Міністерство освіти Російської Федерації

Уральський Державний Технічний Університет - УПІ

Кафедра Технології органічного синтезу

РЕФЕРАТ:

РОЛЬ ВІРУСІВ І плазмід У ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНІІ

Виконав: студент гр. Х-449

Покровський П.В.

Єкатеринбург

2001

1. Введення

Виникнення злоякісних (ракових) пухлин може мати різніпричини, проте у всіх випадках до цього причетний генетичний матеріалклітини - її ДНК. Що б не призвело до утворення пухлини (раковогопереродження), наступним зростанням тканини управляє ДНК нестримно ділятьсяпухлинних клітин. В основі перетворення нормальної клітини в злоякісну
- Пухлинної трансформації - лежить перенесення або іншу зміну ДНК. Агент,викликає проліферацію клітин, - це продукт гена. До цих пір, правда, невдається створити загальну теорію, яка охоплювала б всі форми раковогопереродження, проте вивчення злоякісних пухлин, викликаних вірусамиі плазмідами, вже зараз дозволяє зробити далекосяжні висновки.

Ми розглянемо три приклади онкогенезу: 1) утворення пухлин урослин, 2) розвиток пухлин у тварин під впливом ДНК-вірусів і 3)розвиток пухлин у тварин під впливом РНК-вірусів (ретровірусів).

2. Освіта пухлин у рослин.

У багатьох рослин зустрічаються пухлини кореневої шийки. Ці розростаннятканини зменшують потік поживних речовин між підземними та надземнимичастинами. У багатьох рослин такі пухлини можна викликати експериментально;типові результати виходять більше ніж у половини вивчених видів (рис.
1). Збудником є Agrobacterium tumefaciens - грам-негативнагрунтова бактерія з перітріхальнимі джгутиками, подібна до представникомроду Rhizobium. Бактерії проникають в тканину через пошкоджені ділянки ірозмножуються в міжклітинниках. Бувають вірулентні і авірулентние штами A.tumefaciens; вірулентні містять велику плазміди, так звану Ti -плазміди (Ti - Tumor Inducing, що індукують пухлина). Після зараження тканиниплазміди проникають у рослинні клітини.

плазмідна ДНК міцно інтегрується в хромосомну ДНК рослиннихкліток і викликає їх пухлинний зростання. Шляхом щеплення таких клітин можнапередати пухлина здоровому рослині; таким чином, після того як клітинизазнали пухлинну трансформацію, бактерія і її плазміда стають вженепотрібними. Інтегрована ДНК плазміди відповідальна також за здатністьклітин виробляти нові ферменти, за допомогою яких синтезуютьсяамінокислоти октопін і нопалін, так звані опинилися. Ці амінокислотиможуть використовуватися бактерією A. tumefaciens як джерело вуглецюта азоту. Завдяки Ti-плазміди Agrobacterium отримує, таким чином,переважний доступ до продуктів фотосинтезу рослини: Ti-плазмідазабезпечує утворення амінокислот, які можуть бути засвоєні тількицієї бактерією.

Поряд з цим Ti-плазміда являє собою природний генний вектордля перенесення чужорідної ДНК в рослини. Гени, що визначають пухлинний ріст,можна виділити з плазміди і замінити іншими генами. З тканин, що складаютьсяз клітин, трансформованих видозміненій плазміди, вдавалосярегенерувати цілі рослини тютюну, які росли абсолютно нормально ідодатково до всього синтезували опинилися. Таким чином, гени чужорідної ДНКпередавалися як домінантні фактори у відповідності зі звичайними законамиспадковості.

Пошуки шляхів введення чужорідних генів у клітини вищих рослинінтенсивно ведуться в усьому світі з початку 70-х років. Одним з імпульсів дорозвитку методів переносу чужорідних генів у рослини стали результатидетального вивчення молекулярно-генетичних основ пухлинного росту урослин за участю бактерій роду Agrobacterium. У результаті цихдосліджень виявилося, що пухлинотворні плазміди агробактерій,що представляють собою міні-кільцеві ДНК, є природною векторноїсистемою, яку зараз використовують для переносу генів в рослини. Плазмідаагробактерії переносить частину своєї ДНК у ДНК рослинної клітини, в ДНКвбудовується "потрібний" ген. За допомогою цього унікального вектора вже отримановелика кількість трансгенних рослин. Важливо також те, що методи генноїінженерії зараз використовують не тільки в практиці, це найважливіша методологіядля пізнання фундаментальних основ організації і функціонуваннярослинного геному.

