МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ
СУМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
АГРОНОМІЧНІЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра захисту рослин
Завідувач кафедрою_____________________
А. К. Мішньов
ДИПЛОМНА РОБОТА
на тему: «Біохімія трансгенної картоплі в умовах
України»
Для одержання кваліфікації спеціаліста
за спеціальністю 7.130105 - Захист рослин »
Виконавець _________________ (Загорулько О.)
Науковий керівник ______________ (Чіванов В.Д.)
Консультант з екологічної експертизи ________________ (Жатова Г.О.)
Консультант з питань
техніки безпеки _________________ (Шандиба О.Б.)
Суми - 2001
ЗМІСТ
Стор.
Вступ ............................. ....................................
....... ..........................................
1 . Огляд літератури ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....
1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини
Solanaceae ................................ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
1. Глікоалкалоїді рослин картоплі та їх будова ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....
2. Глікоалкалоїді як токсичні сполуки ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
2. Природні умови господарства ............................................... .........
..............
3. Методика проведення досліджень ............................................... .........
......
3. Результати досліджень ................................................ ........
.........................
4. Охорона праці ................................................ .............
.............................. ....
5. Охорона навколишнього середовища ............................................... ........
Висновки .................................. ..........................
................. .............................
Список використаної літератури ........... ...............................................
.....
ВСТУП
Підвищений "тиск" на організм людини ксенобіотічніх сполук природногота штучного походження обумовлює необхідність поглибленого вивчення такихсполук, і в першу тих із них, котрі входять до складу найбільш поширениххарчових продуктів, зокрема картоплі. Глікоалкалоїді картоплі являють собоюгрупу вторинних метаболітів, яким притаманні найрізномантніші видибіологічної активності []. Так, дослідамі in vitro доведена здатністьцих сполук спрічінюваті хромосомні аберації, порушувати цілісність ліпосомта природніх біомембран тощо []. Останнє свідчить на користь того, щоглікоалкалоїдам притаманна потенційна мутагенна і, можливо, канцерогеннихактивність []. Виходячи з наведеного, цілком природньою є підвищеназацікавленість в дослідженні глікоалкалоїдів з боку фахівців в галузяхмедичної токсикології і генетики людини, тим більше, що в останні роки насвітовий ринок виходять нові сорти продовольчої картоплі, отриманої якшляхом "класичної" селекції за участі дикоростучих видів роду Solanum [
], Так і за допомогою генетичної інженерії (New Leaf (, Monsanto, США).
Обидва підходи не виключають біосинтезу в тканинах рослин картоплі, зокремаБульба, окрім характерних для культурної картоплі глікоалкалоїдів (-
Соланіну та (-Чаконіну "мінорніх" глікоалкалоїдів (солакаулін, соласолін,соламаргін, деміссін, томатін, лептін І і ІІ, лептінін-І і ІІ тощо), яківедуть походження з дикоростучих попередників, або синтезуються de novo [
]. Останнім притаманні токсикологічні характеристики, відмінні від добревідомих аналогічних показників (-Соланіну та (-Чаконіну. Якщо прийняти доуваги встановлений факт щодо синергетичного багаторазового підсиленнябіологічної активності суміші двох різних за хімічною структуроюглікоалкалоїдів [], то стає цілком обгрунтованою необхідністьдосліджень кількісних та якісних показників глікоалкалоїдів продовольчоїкартоплі паралельно з Селекцією та молекулярною інженерією, успішність якихзалежить від наявності нових високочутливий методів фізико-хімічногоаналізу. Складність аналізу сумарної фракції глікоалкалоїдів з рослинкартоплі пов'язана, зокрема з тим, що субфракція "мінорніх" глікоалкалоїдівне перевищує за масою 0,5-5% [].
