Біологічна роль, структура і виділення мітохондрій з печінки щурів .

Біологія

Біологічна роль, структура і виділення мітохондрій з печінки щурів.

Зміст

1. Введення

1. Історія питання

2. Перспективи досліджень

1. Біологічна роль мітохондрій

2. Ультраструктури мітохондрій

1. Загальні принципи організації

2. Особливості будови мембрани мітохондрій

3. Опис загальних принципів різних методів виділення мітохондрій

1. Гомогенізація матеріалу

1. Механічна

2. На основі кавітації газів

3. Ультразвук

2. Поділ субклітинних компонентів

1. Центрифугування

2. Поділ в двофазної системі, яка містить дві полімеру

3. Електрофорез

4. Ферменти - маркери мітохондрій

4. Методики

5. Висновок

6. Список літератури

Введення

Історія питання.

Келлікер одним з перших описав характерним чином орієнтованігранули в саркоплазмою поперечно-смугастої м'язи. Йому належить так самочесть першого виділення мітохондрій з клітинних структур. У 1888 році вінвиділив ці гранули з м'язи комах і показав, що вони володіютьмембраною і набрякають у воді. Початком нової ери в цитологічному вивченнімітохондрій з'явилася робота Бенслі і Херрі, які зробили спробувиділити мітохондрій з суспензії зруйнованих клітин печінки, застосувавши методдиференціального центрифугування. Із-за відсутності відповідної середовища длясуспендірованія і недосконалості методу центрифугування Бенслі не вдалосяотримати інтактні мітохондрій, але саме новаторська робота Бенслівизначила злиття цитологічних досліджень мітохондрій з дослідженнямидихання.

Перспективи досліджень.

В даний час основна задача вивчення мітохондрій на молекулярномурівні зводиться до виділення ферментативних компонентів окиснихциклів, визначення їх молекулярної структури і механізму дії, аналізуїх участі в Поліферментні системах в мітохондріях і картування їхлокалізації на структурах мітохондрій. Та обставина, що ферментидихального ланцюга складають більше 25% білка мітохондріальних мембранзмушують розглядати ці ферменти не тільки як функціональні, а йяк структурні елементи мітохондрії.

Біологічна роль мітохондрій.

Протягом ста з гаком років, тобто з часу перших робіт Келлікера
(1850), що спостерігав гранули в саркоплазмою м'язів, велисякропіткі морфологічні дослідження, які поступово готувалигрунт для всебічного вивчення природи мітохондрій. Але тільки в 1949 р.
Кеннеді і Ленінджер встановили, що в мітохондріях протікає циклокисного фосфорилювання, тобто що мітохондрій служать місцемгенерування енергії. З цього моменту починається нова ера у вивченнімітохондрій - ера, в якій блискучі відкриття слідують одне за одним.
У короткий строк були відкриті осмотична, скорочувальна, регуляторна тагенетична функції мітохондрій та знайдено багато хто з тих молекулярнихструктур, які служать первинним субстратом 'цих функцій. Було показанотакож, що мітохондрій забезпечують інтеграцію численних процесівклітинного обміну. Ці дослідження ще не, завершені, але вони можуть служитиприкладом плідності нового підходу до вивчення живого, того підходу,який відрізняє молекулярну біологію.

У розвитку молекулярної біології за останній час намітився новийетап. До цього це були дослідження головним чином, на рівніоднорідних молекул білків і нуклеїнових кислот, дослідження, присвяченіїх структуру, функції і біосинтезу. Тепер же дослідник незадовольняється цим і переходить до вивчення специфічно організованихнадмолекулярних комплексів, якими є клітинні органели.
Деякі функції цих органел також можуть бути витлумачені на рівнііндивідуальних молекул, наприклад молекул окремих ферментів. Але головнаособливість клітинних органел - це інтеграція ферментативних процесів.
Так, завдяки наявності в складі мітохондрій різних білків, ліпідів,нуклеїнових кислот і вуглеводів, з'єднанню їх між собою і впорядкованогорозміщення в просторі у вигляді тришарових мембран ці утвореннянабувають властивості, які зникають при їх розчленовування на окремімолекули. Властивості ці: векторний характер дії мітохондріальнихферментів (на відміну від скалярного, тобто не залежить від напрямку,дії розчинних ферментів), здатність до безпосередньогоперетворення енергії окислення в осмотичну і механічну енергію,здатність до автономного синтезу білків і т. д. Кожне з цих властивостейвизначається не простою сумою реакцій, каталізуються окремимиферментами, а обумовлено взаємодією точно орієнтованих ферментнихі неферментний макромолекул. Само собою зрозуміло, що глибокедослідження і пізнання природи клітинних органел можливо лише шляхомрозчленування їх на окремі молекули з подальшою реконструкцією.