2.1. ЩО ТАКЕ ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ РОСЛИН

Генетична інженерія - це система експериментальних прийомів,дозволяють конструювати штучні генетичні структури у вигляді такзваних рекомбінантних (гібридних) молекул ДНК. Суть генетичноїінженерії зводиться до переносу в рослини чужорідних генів, які можутьповідомляти рослинам корисні властивості. Такі маніпуляції здійснюються здопомогою відповідних ферментів - рестрикційних ендонуклеаз,розщеплюють молекули ДНК в суворо визначених ділянках, і лігази,зшиваючих фрагменти в єдину рекомбінантних молекул ДНК.

Отже, процедури генетичної інженерії зводяться до того, що з наборуфрагментів ДНК, які містять потрібний ген, збирають гібридну структуру,яку потім вводять в клітину. Введена генетична інформаціяекспресується, що призводить до синтезу нового продукту. Таким чином,вводячи в клітину нову генетичну інформацію у вигляді гібридних молекул ДНК,можна отримати змінений організм.

Рослини мають одну дуже важливу перевагу над тваринами, а самеможлива їх регенерація in vitro з недиференційованих соматичнихтканин з отриманням нормальних, фертильних (здатних зав'язувати насіння)рослин. Ця властивість (тотіпотентность) відкриває для молекулярнихбіологів великі можливості у вивченні функціонування генів, введених врослини, а також використовується в селекції рослин. Для конструюваннярослин необхідно вирішити такі завдання: виділити конкретний ген,розробити методи, що забезпечують включення його у спадковий апаратрослинної клітини, регенерувати з одиничних клітин нормальне рослиназі зміненим генотипом. Таким чином, методологія генетичної інженерії ввідношенні рослин спрямована на докорінну зміну методів традиційноїселекції, з тим щоб бажані ознаки рослин можна було отримувати шляхомпрямого введення в них відповідних генів замість тривалої роботи посхрещування.

Формальною датою народження генетичної інженерії рослин єотримане за допомогою Ti-плазмідної вектора перша у світі химерне рослинасанбін (sunbeen) як результат перенесення гена запасного білка бобових
(фазеоліна) в геном соняшника (sunflower + been). Це було першевідчутним, хоча, можливо, і недосконалим свідченням того, що ввідношенні рослин генетична інженерія зможе виправдати надіїфахівців в галузі молекулярної генетики, біології та селекції.

2.2. Корончата ГАЛЛЕ РОСЛИН

У групі грунтових бактерій, відомих під загальною назвою
Agrobacteria, є кілька видів, які можуть заражати рослини івикликати утворення пухлин, званих корончата галлами, що складаютьсяз недиференційованої пухлинної тканини, що росте в місці зараження.
Клітини корончата галлів у багатьох відношеннях нагадують ракові клітинитварин. Вони набувають здатність до необмеженого, нерегульованимросту. Коли клітини корончата галлів культивують in vitro, вони ростуть привідсутності спеціальних гормонів, які необхідні при культивуваннінормальних рослинних клітин. Більш того, клітини корончата галлівпродовжують зберігати ці властивості (трансформований фенотип), навіть якщовбити бактерії антибіотиками. Вивчення індуктора пухлин Agrobacteriumtumefaciens показало, що власне опухолеродним агентом у цієї бактеріїє Ti-плазміда, яка частково інтегрується в хромосоми рослин.

2.3. Агробактеріальної ТРАНСФОРМАЦІЯ РОСЛИН: Ti-Плазміди

У A. tumefaciens крім хромосоми міститься Ti-плазміда. Плазмідамістить Т-ДНК (transferred DNA), яка складає 12-22 тис. парпідстав і вбудовується в ДНК рослинної хромосоми. Вона кодуєферменти синтезу фітогормонів і Опінія - похідних амінокислот, яківикористовуються бактерією як джерело вуглецю, азоту та енергії.