Останнім часом в аналізі біомолекул набули широкого розповсюдженняметоди м'якоіонізаційної мас-спектрометрії, зокрема плазмов-десорбційнамас-спектрометрія (PDMS). Зважаючи на це, нами зроблена спробапроаналізувати фракцію глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгеннихсортів NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic за допомогою PDMS мас -спектрометрії. Таким чином, метою наших досліджень був докладний аналізглікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних сортів NewLeaf 6
Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic новітнім мас-спектрометричного методам.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини Solanaceaе
Рослини картоплi культурних та диких видів мiстять серед численнихорганiчніх сполук групи вторинних метаболітів глiкоалкалоїді [],Найважливiшими з яких є a-соланiн, a-чаконiн, деміссін, лептіні I, II, III,соламарін, коммерсонін []. Фiзiологiчнi функцii глiкоалкалоїдiвпов'язанi з явищем стiйкостi рослин картоплі проти фiтопатогенiв iшкiднікiв []. Крiм того, глiкоалкалоїді беруть безпосередню участь убiохiмiчніх процесах, які притаманні тканинам листкiв, пагонiв, квiток,бульб рослин картоплi (цвiтiння, видова сумiснiсть, утворення насiння);обумовлюють разом з iншими вторинними метаболiтамі смаковi якостi тапрідатнiсть картоплi для переробки [], а також мають певне значення яктоксичні, ембріотропні і канцерогеннi сполуки природнього походження [
]. Зважаючи на це, багато перспективних за врожайнiстю та iншимигосподарсько-корисними якостями сортiв картоплi не були рекомендованi дляширокого використання саме завдяки пiдвищення вмiсту глiкоалкалоїдiв [
]. На думку вiтчизняних та зарубiжних [] дослiдникiв, кiлькiснi та якiснiхарактеристики глiкоалкалоїдiв нових сортiв i гiбрідiв картоплiзаслуговують на поглиблене вивчення. Одним з найважливіших питань,пов'язаних з біохімією та фізіологією глікоалкалоїдів, яке і досі незнайшло однозначного вирішення, є встановлення корелятівніх зв'язків міжпараметрами метаболізму глікоалкалоїдів та ступенем стійкості сортівкартоплі проти шкідників і фітопатогенів []. Іншим дискусійнимпитанням є невизначеність зв'язків між кількісним накопиченнямглікоалкалоїдів в тканинах рослин картоплі різних сортів, зокрема Бульбах іумовами вирощування (погодно-кліматичні умови протягом конкретноговегетаційного сезону, тип грунтів, удобрення тощо), а також умовамизберігання (температура, освітленість, вологість тощо) []. На думкупровідних вчених дискусійні та суперечливі результати в цьому напрямкудослідження отримані тому, що, по-перше, на інтенсивність біосинтезувторинних метаболітів взагалі і глікоалкалоїдів зокрема, різноспрямовановпливає велика кількість факторів зовнішнього середовища і це, разом зпідвищеною лабільністю та чутливістю ферментних систем метаболізмуглікоалкалоїдів до зазначених факторів обумовлює суттєві розбіжності, проякі згадувалось вище; і, по-друге, більшість ранніх робіт були проведенібез урахування різноманітності глікоалкалоїдів за хімічною структурою - вмежах цих досліджень визначали тільки їх сумарну кількість вагових абоколоріметрічнім методами [].
Проте, глікоалкалоїді картоплі являють собою досить велику групусполук, до складу якої входять «мажорні» (a-соланiн та a-чаконiн укультурних видів картоплі) і численні «мінорні» (b-соламарін, деміссідін,
5b-соланідан-3a-ол, томатіденол) компоненти. Крім того, тканини рослинкартоплі містять спеціалізовані ферментні системи, які модифікують інтактнімолекули глікоалкалоїдів з утворенням численних проміжних сполук,фізіологічна роль яких вичерпно не з'ясована (b-соланін, b-чаконін, g -соланін, g-чаконін тощо) []. Таким чином, дослідження статичних ідинамічних кількісних та якісних параметрів глікоалкалоїдів рослин картоплірізних сортів в процесах вирощування в умовах конкретних кліматичних зон,зберігання та переробки, а також під впливом фітопатогенів, мають певніперспективи за умов використання з метою аналізу цих сполук новихвісокоінформатівніх фізико-хімічних методів досліджень []. У
Сумському ДАУ та Інституті прикладної фізики НАНУ (м.Суми) в 1994-2000 рр..в межах проекту «М'якоіонізаційна мас-спектрометрія в агробіології» провелицикл досліджень глiкоалкалоїдів рослин картоплi за допомогою новiтньогофiзико-хiмiчного методу аналізу полярних, термолабільніх, нелетючіхорганiчніх сполук - плазми-десорбційної часопрольотної плазмов -десорбцiйної мас-спектрометрiї з iонiзацiєю уламками подiлу 252Cf (МС-
ПДМС) [].
алкалоїди являють собою велику групу рослинних речовин різногохімічного складу, яким притаманна специфічна дія на організм ссавців талюдини. Алкалоїди є азотовміськімі гетероціклічнімі сполуками, що містять всвоєму складі атом азоту. Загальною властивостей даної групи речовин є їхнадзвичайно сильна фізіологічна дія на організм тварин та людей. Більшістьалкалоїдів діють на нервову систему: в невеликих дозах здійснюютьзбуджуючих вплив, в великих - пригнічують, а в ще більших є сильнодіючимиотрутами []. Фізіологічне значення алкалоїдів в життєдіяльності самихрослин досі не з `ясовано. До цього часу не вдалося ще з великоюдостовірностю показати місце алкалоїдів в життєво важливих процесах обмінуречовин, з іншого боку немає неспростовних доказів того, що алкалоїдоноснівиди рослин можуть існувати без алкалоїдів [].
У ряді робіт відзначається вплив алкалоїдів на обмін речовин у рослин,виникнення квітів, формування органел та органів рослин, ріст клітин, поділядер і т.д. Було доведено, що алкалоїди в клітинах рослин якимось чиномізольовані від внутрішнього середовища клітини. Так, розчини нікотину,нанесені на рослинні тканини табаку, чинять всебічну негативнуфітотоксічну дію навіть при концентрації, рівній їх концентрації втканинах. Доведено, що високий вміст алкалоїдів часто пов `язаний зізниженням сили росту рослин. Інакше кажучи, у рослин в період вегетації таспокою існує тісний взаємозв `язок:« білковий азот - алкалоїди ». Цимипричинами, на думку Горяєва, пояснюється зміна складу алкалоїдів, а вдеяких випадках і їх повна відсутність в тканинах алкалоїдніх рослин
(Solsola richteri. Girgensonia Oppositiflora. Anabasis turkestanika) [
].