Ультраструктури мітохондрії

Загальні принципи організації.

Внутрішньо простір мітохондрії оточене двома безперервнимисистемами мембран, кожна з яких являє собою замкнений мішок;ці мішки розташовані так, що всю мітохондрій можна уявити собі, якмішок всередині мішка. Просвіт внутрішнього мішка не повідомляється з просторомміж двома мембранами. Зовнішня мембрана гладка, а внутрішня утворюєчисленні впячіванія, які в самому простому випадку мають формуперегородок, але можуть приймати вкрай складні обриси. Паладь назвав цівпячіванія мітохондріальними кристами. Інший характерний компонентструктури мітохондрії - це матриця, який заповнює просвіт, оточенийвнутрішньої мембраною. Відомо, що він містить багато білка і деякийкількість ліпідів; мабуть, він володіє певною організацією ібільш-менш жорсткою структурою. Нарешті, мітохондрії, фіксованіосміем часто містять в матриксі ряд дрібних гранул. Число, діаметр іщільність цих внутрімітохондріальних гранул змінюються в залежності відстану обміну речовин у тканинах.

Особливості будови мембрани мітохондрії.

Так як найбільше практичне значення представляють внутрішнімембрани мітохондрії, що містять дихальні ансамблі, має сенсдетально познайомитися з ультраструктури мітохондріальної мембрани. Придетальному аналізі було виявлено, що мітохондріальних мембрани містять 35
-40% Ліпідів, переважно фосфатидів, і 60 - 65% білка. Невеликівідмінності, які іноді спостерігаються зумовлені різними умовамиотримання при використанні різних фізичних і хімічних способівруйнування структури мітохондрії.

Мітохондрії печінки пацюки містять значні кількостіфосфатидилетаноламін, фосфатидилхоліну, інозітфосфатідов, кардіоліпіну іфосфатидилсерин; зміст плазмалогена і сфінгоміеліна невелика, інодівони зовсім відсутні. Характерне зміст і кількісний вмістліпідів в мітохондріальної мембрани, імовірно обумовлені необхідністюпідтримки термодинамічно сталого подвійного шару ліпідів, що утворюєостов мембрани, що служить опорою для дихальних ансамблів. За -Мабуть, велике значення має той факт, що практично всі ліпідимітохондріальної мембрани екстрагуються сумішшю хлороформ - метанол. Цевказує на наявність лише незначної кількості ковалентних зв'язків міжліпідами і білковими елементами або навіть на повне їх відсутність; цей фактсвідчить про високий ступінь стабілізації ліпідів і білків мембраннихструктури. Крейн показав, що цитохром з з'єднується зфосфатидилетаноламін, утворюючи стійкий комплекс. Можливо, що саметака взаємодія ліпід - білок спільно з гідрофобними зв'язками ізабезпечує таку стабілізацію мембранної структури. Кріддл і співробітникивиділили мономірні форму, яку вони назвали структурним білкоммітохондріальної мембрани. При нейтральному рН структурний білок знаходиться вполімерної формі і не розчиняється у воді. Мономірні форма має молекулярнувага близько 22000, але тенденція до полімеризації порушує точністьседиментаційних і електрофоретичної досліджень. Структурний білокздатний з'єднуватися з чистими цитохрому а, Ь, і її освітоюрозчинних у воді комплексів у молярним відношенні 1:1, причому умовицієї взаємодії для кожного випадку різні. Передбачається, що втаких комплексах утворюються переважно гідрофобні зв'язку. Далі,виявилося, що структурний білок з'єднується з фосфоліпідами. Такимчином, структурний білок здатний до взаємодії з двома іншимимолекулярними основними елементами мембрани - з переносниками електронів із фосфоліпідами. Схильність цитохромів, флавопротеідов і структурного білкадо існування в мономерний і полімерної формах вказує на вираженутенденцію цих молекул до утворення дужестійких макромолекулярних ансамблів, які мають пластинчасті структуру.