Крім Т-ДНК в Ti-плазміди містяться vir-область, відповідальна за перенесення
Т-ДНК в рослину, гени утилізації опинилась, а також локуси, контролюючірозмноження плазміди в бактеріальної клітини й її перенесення при бактеріальноїкон'югації. Докази того, що саме Ti-плазміди, а не хромосомнігени бактерій відповідальні за підтримання трансформованого стануклітин корончата галлів, були отримані при вивченні штамів Agrobacterium,містять мутантні Ti-плазміди. Агробактерії, позбавлені Ti-плазмід, неіндукують у зараженому рослині ні освіти корончата галлів, нісинтезу опинилися. Всі отримані мутації Ti-плазміди поділяють на три основнікласу. Мутанти першого класу не індукують синтез опинилась, але викликаютьосвіта корончата галлів. Мутанти другого класу втрачаютьздатність індукувати розвиток пухлин. Мутанти третього класустимулюють аномальну диференціювання нормальних клітин, наприкладнадмірний ріст коренів або пагонів. Ці генетичні дослідження показали,що ДНК Ti-плазмід містить гени, які контролюють розвиток пухлин,синтез опинилися. Оскільки у рослин з мутантними Ti-плазміди другий ітретього класів за допомогою фітогормонів можна стимулюватиопухолеобразованіе, було припущено, що отримані мутації зачіпаютьгормональний метаболізм.

2.4. Які гени локалізована в Т-ДНК

В області Т-ДНК картіровано не менше шести генів, відповідальних заморфологію пухлини і синтез фітогормонів. Ген iaaM 1 кодує ферменттриптофан-2-монооксігеназу, яка переводить триптофан в індолілацетамід.
Ген iaaH 2 кодує гідролази, що перетворює індолілацетамід в гормонрослин ауксини - індол-3-оцтової кислоти (ІУК). Спільна діяльністьпродуктів генів 1 і 2 обумовлює появу в рослинах невластивогоїм шляху утворення природного ауксину, що в цілому призводить до зміникількості ауксину в клітинах рослини. Ізопентенілтрансфераза, які кодуютьсягеном ipt, каталізує ранні стадії біосинтезу природного цитокініни.
Гени iaaM, iaaH і ipt представляють собою онкогени, так як продуктами цихгенів є фітогормони ауксини і цитокініни, які індукують поділклітин. Ген 5 відповідає за синтез індол-3-лактату, який єпродуктом перетворення ауксину. Цей метаболіт виявляє антіауксіновийефект. Ген tml 6 впливає на розмір пухлини; транскрипт 6а необхідний длясекреції нопаліна і октопіна, а ген 6б змінює чутливістьрослинних тканин до цитокініни і зберігає клітини в недиференційованомустані. Отже, чотири або, можливо, п'ять генів пригнічують диференціаціюпухлинних клітин і переводять їх у стан поділу, а ще один генкодує фермент, що каталізує синтез опинилися.

2.5. Молекулярно-генетичних механізмів агробактеріальної трансформації

Процес трансформації можна розділити на чотири етапи: прикріпленнябактерії до стінки рослинної клітини, проникнення Т-ДНК усередину клітинирослини, інтеграція Т-ДНК в геном рослини і експресія Т-ДНК.

Індукція початкових етапів трансформації може відбуватися тільки вмісці ранового пошкодження рослини, де виділяються низькомолекулярніфенольні сполуки (наприклад, ацетосірінгон), вуглеводи (наприклад, глюкозаі глюкуронова кислота) і де утворюється кислий рН. Весь процес вирізуваннята інтеграції Т-ДНК в рослинну хромосому здійснюють продукти генів,локалізованих в vir-області. Сприйняття ранових сигналів здійснюютьбілки VirA і ChvE. ChvE, білок, який кодується хромосомним геном бактерії,відчуває присутність ацетосірінгона і змінює здатність VirA відповідатина фенольні сполуки. VirA є гістідіновой протеїнкінази,здатної до аутофосфорілірованію, він двічі пронизує внутрішню мембранубактеріальної клітини і виступає як донор фосфору білку VirG.
Фосфорілірованний VirG активує транскрипцію інших vir-генів.
Індукція vir-генів оборотна, що дуже важливо для патогена: у випадку, якщогосподар - хворий і нежиттєздатний організм, перенесення Т-ДНК нездійснюється.

Оперон VirD кодує декілька продуктів. Один з них єдвокомпонентною ендонуклеази. Область Т-ДНК оточена однаковимиповторами довжиною 25 пар основ. Ці послідовності є сайтамипізнавання VirD-ендонуклеази, ріжучої точно між 3-м і 4-м підставами 25пар основ повтору. Ця ендонуклеаза відповідальна за вирізування Т-ДНК.
Білки VirB і VirE необхідні для транспорту Т-ДНК з бактерії в рослину.
Перенесення Т-ДНК з бактерії в цитоплазму рослинної клітини здійснюєтьсяза 30 хв.