1.1. 1. Глікоалкалоїді рослин картоплі та їх будова.
Глікоалкалоїді, які містяться в Бульбах картоплі, раніше називализагальним терміном «соланін». В наш час встановлено, що так званий
«Соланін» являє собою суміш якнайменше 6 різних глікозідніх сполук:? -,? -
,?-Соланіна та? -,? -,?-Чаконіна. Ці сполуки мають один і той же аглікон
( «Корові ядро») - соланідін і відрізняються між собою складом глікозідноголанцюжка (Рис.1). Трісахаріді -?-Соланін і?-Чаконін є основними формами іскладають в тканинах картоплі біля 95% усієї суми глікоалкалоїдів груписоланіна []. Крім? -,? -,?-Соланіна та? -,? -,?-Чаконіна, відоміінші глікоалкалоїді пасльонових: солакаулін, соласолін, соламаргін,демісін, томатін, лептін, лептінін-1, лептінін-2 та інші. Всіглікоалкалоїді складаються з двох основних складових, виникаючих прикислотного гідролізі цих речовин - аглікона, який і є власне «алкалоїдом»,і декількох моносахарів, які знаходяться в молекулі глікоалкалоїда ввигляді глікозідного ланцюга, зв `язаного з агліконом [].
Глікоалкалоїді культурної та дікої картоплі (Solanum) можна систематизуватив окремі групи. До групи соланідіна відносяться:? -,? -,?-Соланін та? -,? -
,?-Чаконін, солакаулін і глікоалкалоїд, виділений з групи Akaulia. Іншугрупу алкалоїдів складають сполуки, агліконом яких є соласодін. Сюдивходять соласонін і соламаргін. Соласонін і соламаргін є основнимиалкалоїдамі Solanum nigrum, Solanum laciniatum більшості інших видів
Solanum
[].
Соласодамін знайдений в листках Solanum auriculatum і Solanummagrinatum. В групу, яка містить в якості аглікона демісідін, входитидемісін, знайдений у Solanum demissum і глікоалкалоїд, виділений із Solanumpolyadenium. Лептіні - глікоалкалоїді,
Рис.1. Хімічна структура агліконів, знайдених в рослинах картоплі [
].
знайдені Куном і Левом, виявлені у Solanum chacoense. Групи Eutuberosa,
Andigena, і Commersonia містять тільки - соланін, ці види містять такожчаконін. Ці два глікоалкалоїді зустрічаються завжди разом, що доведенохроматографічнімі дослідженнями. Демісін присутній в рослинах групи Demissaі Acaulia, за виключенням Solanum acaulia, в складі якого знайденосолакаулін. Демісін знайдений також у Solanum jamesii. У форм, які не даютьбульб, крім (-соланіна, який і тут частіше всього зустрічається, найбільшугрупу складають форми, які містять томатін. І тільки єдина форма Solanumpoliadenium, яка створює бульби, містить томатін. Інші алкалоїдизустрічаються тільки в деяких форм, нпріклад, соласодамін - у Solanumsodomaneum i Slanum aviculare.
Всі алкалоїди картоплі належать до стероїдної групи похіднихціклопентанопергідрофенантрена і складаються з алкалоїда (аглікона) тацукру, зв'язаного з ним глікозіднім зв'язком. Аглікон має стероїдну будову,містить атоми азоту, який утворює третину або вторинну аміногрупу.
Прикладом першого типу являється соланідін, іншого-томатідін і соласодін.
Глікозідна частина являє собою моно-, ді-, три-, і тетрасахаріді; до їхскладу може входити глюкоза (Glu), галактоза (Gal), Рамноза (Rha) і ксілоза
(Xyl). Наприклад, (-соланін складається з аглікона-соланідіна ітрісахаріда, який при гідролізі кислотою розпадається на галактозу, глюкозуі Рамноза. Соланін має розгалужений цукровий ланцюжок: безпосередньо загліконом зв `язана галактоза, а глюкоза і Рамноза складають бокові ланцюги.
Подібну будову мають глікозідні частини глікоалкалоїдів демісіну, томатіну,
(-чаконіну, соласодіну і соламаргіну [].
Під впливом гідролізу глікоалкалоїді розпадаються на цукор і аглікон,фізичні і хімічні властивості якого і вказують на велику схожість його зістероїдами. Стероїди утворюють різноманітну групу важливих природнихречовин. Сюди відносяться стеріні, жовчні кислоти, гормони розмноження,вітаміни групи Д, глікозиди, різні алкалоїди і інші речовини. Базовоюструктурою усіх стероїдів є стеран (ціклопентанопергідрофенантрен).
До класу стероїдів належать також фітостеріні: сіто-, стігма-, ікампестерін, холестерін, ергостерін, жовчні кислоти.
Сполуки стероїдів з цукром належать до групи глікозідів. У цю групу,крім глікоалкалоідів, входять «сердечні глікозіді», які містяться в деякихрослинах із родини Strophanthus і Digitalis. Стероїдні саконіні такожявляють собою глікозіді агліконів, котрі е. похіднимиціклопентанопергідрофенантрена. Сапоніни не містять в своєму складі атомазоту [].