Так як для майбутніх досліджень найбільший інтерес представляєцитохром с, то слід приділити особливу увагу саме цього ферменту.

Цей цитохром відрізняється від інших тим, що він легко екстрагуєтьсяз мітохондрій в розчинній формі за допомогою кислот і нейтральних розчинівсолей. Молекулярна вага кристалічного ферменту 12000, ізоелектричноїточка при високому рН; в молекулу входить одна железопорфіріновая група,яка представлена похідним протопорфірину і сполучена (ковалентно) здвома цистеїнових залишками пептидного ланцюга, за допомогою двох тіоефірнихзв'язків.

При рН 7,0 атоми заліза в положеннях 5 і 6, очевидно, координовані ззалишками гістидину; при нейтральних значеннях рН цитохром з не маєтенденції реагувати з киснем. Відомо, щотретинна структура цитохрому з різко змінюється, як функція стануокиснення - відновлення.

Цитохром з відновлюється тіолами, аскорбат, хіноламі, івідновленими цитохрому b і з1, а відновлений цитохром сокислюється ферріціанідом, деякими барвниками і цитохромом а.

Було показано, що у водних розчинах цитохром з здатний дополімеризації; вдалося отримати його димер і очистити так само тример ітетрамер. Вторинна і третинна структура цитохрому з вивчається методомрентгеноструктурного аналізу. Цитохром з легко з'єднується з ліпідами, вЗокрема з фосфатидилетаноламін він утворює комплекс, названийліпоцітохромом с.

Опис загальних принципів різних методів виділення мітохондрій.

Мітохондрії і після виділення зберігають свій вигляд, не дивлячись на те, щомембрани їх кілька пошкоджуються і контури згладжуються. По суті, внаш час їх виділяють тим же самим способом, яким користувався ще
Варбург. Перш за все тканини гомогенізують, використовуючи для цьогоізотонічний або гіпертонічний розчин сахарози (сахароза сприяєзбереження мітохондрій, стабілізуючи мітохондріальну мембрану). Потімметодом диференційного центрифугування відокремлюють ядра і незруйнованихклітини, а отриману надосадову рідина знову центріфугіруют при більшвисоких швидкостях. Мітохондрій осідають при це на дно, утворюючи щільнийбурий осад. Промивши цей осад кілька разів можна отримати доситьчистий мітохондріальну фракцію. Таким шляхом очищені фракції мітохондрійбули виділені з самих різних клітин тваринного і рослинногопоходження і навіть з деяких найпростіших.

У попередніх дослідженнях мітохондрій, як правило, отримували зпечінки тварин, тому що її клітини дуже легко зруйнувати, а також тому,що вона багата мітохондріальної фракцією. Після того, як було виявлено,що бактеріальна протеїназ руйнує клітину, не пошкоджуючи мітохондрій,був розроблений простий і швидкий метод отримання м'язових мітохондрій.
Цукроза сприяє збереження мітохондрій, стабілізуючимітохондріальну мембрану.

Гомогенізація матеріалу. Методи гомогенізації:

• Руйнування клітин
(гомогенізатор Даунс 5-12 мл + щільно прилягає маточка). Гіпотонічнийшок + гомогенізатор.

• Метод заснований на кавітації газів
(Клітинна суспензія збагачена газоподібним азотом на 15-30 хвилиндотримується при тиску до 65 атм., при швидкому зниженні тиску доатмосферного, внаслідок виділення азоту відбувається руйнування клітин.
Органели залишаються інтактним).

• Ультразвук.
Склад середовища в якому руйнують клітини визначається застосовуваним методомгомогенізації. Для руйнування тканин використовують ізоосмотіческій розчинсахарози з розрахунку 100 мл на 10 г сирого ваги тканини, при цьому нестрашноякщо розчину сахарози буде трохи більше, особливо при центрифугуванняв роторі з більшим обсягом. Гіпотонічна середу сприяє руйнуваннюклітин, але, якщо обробка триває занадто довго, при цьому може відбуватисяруйнування клітинних органел. Інші параметри середовища важко узагальнити ікожен мембранний препарат вимагає індивідуального підходу.