Впровадження Т-ДНК в рослинний геном є багатоступінчастимпроцесом. Останні результати аналізу нуклеотидних послідовностей вділянках рослинної ДНК, в які інкорпорує Т-ДНК, показали, щоє гомологія між рослинної ДНК по обидва боки від місцявстраивания і зовнішніми областями плазмідної ДНК агробактерій. У геномрослини можуть влаштовуватися кілька копій Т-ДНК. Після вбудовування вхромосому Т-ДНК стає звичайною частиною геному рослини. Т-ДНКтранскрибується в рослинних клітинах РНК-полімеразою II рослини -господаря. Транскрипт мають особливості еукаріотичних матриць. Самабактерія в клітку не проникає, а залишається в міжклітинній просторі івикористовує рослинні клітини з вбудованою Т-ДНК як фабрику,продукує Опінія - джерело азоту та вуглецю.

2.6. ДНК Ti-Плазміди МОЖНА ВИКОРИСТОВУВАТИ ЯК ВЕКТОР

Т-ДНК Ti-плазмід володіє двома властивостями, що роблять її по сутіідеальним вектором для введення чужорідних генів у клітини рослин. По -перше, коло господарів агробактерій дуже широкий: вони трансформують клітинипрактично всіх дводольних рослин. Відомо, що можна домогтисязараження однодольних, у тому числі злаків. По-друге, інтегрована вскладу геному рослини Т-ДНК успадковується як простий домінантний ознака ввідповідно до законів Менделя, а її гени мають власні промотори
(регуляторна область гена, що визначає час і місце його експресії), підконтролем яких можуть експресувати вставлені в Т-ДНК чужоріднігени.

Найпростіший спосіб введення Т-ДНК в клітини рослини полягає в тому, щобзаразити його A. tumefaciens, що містить відповідну Ti-плазміди, інадати подальше природному ходу подій. Необхідно тільки вмітивбудовувати потрібні гени в Т-сегмент ДНК плазміди. Проте розміри цілої Ti -плазміди істотно більше розмірів молекул, звичайно використовуваних в роботіз рекомбінантної ДНК. Щоб подолати ці труднощі, розроблений наступнийпідхід. Перш за все Т-сегмент вирізують з Ti-плазміди за допомогою рестріктазта вмонтовують в один зі стандартних плазмідних векторів для розмноження вклітинах бактерій - Escherichia coli. E. сoli містить плазміди pBR322,яка здатна до самореплікаціі, тобто розмноження, що приводить дозбільшенню числа її копій. Після того як у плазміди pBR322 впровадилиділянка Ti-плазміди, це рекомбінантний структура може потімреплікуватись багато разів, що призводить до збільшення числа копій ділянок
Ti-плазміди. Цей процес називається клонуванням. Бактерії, що містятьплазміди pBR322 з ділянкою Т-ДНК, розмножують, після чого цю плазмідивиділяють. Потім з використанням рестріктаз і стандартних прийомів роботи зрекомбінантної ДНК в Т-сегмент вбудовують певний ген. Цеймолекулярний гібрид, тепер вже містить Т-ДНК з вбудованим в геном неї,знову розмножують в E. сoli, а потім вводять в клітини A. tumefaciens, що несутьвідповідну повну Ti-плазміди. У результаті обміну ідентичнимиділянками (гомологічних рекомбінація) між Т-сегментами нативної ісконструйованої Ti-плазмід Т-ДНК з вбудованим чужорідним геномвключається до Ti-плазміди, заміщаючи нормальну Т-ДНК. Таким чином, миотримуємо клітини A. tumefaciens, що несуть Ti-плазміди з вбудованим в Т -сегмент потрібним геном. Останній етап полягає у зараженні рослин цимимодифікованими генно-інженерними методами агробактерій. Клітиниотриманих трансгенних рослин будуть містити інтегровану Т-ДНК звбудованим чужорідним геном, тобто мета роботи, що складалася у введенніданого гена в геном рослини, буде досягнута. Недавні дослідження,проте, показали, що цю процедуру можна спростити, якщо використовуватибінарні векторні системи, створення яких полягає в тому, щоагробакріальних клітина повинна містити принаймні два різнімодифіковані Ti-плазміди. Одна з них повинна містити тільки vir -область, гени якій будуть брати участь в вирізання Т-ДНК. Такі плазмідиназивають плазмідами-помічницями. Друга Ti-плазміда повинна міститиобласть Т-ДНК з потрібним вбудованим геном. Продукти vir-генів здатнівирізати Т-ДНК як на власній плазміди, так і на сусідній, тобто vir -гени можуть працювати незалежно від їхнього місця розташування. Таким чином,якщо клітини агробактерії містять Ti-плазміди з сегментом vir та іншуплазміди з Т-ДНК, що несе вбудований ген, що ці бактерії можутьтрансформувати клітини рослин.