Одним з доказів схожості аглікона глікоалкалоідів зі стероїдами є те,що їх можливо перетворити в метілціклофенантрен. Ця сполука синтезуєтьсятим же шляхом із стероїдів. При третьому атомі вуглецю аглікона знаходитьсягрупа, яка може сполучати глікозідно з моносахаридами. Остаточностероїдну будову аглікона вдалося довести, коли похідне аглікона отримали звідомих стероїдів і, навпаки, похідні стероїдів-із агліконаглікоалкалоїдів; наприклад, із безазотної речовини кріптогеніна --соласодін, із соласодіна - стероїдній сапогенін - діосгенін. Велікасхожість з сапонінамі виявляється і в будові сахарної частиниглікоалкалоідів. Загальною властивістю сапонінів і глікоалкалоідівявляється їх гемолітічна дія [].
Таким чином, основними глікоалкалоїдамі культурної картоплі є (--соланін та (-чаконін. Всі глікоалкалоїді різних видів картоплі складаютьсяз двох основних частин: аглікона (алкалоїда), який має стероїдну будову, імолекули цукру, в склад якої входять моно-, ді-, три-, або тетрасахаріді.
1.1.2. Глікоалкалоїді як токсичні сполуки
Глікоалкалоїді соланін та чаконін в невеликій кількості розглядаєтьсяяк цілком можливі компоненти бульб картоплі, при надмірній кількості вонипогіршують смакові якості картоплі. У бульб з `являється гіркуватий смак,при вживанні таких бульб в харчування вінікають чуття свербіння в горлянці [].
Встановлена визначена кореляція між наявністю глікоалкалоїдів іорганолептичними смаковими якостями вареної картоплі. При дуже низькомувмісті глікоалкалоїдів в Бульба (порядку 1-5 мг%) смак вареної картоплітрохи гірший, ніж при середньому (5-10 мг%). Але збільшення їх вмісту вищеза 26 мг% на сиру речовину дуже погіршує смак вареної картоплі і стаєнебезпечним для здоров `я людини [].
Бульби картоплі, які містять ніж 20 мг% глікоалкалоїдів, нерекомендується вживати в харчування, осбливо коли картопля вареться зішкірочкою. Почіщені бульби менш небезпечні, так як значна частинаглікоалкалоїдів видаляється зі шкірочкою, а частина переходить в воду, приварінні ж неочищених бульб цього не відбувається вз `язку з слабкоюпронікністю шкірочки. За даними М.Г. Шевченко [], нйбільшу небезпеку дляздоров `я становить нерозчинними в воді соланін, зосереджений в основіпророслх вічок.
3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі.
Глікоалкалоїді привертають увагу селекціонерів-картоплярів в зв `язку зїх токсичною дією на бактеріальні та грибкові захворювання картоплі, атакож у зв `язку з токсичною дією на колорадського жука [].
Встановлено, що соланін затримує ріст бактерій, а 0,1-0,5%-ний розчинйого викликає відмирання протоплазми. Виділені фунгіцідні якостіглікоалкалоїдів в відношенні ряду патогенних грибів, таких як Microsporumaudoine, Trichophyton gypseum, Fusarium oxуsporum, зооспор Phytophthorainfestans, Helminthosporum carbonum.
В Інституті біохімії РАН досліджували фунгіцідні властивостіглікоалкалоїдів і інших сполук картоплі, наділених антібіотічнімі якостями,а також вивчали дію механічних пошкоджень і зараження Phytophtora infestansна утворення і розподіл глікоалкалоїдів в тканинах бульб [].
Виявилось, що глікоалкалоїдам (-соланіну та (-чаконіну притаманна більшафунгіцідна активність ніж фенолу (кофейній і хлорогеновій кислот). Так,в концентрації 0,1 мг/мл останні не впливали на кінетичні показники ростуфітофторі, тоді як глікоалкалоїді прігнічувалі його майже на 70%. Зооспорицього паразита гинули вже при концентрації (-соланіна 5 мкг/мл.
Соланін, чаконін і соланідін інгібують радіальній зростання Alternariasolani на картоплі. По ступеню інгібування на першому місці стоїтьсоладінін, потім чаконін і соланін. При концентрації 500 мг/л соланінвикликає 50% інгібування росту після 96-годинного періоду інкубації при
24оС. Встановлено наявність збільшення чутливості листків до розвіткупошкодження яке супроводжується зменшенням концентрації глікоалкалоїдів влистках в міру їх старіння. Наприклад, 30-денні листки сорту Катадінмістять 950 мг/кг глікоалкалоїдів і стійкі до паразита, тоді як старіючі 90 --денні листки містять тільки 150мг/кг глікоалкалоїдів і значно уражаютьсягрибом [].
