаппертурного иммерсионное об'єктива (40 *, апертура 0.75)фокусувався на об'єкті. Флуоресцентний світло проходило черезвідповідний інтерференційний фільтр і подавався на фотоелектроннийпомножувач (ФЕУ). Для зменшення рівня шумів фіксована діафрагма (1мм) була розташована перед ФЕУ. У результаті флуоресцентний сигналзбирався з фокальній площині діаметром 50 мкм, що дозволило значнополіпшити співвідношення сигнал/шум.
Модуль попередньої обробки дозволяв проводити компенсаціюавтофлуоресценціі і, при необхідності, підсилювати сигнал, після чого віноцифровуються за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA і обробляєтьсякомп'ютером за допомогою програм Tida 5.0 і Wintida, розроблених у
Гейдельберзі, Німеччина.
Малюнок 4. Принципова схема експериментальної установки длядвохвильовому вимірювання кальцію.
5 Розчини та зміна розчинів
Під час роботи зі зрізами всі розчини готувалися на основі розчину Тіроде
(в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26,
KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постійно аерірованной газовою сумішшю 95% О2
+ 5% СО2 (pH = 7.4). Бескальціевий розчин готувався еквімолярних заміною
CaCl2 на MgCl2 та добавкою 1 ммоль/л EGTA, розчини з підвищеним вмістомкалію або кофеїну - заміною NaCl на відповідну кількість KСl абокофеїну.
Зміна розчинів проводилася протокою, швидкість якого можна буловаріювати від 10 до 20 мл/хв. Обсяг експериментальної камери становив
0.5 мл. Всі експерименти були проведені при температурі (32 (С).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Аплікація АТФ в більшості нейронів моторної кори (98 з 102)викликає швидке і короткочасне підвищення концентрації цитозольногокальцію [Ca2 +] i. Концентрація [Ca2 +] i досягає свого максимуму напротягом 6-8 секунд і потім відновлюється до базального рівня притриваючому присутності АТФ. Відмивання АТФ призводить до відновлення
[Ca2 +] i до рівня спокою. Характерний вигляд АТФ - індукованого кальцієвоготранзіента представлений на малюнку 5.
Амплітуда АТФ - індукованого кальцієвого транзіента варіювалася вмежах від 50 до 450 нМ. Середнє значення викиду [Ca2 +] i викликаногододатком АТФ у концентрації 100 мкМ знаходилася в межах 200-250 нМ.
Спостерігалася доза - залежність амплітуди відповіді від концентрації АТФ умежах від 10 до 2000 мкМ. На малюнку 7 представлена апроксимаціїекспериментальних точок сигма - функцією. Концентрація АТФ, при якійамплітуда відповіді складає половину максимальної, - 220 ± 20 мкм.
Метою наших досліджень було визначення підтипів пурінорецепторовзалучених до генерацію [Ca2 +] i транзіента. Відомо, що АТФ активуєкілька типів пурінорецепторов, а саме Р2 пурінорецептори підтипів Р2хі Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а також Са2 +канали плазмалемми (Кришталь, 1983).
З метою забезпечення достовірності отриманих даних, беручи доуваги той факт, що робота проводилася на тонких зрізах мозку, мипровели серію експериментів з придушенням розповсюдження потенціалівдії за допомогою тетродотоксин (TTX). При використанні TTX з'ясувалося,що амплітуда і форма [Ca2 +] i транзіентов не змінюється або змінюєтьсянезначно. Отримані результати дозволяють нам припускати, щоотримані нами дані відображають процеси, що відбуваються в окремійспостерігається клітці. На жаль ми не мали можливості проводити всіексперименти c тетродотоксин через дорожнечу препарату. Для вивченняхарактеристик розглянутих пурінорецепторов, які беруть участь угенерації [Ca2 +] i транзіента, застосовувалися наступні протоколиекспериментів.
1. Додаток АТФ в розчині не містить Ca2 +. Видалення кальцію з позаклітинного розчину незначно впливало на кальцієвий транзіент, викликаний аплікацією 10 мкМ АТФ, але в той же час придушував на 45% ±
7% кальцієвий транзіент викликаний 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).
1. Для дослідження здатності внутрішньоклітинного Ca2 + депо до перезаполненію ми послідовно аппліціровалі АТФ кілька разів з інтервалом у 60 секунд у звичайному розчині і в розчині не містить
Ca2 +. Як видно з малюнка 9 другу аплікація АТФ викликала Ca2 + транзіент меншою (на 30% (4%) амплітуди в порівнянні з першими
(контрольної) аплікацією. Подальші аплікації АТФ розділені 60 ти секундним інтервалом не викликали помітного зменшення амплітуди
[Ca2 +] i транзінета в порівнянні з другою аплікацією у стандартному розчині
У бескальціевом розчині - навпаки, друга аплікація АТФ викликала значне зменшення Ca2 + транзіента на 40% (5% від контролю.