Загалом ідеальна векторна система на основі Ti-плазміди повинна: 1)містити всі сигнали, необхідні для перенесення і стабільної інтеграції уядерну ДНК рослин; систему для експресії чужорідних генів у рослинах
(впізнаваний рослинними полімераза промотор), маркер, який необхіднийдля селекції трансформованих клітин; 2) не містити онкогенів, тобтогенів, які пригнічують диференціювання рослинних клітин. Другий пунктдосягається за допомогою транспозони мутагенезу (Транспозон --послідовність ДНК, здатна переміщатися по геному). У результатівведення транспозона в Т-ДНК можна виключити гени, які призводять доопухолеобразованію (iaaM, iaaH, ipt), що не позначається на механізміперенесення Т-ДНК. Зазвичай використовують бактеріальні транспозони (Tn5, Tn7). Прицьому знімається блок з процесів регенерації. При модифікації Ti-плазмідинеобхідно передбачити також наявність унікальних сайтів рестрикції, вякі буде клонований чужорідний фрагмент ДНК. Такі унікальні сайтирестрикції створюються включенням в штучні Ti-конструкціїпослідовностей, які містять множинні сайти для розрізаннярестріктаз EcoR1, Hind III, BamH1 та ін У деяких випадках в одномумножині сайті є 18-20 сайтів, впізнаваних різними рестріктазамі,чому ці ділянки і називаються полілінкерамі.

Крім того, при конструюванні векторних молекул має бутипередбачено наявність промоторів, що працюють в рослинах. Промотор
(дільниця, до якого приєднуються РНК-полімерази) повинен володіти наборомвластивостей, а саме: силою (активної експресією), можливістю регуляції,тканини-і органспеціфіческой експресією. Так, наприклад, до регульованимпромотора відноситься промотор генів білків теплового шоку (генів,активність яких активується при підвищеній температурі), атканеспеціфічная експресія характерна для генів, що контролюють синтеззапасних білків, наприклад Зеїн, який виявлений лише в тканинах насіннязлаків. Найбільш популярним є промотор гена вірусу мозаїки кольоровийкапусти (CAMV). Гени, підшиті до такого промотор, активно експресуютьсяу всіх тканинах.

Нарешті, у векторі повинні бути передбачені маркери, за допомогою якихможливий відбір трансгенних рослин. У літературі маркерні гени щеназивають репортернимі. Їх достатньо багато. Наприклад, luxA і luxB - цегени, виділені з ДНК світлячків. Вони контролюють синтез люціферази,яка забезпечує перехід люцефірінов з окисленої форми в основну,що й забезпечує світіння. Останнім часом користується популярністюінший репортерний ген - pgfp, який контролює синтез GFP-білка (greenfluorescent protein). Цей ген був виділений з ДНК медузи Acquorea victoria.
Трансгенні рослини з цим геном світяться в ультрафіолеті зеленим світлом.

Традиційний спосіб трансформації рослинних клітин за допомогою Т-ДНКполягає в нанесенні агробактерій, що містять Ti-плазміди, на спеціальнопошкоджений втечу. Зараз використовують широкий арсенал методів для отриманнятрансгенних рослин. Створено навіть спеціальний прилад - "Shotgun", якийстріляє найдрібнішими вольфрамовим кульками, одягненими в молекули ДНК,здійснюючи таким чином трансформацію рослинних клітин.