Проте подальші дослідження показали, що хоча глікоалкалоїді і наділеніфунгітоксічністю, вони все ж таки не є вирішальним фактором в явищіфітоімунітета картоплі []. Взагалі після інфікування в Бульбах картоплінакопичується хлогенова та кав'ярні кислоти, скополетин, (-соланін, (--чаконін, рішітін, фітуберін. Всі зазначені сполуки, за виключенням рішітіната фітуберіна, присутні в шкірочці бульби в кількостях рівних або більших,аніж синтезованих за умов інфікування патогеном очищеної картоплі.
Хлорогеновую та кав'ярні кислоти знайдені в усіх частинах рослини. Вонипродукуються в Бульбах картоплі в результаті пошкоджень та інфекціїбагатьма патогенними та не патогенними організмами і накопичуються (абоприсутні) в деяких здорових тканинах рослини картоплі в кількостях, якіможуть пригнічувати мікроорганізми. Механічне пошкодження чи інфекціявикликає швидке окислення цих речовин, а продукти окислення токсичні длябагатьох мікроорганізмів. На ранніх стадіях інфекції після інокуляції бульбдеякими расами фітофторі накопичуються поліфенолі. В тканинах,інокульованіх несумісними расами фітофторі, або в зрізах накопичуєтьсятільки хлорогенова кислота.
Глікоалкалоїді (-соланін і (-чаконін зосереджуються біля пошкодженихділянок бульби []. Про те, що глікоалкалоїді не є вирішальним чинникомв імунітеті картоплі, свідчать результати дослідів, проведених на раневійперідермі бульб. У зараженій фітофторою раневій тканині картопліглікоалкалоїді НЕ накопичуються. Звідси виходить припущення, що фітофторанаділена здатністю руйнувати глікоалкалоїді.
У раневій тканині, зараженій несумісною расою фітофторі, невідбувається накопичення глікоалкалоїдів, не виявляються фітоaлексінірішітін і любімін. У непошкодженій паренхімі Бульби не синтезуються ніглікоалкалоїді, ані фітоалексіні. У раневій перідермі весь мевалонатвикористовується на синтез глікоалкалоїдів. У відмерлій тканині, навпаки.
Утворення глікоалкалоїдів майже не відбувається, а мевалонатвикористовується для синтезу рішітіна та любіміна. В зараженій тканині, які в раневій, глікоалкалоїді хоча і утворюються, але розкладаютьсяфітофторою [].
В США проводили роботи по виведенню сортів картоплі, наділенихполігенною стікістю до фітофторі, при цьому стикалися з труднощами,обумовленими отриманням гібридів з високим вмістом в Бульбахглікоалкалоїдів. Дослідження, проведені в селекційному центрі штату Західна
Віргінія, на 15 клонах картоплі, наділених різною ступеню полігенноїстійкості до фітофторі і трьох стандартних сортах, не підтвердили наявністьвзаємозв `язку між зазначеною стійкістю і вмістом в Бульбах глікоалкалоїдів.
В результаті прийшли до висновку, що можливе створення нових сортівкартоплі з полігенною стійкістю до фітофторі і звичайним, або зниженимвмістом глікоалкалоїдів в Бульба. Встановлена висока ступінь кореляції
(r = 0,82) між вмістом глікоалкалоїдів в листках та Бульбах випробуваногоселекційного матеріалу [].
Дослідженнями Куна було встановлено, що непоїдання листків дикоговиду картоплі Solanum demissum колорадських жуком обумовлена наявністю вних глікоалкалоїда демісіна []. Це спонукало вітчизняних ботаніківорганізувати експедицію в країни Південної Америки для пошуків диких видівкартоплі, стійких до колорадського жука. Під час експедиції було знайденобіля 10 таких видів, частина з них використовується в селекції прививеденні нових сортів картоплі.
Глікоалкалоїді бульбоносніх видів дикої картоплі належать головнимчином до групи соланіну чи демісіну. Найбільша кількість стійких доколорадського жука видів картоплі - S.commersonii, S.chacoense,
S.gibberulosum, S.shikii, S.dolichostigma відноситься до Commersonia, аледемісін в них відсутній. Вісокостійкімі до колорадського жука виявилисьтакож S.polyadenum, S.jamesii, котрі містять малу кількість демісіну. Диківиди картоплі, які характеризуються низьким вмістом демісіну, завиключенням видів Acaulia, виявились надто стійкими до колорадського жука [
].
2. ПРИРОДНІ УМОВИ ГОСПОДАРСТВА
Виробнича практика була проведена в учбово-навчальному комплексі
(УНВК) Сумського державного аграрного університету (СДАУ) який знаходится вм. Суми (південна частина). УНВК розташований у північній частині
Лівобережного Українського Лісостепу, яка в цілому характеризуєтьсяпомірним кліматом. Літо - тепле, із значною кількістю опадів. Зима - недуже холодна, з відлигами.