Поділ субклітинних компонентів. Центрифугування

•.
Заснований на розходжень у швидкості седиментації (визначається вагою, розміромі формою часток). Речовина, що використовується для приготування градієнта повиннобути легко розчинні у воді, фізіологічно нешкідливий і хімічно інертно;його розчин повинен бути нев'язки, прозорим у видимій і УФ-областяхспектру, повинен створювати низьке осмотичний тиск. Зазвичай поділсубклітинних компонентів проводять в градієнті щільності сахарози. Вінзадовольняє більшості вказаних вимог, але при високихконцентраціях він вельми вязок. Як правило поділ здійснюється за 3-4години або протягом ночі при 80.000 д або вище у роторі з підвіснимистаканчиками.

Обробка гомогенату з печінки пацюки 10 мМ фосфатом калію збільшуєшвидкість седиментації мітохондрій, не впливаючи на осадження лізосом, щодозволяє очищати останні в градієнті щільності перколла.

• Поділ в двофазної системі, яка містить дві полімеру.

Корисним і швидким способом виділення мембран є поділ їх уводної двофазної системі декстран - поліетиленгліколь (ПЕГ), особливо якщовідсутні необхідні ультрацентрифугу і ротори. Метод, продуктивністьякого може бути легко підвищена, заснований на використанні цілого рядувластивостей мембран, включаючи електричний заряд, щільність, масу ігідрофобність. Різниця в цих властивостях обумовлює різний розподілкомпонентів суміші між верхньою та нижньої фазами і поверхнею розділу. Заспорідненості до верхньої фазі компоненти тваринної клітини розташовуються внаступному порядку: ендоплазматичний ретикулум/мітохондрій/лізосоми /апарат Гольджі/плазматичні мембрани Успіх у застосуванні фазових системзалежить від адекватності вибору їх складу. Якість поділу залежить нетільки від конкретного полімеру (поки що кількість їх обмежена - в основномувикористовують декстран і ПЕГ), а й від інших параметрів: молекулярної масиполімеру, концентрації солей, рН, хімічної модифікації полімеру.

• Електрофорез.

За допомогою високовольтного електрофорезу у вільному потоці можна отриматипрепарати субклітинних мембран і органел високого ступеня чистоти.
Підлягає розподілу суміш компонентів подають тонкою цівкою врозділяє буфер, який рухається в електричному полі; мембрани, що несутьрізний електричний заряд переміщуються в розділяє комірці зі швидкістю,визначається їх зарядом, при цьому досягається 100%-не дозвіл. Цем'який спосіб виділення мембран з високим препаративних виходом. Методикуелектрофорезу у вільному потоці вперше застосували для виділення лізосом імітохондрій з печінки пацюки.

У таблиці 1 наведені ферментні маркери, до яких відносятьсяпорівняно стабільні ферменти, активність яких досить висока і їїзручно вимірювати. Зазвичай ці вимірювання проводять як можна швидше післявиділення; взірець при цьому зберігають при 40С і не заморожують. Відзначено, щотакий фермент, як цитохром с - редуктаза може виявитися лабільним івтрачати активність у заморожених препаратах мембран з печінки. Дляправильної оцінки розподілу ферменту-маркера досить істотнимє просторове розташова?? ение субстрат-зв'язуючого сайту.

Методики

Субфракціонірованіе мембран і компонентів матриксу мітохондрій.

Мітохондрії виділяють з численних джерел стандартнимиметодами. Субфракціонірованіе їх для отримання внутрішніх і зовнішніхмембран і компонентів матриксу проводять після заморожування - відтаванняпрепарату та/або обробки ультразвуком стандартного осаду мітохондрій,суспендованих в середовищі, що містить 1.2 м сахарози і 2 мМ АТР (10 мгмембранного білка на 1 мл). При цьому відбувається руйнування мітохондрій, апісля центрифугування в ступінчастому градієнті щільність сахарози зовнішнімембрани концентруються в смузі 0,45-1,12 М сахарози, внутрішні мембраниі компоненти матриксу збираються в осаді, під нижнім шаром з концентрацієюсахарози 1,2 М, а проміжна везикулярна фракція - між двомапопередніми, у смузі 1,12-1,20 М.