Наступні аплікації АТФ в бескальціевом розчині приводили до послідовного зменшення амплітуди [Ca2 + ] i транзіента і після двох - трьох послідовних аплікацій сигнал зникав взагалі
(малюнок 10). Таке зменшення ймовірно обумовлено виснаженням внутрішньоклітинних депо.
1. Інгібіція захоплення Ca2 + ендоплазматичним ретикуло тапсігаргіном
(спецефіческіх блокатором Ca2 + насоса ЕПР) зменшувало [Ca2 +] i транзіенти, викликані додатком АТФ, на 63% (5% для концентрації АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Як видно з малюнка 11 додаток тапсігаргіна не впливало на базальний урове?? ь Ca2 + у клітині.
1. Додаток кадмію в концентрації 50 мкМ, верапамілу в концентрації
100 мкМ і 50 мкМ нікелю оборотно зменшував амплітуду [Ca2 +] i транзіента викликаного додатком 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, і 15% сответственно. Дані представлені на малюнку 12.
1. Додаток різних агоністів пурінорецепторов викликало різні за амплітудою відповіді. Порядок відносної активності лігандів для даного об'єкта був таким ATP (S (ATФ (АДФ (((, (-methylene ATP
(AMФ (УТФ ((аденозин (ADO), дані преставлени на малюнку 13.
1. Сурамін, відомий антагоніст Р2 типу пурінорецепторов, зменшував
[Ca2 +] i транзіенти, викликані додатком 100 мкМ АТФ на 76% (7% і також не змінював концентрацію [Ca2 +] i у спокої. Дані представлені на малюнку 14 .
ОБГОВОРЕННЯ
При дослідженні середніх верств неокортексу щурів ми знайшли їхздатність відповідати на додаток АТФ. Таким чином ми можемо зробитивисновок про наявність в даному об'єкті пурінорецепторов. Відповідь на АТФ єдоза - залежним з амплітудою половинного відповіді в 220 нМ. Послідовніпрограми АТФ, після другого додатки, не викликали зменшення амплітуди
[Ca2 +] in транзіентов. З цього можна зробити висновок про відсутністьдесенсітізаціі даного типу рецепторів.
Досліджуючи джерела підвищення цитозольного кальцію ми виявили, що
АТФ активує як іонотропние так і метаботропние рецептори. Блокаторипотенціал - керованих кальцієвих каналів такі як кадмій, нікель іверапаміл зменшували АТФ - індуковані кальцієві транзіенти на 35% -
15%, що говорить про опосередкованому АТФ активуванні потенціал --керованих каналів.
Для дослідження активацію метаботропних рецепторів. Для цього мидокладали АТФ в бескальціевом розчині, - амплітуда відповіді при цьомузменшувалася на 45% (7%. Цей результат говорить про те, що внутрішньоклітиннідепо беруть участь у генерації [Ca2 +] in відповідей, причому їх внесок близькийдо половини. При повторних аплікаціях АТФ в бескальціевом розчині Ca2 +відповідь зникав повністю після другої аплікації, тобто внутрішньоклітинні депоповністю виснажуються. Досліджуючи шлях вивільнення внутрішньоклітинного кальціюми аппліціровалі тапсігаргін - спецефічні блокатор АТФ - азиЕПР. [Ca2 +] in транзіенти зменшувалися на 63% (5%у присутності тапсігаргіна. Аплікація коффеіна, агониста ріанодіновихрецепторів, в клітинах моторної кори 14 денних щурів не викликали підвищеннярівня [Ca2 +] in. Отже викид [Ca2 +] in з внутрішньоклітинного деповідбувається за IP3 - чутливого механізму.
Надалі ми дослідили більш докладно типи присутніхпурінорецепторов. Побудувавши ряд активності агоністів для Р1 і Р2пурінорецепторов по амплітуді відповідей, ми зробили висновок базуєтьсяна відсутності відповіді на аденозин, що в нашому об'єкті присутні тільки
Р2 пурінорецептори. Проводячи подальшу субклассіфікацію Р2 типу рецепторівми використовували сурамін - блокатор деяких типів Р2х і Р2у рецепторів.
Додаток сураміна зменшував амплітуду [Ca2 +] i транзінета викликаногододатком 100 мкМ АТФ на 76% (5%, що