Згідно багаторічних даних Сумської метеостанції, середньорічнатемпература району, де розташований УНВК, дорівнює 60 С (табл. 1). Найбільшхолодними місяцями є січень і лютий, найбільш теплими - липень, при чомуабсолютний мінімум температур повітря -360 С спостерігається в січні, амаксимум +380 С - у серпні. Останні весняні заморозки у повітріспостерігаються у ІІІ декаді квітня, в окремі роки - на початку травня, аперші осінні заморозки - на початку жовтня, з
1. Середня багаторічна температура повітря за місяцями
| Місяці | І | ІІ | ІІІ | IV | V | VI | VII | VII | ІХ | Х | ХІ | ХІІ | Середньо |
| | | | | | | | | I | | | | | - |
| | | | | | | | | | | | | | Річна |
| Середньо-мі | -7, | -7, | -2, | 6,3 | 14, | 17, | 19, | 18, | 13, | 6,6 | -0, | -5, | 6, 0 |
| сячної | 8 | 6 | 6 | | 6 | 4 | 6 | 3 | 0 | | 1 | 5 | |
| температура | | | | | | | | | | | | | |
| повітря | | | | | | | | | | | | | |
коливаннями 11.09. - 27.10. Довжина безморозного періоду складає приблизно
155 днів. Зима сніжна, характеризується нестійкою погодою, поряд ізнизькими температурами -250 - -300 спостерігаються відлиги з температурами
40 - 50.
Часті відлиги взимку при глибокому промерзанні грунту іноді призводитьдо застою талих вод і утворенню льодяної кіркі, що негативно впливає наперезімівлю озимих. Висота снігового покрову досягає 22 см. Розподіленняйого на більшій частині території нерівномірне: сніг накопичується убалках, улоговинах стоку.
Максимальна глибина промерзання грунту на рівних ділянках сягає 135см, мінімально - 40 см, середня - 88 см.
Середньорічна кількість опадів становить 510 мм (табл. 2).
2. Середня багаторічна кількість опадів за місяцями
| Місяці | І | ІІ | ІІІ | IV | V | VI | VII | VII | ІХ | Х | ХІ | ХІІ | За рік |
| | | | | | | | | I | | | | | |
| Опади в мм | 28 | 23 | 26 | 40 | 43 | 67 | 68 | 53 | 45 | 42 | 33 | 37 | 510 |
З таблиці видно, що найбільша кількість опадів випадає у літньо -весняний період, що співпадає з максимальним ростом сільськогосподарськихкультур і сівбою озимих і сприяє їх розвитку.
Взимку переважають північно-східний та північно-західний вітри.
Напрямок їх часто змінюється, що призводить до різних змін температури. Заостанні роки спостерігаються суховійні південно-східні вітри, які сильновисушуються грунт і знижують врожай основних сільськогосподарських культур.
Рельєф УНВК рівнинний, але західна частина дещо полога і засіваєтьсябагаторічними травами.
Грунти, які представлені на дослідному полі,-це типові чорноземи,важкосугліністі, середньогумусні на льосовідному суглинки. Грунтхарактеризується високим вмістом крупнопілові часток (0,01-0,05 мм), часткаяких сягає 55% і більше. Вміст часток, які належать до фракції розміром
0,001 мм і менше сягає 25-30%, що обумовлює високу ємність поглинання, якадосягає 28-30 мг/екв на 100 г грунту. Реакція грунту практично нейтральна.
Значення рН коливається в межах 6,5-7,5/6,5-7,6 у верхніх горизонтах і 7,3 -
7,5 у нижніх (карбонатних).
Розорювана частина грунту приблизно до 30 см., яка містить у собінеобхідні елементи живлення (N, P, K): азоту нітратного 2,2-3,; азотуамонійного 11,2-10,6; фосфору 157, калія 70 мг на 100 г грунту, відсотокгумусу 4,0%.
УНВК заснований в 1987 р.. для проведення науково-дослідної роботи тадля демонстрації різних технологій вирощування сільськогосподарськихкультур. До складу УНВК входять комплекс по оздоровленню насінневоїкартоплі методами меристема, обласне об'єднання "Сортнасіняовоч" і науково -дослідне об'єднання "Еліта" з лабораторією картоплі і досліднимгосподарством. До складу господарства також входять дослідні поля вс.Постольне, Гамаліївка та КОСІВЩИНА, де вирощуються озима пшениця, овес,гречка, картопля, ячмінь, овес, гречка, горох, багаторічні трави, капуста,морква, столові буряки, цибуля. Урожайність деяких культур в 2000 році:озима пшениця 35 ц/га; овес 41 ц/га; гречка 20 ц/га; картопля 150 ц/га;соняшник 15 ц/га; яра пшениця 13 ц/га; горох 13 ц/га; цукрові буряки 460ц/га, кукурудза на зерно - 42 ц/га.
Дослідні поля УНВК займають 43 га сільськогосподарських угідь.
Сівозміна займає майже всі 43 га. Схема сівозміни така:
1. Овес 10 га.
1. Озима пшениця 5 га.
2. Картопля (насіння) 0,7.
3. Ячмінь.
4. Гречка 4,6 га.
5. Цукровий буряк 10 га.
Із сівозміни виділена ділянка 2,5 га, розміщена на схилі, яказасівається багаторічними травами для тварин віварія.
Крім того в межах УНВК вирощували в 2000 р.такі культури:
1. Багаторічні трави 2,4 га
2. Молодий сад 3 га
3. Томати 0,2 га
4. Цибуля 0,25 га
5. Буряки столові 0,07 га
6. Морква 0,07 га
7. Кріп 0,01 га
8. Петрушка 0,01 га
9. Капуста 0,75 га
10. Огірки 0,05 га.