2.7. ПРАКТИЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ Генетична інженерія РОСЛИН З

ВИКОРИСТАННЯМ Ti-плазмід

Ще кілька років тому вчені ставили запитання, чи можна створити сорти,збалансовані за складом амінокислот, стійкі до холоду, посухи, невражаються шкідниками. Сьогодні можна з упевненістю стверджувати, що такітрансгенні рослини вже вийшли в поле. За літературними даними, до 1997 рокув 30 країнах світу проведено понад 3 тис. польових випробувань. У цихекспериментах використовували трансгенні рослини 40 різних видів,що відносяться до різних родин, включаючи злаки. Після успішнихекспериментів з'явилися побоювання про можливу шкоду генетичної інженеріїдля природи і людства. Проте вже більш ніж за чверть століття свогоіснування генетична інженерія не принесла шкоди ні природі, нілюдині. Головне, в будь-яких експериментах із генної інженерії сліддотримуватися розроблені правила.

Найбільш гостро стоїть питання про отримання рослин, стійких дошкідників сільського господарства, так як хвороби рослин стали основнимлімітуючим фактором одержання врожаю. В арсеналі генної інженеріїрослин є багато прийомів, що дозволяють отримати трансгенні рослини,стійкі до комах. Традиційно використовують ген bt, продуктом якогоє бактеріальний токсин Bacillus thuringiensis. Ця тюрингськебактерія продукує великий білок (протоксін), контрольований геном bt,який, потрапляючи в кишечник личинок комах, руйнується під дієюферментів, а його фрагмент (ендотоксин) призводить до їх загибелі. На наведенасхема конструювання вектора і одержання трансгенних рослин бавовни,які набувають ознака стійкості до комах. В даний час вжесинтезовано штучний ген bt, конструкція з яким більш ефективна,а самі трансгенні рослини мають широкий спектр стійкості докомах. Трансгенні рослини картоплі, бавовни, кукурудзи з геном bt вжевиробляються фірмами "Monsanto", "Ciba Seeds" і продаються на ринках світу,хоча дискусії про їх використання ще не закінчені.

Відомо, що рослини, так само як і тварини, здатні вироблятиімунітет. Цим чудовим властивістю володіють тільки стійкірослини, у яких при атаці патогенів сильно змінюється метаболізм.
Наприклад, у стійких рослин накопичуються такі хімічні сполуки,як перекис водню (Н2О2), саліцилова кислота (SA), фітоалексинів
(з'єднання, що виконують захисну функцію в рослині). Підвищенийвміст цих сполук сприяє протистояння рослини в боротьбі зпатогенами. Ось один із прикладів, який доводить роль саліцилової кислоти вімунній відповіді рослин. Трансгенні рослини тютюну, які містятьбактеріальний ген, що контролює синтез саліцилат гідролази (цей ферментруйнує SA), були нездатні до імунної відповіді. Тому зміна генно -інженерним шляхом рівня саліцилової кислоти або вироблення в рослинах увідповідь на патоген H2O2 може бути перспективним для створення стійкихтрансгенних рослин.

В останні роки вчені використовують новий підхід для отриманнятрансгенних рослин з "antisense RNA" (перевернутої або антисмислової
РНК), який дозволяє керувати роботою інтересуемого гена. У цьому випадкупри конструюванні вектора копію ДНК (к-ДНК) вбудованого генаперевертають на 180 °. У результаті в трансгенних рослин утворюєтьсянормальна молекула мРНК і перевернута, яка в силу комплементарностінормальної мРНК утворює з нею комплекс і закодований білок несинтезується. Такий підхід використаний для отримання трансгенних рослинтоматів з поліпшеною якістю плодів. Вектор включав к-ДНК гена PG,контролюючого синтез полігалактуронази (polygalacturonase) - ферменту,бере участь у руйнуванні пектину, основного компонента міжклітинноїпростору рослинних тканин. Продукт гена PG синтезується в періоддозрівання плодів томатів, а збільшення його кількості призводить до того, щотомати стають більш м'якими, що значно скорочує термін їхзберігання. Відключення цього гена у трансгенних дозволило отримати рослинитоматів з новими властивостями плодів, які не тільки значно довшезберігалися, але й самі рослини були більш стійкі до грибнихзахворювань. Такий же підхід можна застосувати для регулювання термінівдозрівання томатів, а в якості мішені в цьому випадку використовують ген EFE
(ethylene-forming enzyme), продуктом якого є фермент, що бере участьв біосинтезі етилену. Етилен - це газоподібний гормон, однією з функційякого є контроль за процесом дозрівання плодів.