маркерами внутрішніх мітохондріальних мембран служать ферменти --переносники електронів. Зовнішня мітохондріальна мембрана, що прифрагментації утворює везикули, подібні по щільності і морфології звезикул з плазматичної мембрани містить моноамінооксидази. Описанотакож метод виділення зовнішніх мітохондріальних мембран з печінки щурів.

Метод протівоточного розподілу мітохондрій.

Препарати мітохондрій, виділені з печінки пацюки, були досліджені
Ерікссоном за допомогою методу протівоточного розподілу. Мітохондрій,що входять до складу кожного з цих препаратів, можна розділити на дваосновні популяції. Однак елетронній-мікроскопічне дослідження недозволило виявити ніяких відмінностей в структурі цих часток.

Робоча методика виділення мітохондрій з печінки щурів.

• середу виділення: 0,25 М розчин сахарози, який містить 0,001 М ЕДТА,рН 7,4

• Цукроза - 0,25 М розчин

• НС1 - 1 н і 0,1 н розчини

• КОН - 1 н і 0,1 н розчини

Всі реактиви готуються на бідістіллірованной воді.

ізольовану печінка щура занурюють у 30 мл крижаної середовища виділення.
Після 2х - Зх кратного промивання тканина подрібнюють ножицями на чашці
Петрі, що стоїть на льоду. Кашку знову поміщають у стаканчик зі свіжою середовищемвиділення і ретельно промивають. Після осідання шматочків тканини на дно,рідину обережно зливають і промивання повторюють ще двічі. Тканинапереносять у гомогенізатор, додають 40 мл середовища виділення і подрібнюють вПротягом 30 - 40 секунд. До гомогенату додають 40 мл середовища виділення,перемішують повільно обертається маточкою і розливають його в 2 центріфужнихсклянки. Центріфугіруют протягом 10 хвилин при 0-2 ОС, при 600 д длявидалення уламків клітин та ядерної фракції.

Супернатант обережно зливають і зберігають на льоду, залишки об'єднують ізнову гомогенізують 20 секунд в 20 мл середовища виділення. Гомогенатцентріфугіруют при 600 д 10 хвилин, супернатант об'єднують з отриманимраніше.

Для осадження мітохондрії, об'єднаний супернатант центріфугіруют вдвох склянках при 14000 g протягом 10 хвилин. Залишки об'єднують в одномусклянці і ретельно суспендується за допомогою піпетки на 1 мл в невеликомуобсязі середовища виділення (близько 0,5 мл). . Маленькими порціями, при обережномуструшуванні додають 10 мл середовища виділення і беруть в облогу мітохондрії (14000g, 10 хвилин). Осад суспендується в 0,25 М сахарозі, яка не містить ЕДТА, ізнову центріфугіруют (14000 g, 10 хвилин). Супернатант зливають, наотриманий осад мітохондрії обережно нашаровуються 0,2 - 0,3 мл 0,25 Мсахарози. Легким струшуванням змивають верхній пухкий шар осаду.
Процедуру повторюють ще двічі і отриманий щільний осад мітохондріїретельно суспендується за допомогою піпетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарози.
Густу суспензію мітохондрії переносять у пробірку і зберігають на льоду.

Висновок

У даній роботі запропоновані різні методики виділення мітохондрії зпечінки щурів, але буде використовуватися метод із застосуваннямультрацентріфугірованія, як найбільш прийнятний і задовольняєкритеріям простоти роботи і необхідного ступеня чистоти продукту.

Надалі планується фотометричне вивчення впливу етідіумброміду на активність цитохрому з з мітохондрії печінки щурів. Дана роботастановить практичний інтерес, тому що цитохром з є індукторомапоптозу - програмований загибелі клітин. Механізми цього процесу вданий час становлять великий інтерес (для лікування онкологічнихзахворювань).

Список літератури
1. Альбертсон Пер-Оке "Поділ клітинних частинок та макромолекул", Москва,

1974
2. Боуен Т. "Введення в ультрацентріфугірованіе", Москва, 1973
3. Под ред. Гілярова М.С. "Біологія. Великий енциклопедичний словник",

Москва, 1998
4. Ленінджер А. "Мітохонрія" Москва "Мир", 1966
5. Решетников В.М. та ін "Техніка біохімічного дослідження субклітинних структур та біополімерів" т.2, Мінськ, 1977
6. Еванз У. Г. "Біологічні мембрани. Методи", Москва, 1990