На дослідних ділянках проводять експериментальні роботи кафедриселекції (0,7 га) і рослинництва (0,3 га).
Для роботи на дослідних полях УНВК закріплений підрозділ і повнийкомплекс тракторів та сільськогосподарського обладнання. Для проведеннядослідів виділено ділянки площею в 0,1 га. В склад підрозділу входять:завідуючий дослідним полем і два інженери. Для зберігання і ремонту технікиза дослідним полем закріплений спеціальний бокс, а для зберігання зерновоїпродукції - ангар. Техніка УНВК представлена тракторами Т-150, Т-70, Т-
150К, МТЗ-82, Т-25, Т-16.
3. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ
У експеріментi використовувались бульби та квітки картоплi сортів
NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic (зразки люб'язно наданіпроф.А.А.Підгаєцькім, Інститут картоплярства УААН, смт.Немішаєве, Київськаобл.). Зразки бульб: вісічкі сумарною масою 500 мг вiдбіралі з 3 місцьбульб картоплi (верхівка, середина та пуповина частина). Маса зразківквіток дорівнювала 200-300 мг. Вісічкі бульб та зразки квіток мілконарізувалі, перемішувалі і ретельно розтирали на холоді ((0 (С) впорцеляновій чашці. У розтерти масу додавали 1 мл 5% оцтової кислоти.
Ретельно перемішувалі одержану масу і залишали її стояти протягом 2-хгодин. Після цього фільтрувалі масу, відбирали рідку фазу і підсушувалі їїв струмені теплого повітря. Одержанi рідкофазні зразки центріфугувалі (300g), вiдбіралі алiквоті рідкої фази об'ємом 20 мкл і наносили на металеву
(Au) поверхню зразконесучого диска приладу "МСБХ" (біохімічний мас -спектрометр «МСБX» виробництва ВAТ SELMI, Суми, Україна) з наступноюреєстрацією мас-спектра (кiлькiсть вiдлiкiв 40000-200000); прискорюючинапруга + 10 кВ) (контроль).
Аналiз одержаного мас-спектра проводили за допомогою сервiсноїпрограми статистичної i математичної обробки спектрiв "МСБХ4" (НДIрадіаційної технiки та автоматизації, Москва). Мас-спектри мiстілі пiкіквазімолекулярніх iонiв (КМI) типу [М + Н] +, де М - молекулярна масааналізованої речовини (глiкоалкалоїду) в атомних одиницях маси (Да), Н --протон, зокрема, (-чаконіну з молекулярною масою 851,0 Да вiдповiдає ПiК
КМI з молекулярною масою 852,0; (-соланiну - з масою 868,0.
Виходячи з спiввiдношення iнтенсівностi КМI глiкоалкалоїдiв проводиливизначення кiлькостi останнiх в зразках. Для кожного зразка екстрактуглiкоалкалоiдiв квіток рослин картоплi проводили по три Вимiрювання знаступним усереднення результатiв за допомогою сервiсної програми.
Глікоалкалоїді для отримання калібрувальної кривої отримували зетіольованіх ротків картоплі шляхом багаторазової обробки: екстрагування 2%оцтовою кислотою, осадження 25% водним рочіном аміаку з підігріваням наводяній бані до випадання осаду, центрифугування, відділення осаду віднадосадкової рідини, розчинення осаду в 2% оцтовій кислоті і т.д. до тихпір, поки не будуть отримані чисті кристали глікоалкалоїдів.
Визначення рівня стiйкостi сортiв картоплi до фiтопатогенiв вмодельних системах in vitro визначали за методикою Кожушко Н.С., Чіванова
В.Д. []. Модельна система для визначення кінетичних параметрівдеструкції глікоалкалоїдів складалась з 500 мг тканини бульби картоплігомогенізованої в 5 мл середовища інкубації - 0,17% розчинi оцтової кислоти
(pH 5,4-5,5), доповненої Змiшаний польовою культурою грібiв Phytophthorainfestans та Fusarium oxysporum spp. []. За контроль правилагомогенізована тканина бульб в стерильною середовищі інкубації бездомішок. Iнкубувалі модельнi системи при 37оC в термостаті, вiдбіраючізразки (100 мкл) на початку інкубації і в подальшому через 1, 2, 3, 4, 5 та
6 дiб. Одержанi зразки центріфугувалі, вiдбіралі алiквоті рідкої фазиоб'ємом 20 мкл, які аналізували як вказано вище.
3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Мас-спектрометрія PDMS досить давно з успіхом використовується зметою аналіза кількісного та якісного складу глікоалкалоїдів рослинкартоплі різних сортів [].
Так, в якості прикладу наводимо типовий мас-спектр свіжого екстрактуз гомогенату бульб картоплі сорту Невська (рис.2). Порівняльнаінтенсивність піків КМІ іонів a-соланіну та a-чаконіну в цьому мас-спектрівідповідає реальному кількісному співвідношенню цих сполук в тканинах бульбкартоплі даного сорту - відомо, що для всіх культурних видів картоплівідношення a-чаконін: a-соланін дорівнює 2 (3): 1. Останнє вірно у томуразі, якщо в тканинах рослини картоплі даного сорту гідролітічні ферменти єпомірно активними, тобто не піддають швидкій деструкції глікоалкалоїдішляхом відщеплення кінцевих залишків моносахаридів.