Таким чином, стратегія антисмислової конструкцій широко застосовується длямодифікації експресії генів. Ця стратегія використовується не тільки дляотримання рослин з новими якостями, але і для фундаментальнихдосліджень у генетиці рослин.

Слід згадати ще про один напрямок в генної інженерії рослин,яке до недавнього часу в основному використовували у фундаментальнихдослідженнях - для вивчення ролі гормонів у розвитку рослин. Сутьекспериментів полягала в одержанні трансгенних рослин з комбінацієюпевних бактеріальних гормональних генів, наприклад тільки iaaM або iptі т.д. Ці експерименти внесли істотний внесок у доказ роліауксинів і цитокінінів в диференціювання рослин.

В останні роки цей підхід стали використовувати в практичнійселекції. Виявилося, що плоди трансгенних рослин з геном iaaM,які знаходяться під промотором гена Def (ген, який експресується тільки вплодах), є партенокарпічний, тобто такими, що сформувалися беззапилення. Партенокарпічні плоди характеризуються або повною відсутністюнасіння, або дуже невеликою їх кількістю, що дозволяє вирішити проблему
"зайвих кісточок", наприклад в кавуні, цитрусових і т.д. Вже отриманотрансгенні рослини кабачків, які в цілому не відрізняються відконтрольних, але практично не містять насіння.

Залишається додати кілька слів ще про один аспект можливостейвикористання Ti-плазміди агробактерії. Обеззброєний, позбавлену онкогенів
Ti-плазміди вчені активно використовують для отримання мутацій. Цей методносить назву Т-ДНК-Інсерційні мутагенезу. Т-ДНК, вбудовуючись в геномрослини, вимикає ген, у який вона вбудувалася, а по втраті функціїможна легко відбирати мутанти. Цей метод чудовий також тим, щодозволяє відразу виявити і клонувати відповідний ген. В данийчас у такий спосіб отримано безліч нових мутацій рослин івідповідні гени клоновані. У нашій лабораторії М.А. Раменське наоснові Т-ДНК мутагенезу отримані рослини томатів з неспецифічноїстійкістю до фітофторозу.

Областей застосування трансгенних рослин так багато, що всі наявнівідомості неможливо викласти в рамках однієї статті. На рівні лабораторнихекспериментів ведуться роботи з отримання рослин, стійких до холоду,важких металів, підвищеного вмісту солей і ін Трансгенні рослини,стійкі до гербіцидів (хімічних сполук, які використовують дляборотьби з бур'янами), до вірусів, рослини з підвищеним вмістом масел інезамінних амінокислот вже вирощують на мільйонах гектарів. Не меншцікавий і інший аспект робіт - отримані трансгенні рослини ззміненими декоративними властивостями. Один із прикладів - це отриманнярослин петунії з різнобарвними квітками. На черзі блакитні троянди з геном,контролюючим синтез блакитного пігменту, клонованою з дельфініум.

Отже, багато надії вже зараз перетворилися на звершення, аагробактерій з її дивовижною Ti-плазміди в руках вчених стала справжнімінструментом як для пізнання функціонування рослинного геному, так ідля вирішення багатьох проблем, які стоять перед сільським господарством. Дожаль, у нашій країні трансгенні рослини ще залишаються на рівнілабораторних експериментів, оскільки дорога від лабораторії до поля, як ібагато років тому, залишається непротоптанной, а в багатьох лабораторіях, у томучислі і в нашій, вже є трансгенні рослини, які чекають свого часу.

2. Онкогенез, що викликається у тварин ДНК-вірусами.

Дослідження канцерогенезу у тварин нерідко проводяться на культурахтканин. Якщо перенести клітини тварин, наприклад з органів курей абохом'ячків, або фібробласти людини у відповідну живильне середовище, то навнутрішньої стінки судини культурального вони почнуть розмножуватися. Зазвичайклітини продовжують рости лише до тих пір, поки не почнуть стикатися міжсобою. Через контактного гальмування утворюється тільки одношаровий клітиннийгазон. Якщо ж ці нормальні клітини інфікувати опухолеродним вірусом, токонтактна гальмування знімається, клітини продовжують розмножуватися і починаютьнасуватися один на одного. Багатошаровий зростання спостерігається тільки у клітин,зазнали пухлинну трансформацію. З клітинної маси легко виділитиокремі клітини і таким шляхом отримати чисті лінії (клони)трансформованих клітин.