Крім інтенсивних піків КМІ, що відповідають a-соланіну та a-чаконіну вмас-спектрі присутні також «мінорні» пікі КМІ, які належать b-чаконіну
(молекулярна маса 706 Да) та аглікону глікоалкалоїдів - соланідіну
(молекулярна маса 398 Да) (рис.3). Зазначені сполуки виникають внаслідокперебігу процесів ферментатівноіхімічної деструкції інтактних молекулглікоалкалоїдів, які супроводжуються вiдщепленням вiд молекули a -чаконiну
L-Rha
Solanidine - D-Gal
(Mолекулярна маса 851 Да)
L-Rhaзалишку Рамноза (L-Rha) з утворенням b-чаконіну:
Solanidine - D-Gal - L-Rha
(Mолекулярна маса 705 Да).
Подальша гідролітічна деструкція b-чаконіну призводить до появи всередовищі інкубації вільного соланідіну з молекулярною масою 398 Да.
Незначна інтенсивність піків КМІ, що відповідають продуктам деструкціїсвідчить про те, що внутрішньотканінні ферменти і в першу чергурамнозідаза, яка відщеплює кінцевий залишок Рамноза від молекулиглікоалкалоїду, знаходяться в інтактних тканинах рослин картоплі внеактивного стані. Як відомо, лише нативні молекули глікоалкалоїдів,проявляють притаманні їм потужні фунгіцідні властивості щодо фітопатогенів
[]. Відповідно підвищення активності гідролітичних ферментів, індукованемеханічними або хімічними чинниками, призводить залежно відглибинидеструкційного процесу до часткової чи повної втрати глікоалкалоїдаміфунгіцідної активності. Одним з таких чинників є фітопатогені: добревідомо, що бiохiмiчнi аспекти взаємодii фiтопатогенніх грібiв з рослиннимиклiтини передбачають як ключову компоненту детоксіфiкуючій впливспецiалiзованих ферментних систем грібiв на "захіснi" бiомолекулі ураженихрослин, зокрема глікоалкалоїді. Так, Phytophthora infestans dB та Fusariumoxysporum Schl. пiддають гiдролiтічнiй деструкцiї глiкоалкалоїді картоплi впроцесi iнвазiї, спрічінюючі таким чином втрату ними фунгiцідніхвластивостей []. Дійсно, після 6-ти діб інкубації екстракт гомогенату збульб картоплі сорту Невська в присутності фітопатогенів мас-спектр значнозмінюється, а саме: інтенсивність піків КМІ a-соланіна і a-чаконіна різкознижується з паралельним зростанням інтенсивності відповідних піків КМІ, щоналежать b-чаконіну і соланідіну (рис.3).
Якщо негативний вплив фітопатогенів «накладається» на притаманнуконкретному сорту картоплі підвищену активність рамнозідазі та спорідненихферментів, то сумація зазначених чинників створює оптимальні умови дляповної нейтралізації фунгіцідної активності глікоалкалоїдів за короткийпроміжок часу.
Рис.2. Мас-спектр екстракту з гомогенату тканин бульб картоплі сорту
Невська (контроль). Тут і на подальших рисункахінтенсивність піків КМІ надана в умовних одиницях (ум.од.) --кількостях відліків (стартів).
Рис. 3. Мас-спектр екстракту з гомогенату тканин бульб картоплі сорту
Невська після 6-ти добової інкубації зфітопатогенамі (Phytophthora infestans dB і Fusarium spp. (дослід).
Навпаки, сорти картоплі, рослинам яких притаманна низька активністьгідролітичних ферментів, протистоять фітопатогенам на протягом довшогопроміжку часу, і є, таким чином, порівняно стійкими щодо фітопатогенів.
Зважаючи на те, що ступінь активності ферментних систем є для сортів ігібридів генетично обумовленою ознакою, ми висловили припущення про наявність безпосереднього зв'язку між швидкістю деструкціїмолекул глікоалкалоїдів в тканинах рослини, обумовленою сумарною активністюферментних систем рослини і фітопатогенів і ступенем стійкості окремихсортів картоплі до цих фітопатогенів. Нами досліджені кінетичні параметриферментативної гідролітічної деструкції глікоалкалоїдів тканин бульбкартоплі сортів Свiтанок київський, Невська, Молодiжна, та трансгенноїкартоплі NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic які значноЗокрема,
Світанок київський порівняно стійкий до Phytophthora infestans dB табагатьох інших фітопатогенів; Невська, - середньостійка, а Молодіжна єсортом, малостійкім до фітопатогенів. Щодо рослин трансгенної картоплі, тов літературі є свідчення на користь зниженою ступеня стійкості сортів
NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic по відношенню до збудниківхвороб.
Попередні експерименти з встановлення кількісних та якіснихпараметрів глікоалкалоїдів, притаманних рослинам трансгенних сортівкартоплі, показали, що принципові відмінності останніх