Віруси поліоми і SV40 ( "Мавпячий вірус 40") належать до групипаповірусов. Вони містять дволанцюжкові кільцеві молекули ДНК. Уексперименті вірус можна перенести для розмноження в клітини тканинноїкультури. Розмножуючись у деяких (так званих пермісивними) клітинах,вірус викликає їх лізис, і у міру його розмноження клітини гинуть. В інших
(непермессівних) клітинах вірус веде себе інакше. У цьому випадку розмноженнявірусу пригнічується, і приблизно в одній з 105 клітин вірусна ДНКінтегрується в клітинну ДНК. Таке включення вірусної ДНК у геном клітини -господаря може призводити до пухлинної трансформації. У трансформованомуклітині утворюється білок (Т-антиген), який запускається реплікаціюклітинної ДНК, і в результаті починається розмноження клітин. Ін'єкціятакого роду трансформованих клітин живота призводить до швидкогоутворенню пухлин.

онкогенезу, що викликається у тварин РНК-вірусами.

До освіти пухлин у тварин можуть бути причетні також і РНК -віруси - ретровіруси. Вони відносяться до ікосаедріческім вірусів з оболонкою імістять (+) РНК-геном (одноланцюжкові РНК). Як онкогенних вірусіввони, наприклад, викликають саркому Рауса і курей і лейкемію у мишей. Назва
"ретровіруси" пов'язане з тим, що в їхньому розмноженні бере участь зворотнійтранскриптаза. РНК цих вірусів не може відтворюватися шляхом простоїреплікації - необхідна її попередня транскрипція в ДНК з подальшоюінтеграцією цієї ДНК в одну їх хромосом клітини-господаря. Інтеграція --необхідний етап репродукції вірусу; тільки інтегрована вірусна ДНКбуде транслітерація. Так як інтеграція в клітинну ДНК входить дожиттєвий цикл вірусу, частота інтеграції дуже велика. Ймовірно, вірусна
ДНК може включатися в клітинну в будь-якому місці.

Розмноження вірусу не приводить до лізису клітини. Нуклеокапсид утворюєтьсявнтурі клітини, переміщується потім до плазматичної мембрани і виходитьназовні, одягнений в оболонку з цієї мембрани. Інтегрована ДНК ретровірусуреплікується разом з геном клітини-господаря і тому міститься в кожнійклітині пухлини (саркоми). Пухлинний ріст клітин обумовлений експресієювірусного гена "src". Цей ген кодує білок, який мабуть,являє собою кіназу, фосфорилюється білки. Можна думати, що цякіназа бере участь у перетворенні диференційованої клітини в клітинуембріонального типу.

Нещодавно була з'ясована послідовність основ в вірусної РНК.
Виявилося, що вона схожа в послідовністю одного з генів людини.
Звідси можна зробити висновок, що src - це ген тваринного походження, якийв результаті неточною транскрипції був включений в РНК вірусу разом звірусними генами і закріпився в ній. Це міг бути ген, що кодує важливийдля ембріональної клітини фактор росту. Таким чином, пухлини, які викликаютьсяретровірусами, в кінцевому рахунку обумовлені переносом якогось генатваринного походження в клітку тварини.

"Рак викликається вірусами". Це колись божевільна ідея Л. А. Зільберависказанна ще в середині 30-х років. Те, що віруси можуть викликати пухлиниу мишей, у щурів, у курей - доведено. Але при чому тут людина? Загадкапоходження раку хвилювала вчених з тих пір, як медики навчилисярозпізнавати це страшне захворювання. Що викликає злоякіснепереродження клітин, стрімке лавиноподібний їх зростання, коли, вдаючисяв здорові тканини і органи, вони душать, обплутують, вбивають все живе? На початкунашого століття з'ясувалося, що рак може виникнути під впливом різниххімічних речовин, їх стали називати канцерогенами. Ртуть і миш'як, димсигарети і анілінові барвники, кам'яновугільна смола і мінеральні мастила,тіпографская фарба і азбест ... Часом здається, що лише жменьці з насякимось дивом вдається вижити в цьому канцерогенний океані.

Отже, злива, потік, потоп канцерогенів. А може бути, і генетичнийрок: є люди, яким зумовлено захворіти на рак, це закладено в нихспадково, генетично?

Пішов в історію XIX століття з його блискучими відкриттями в мікробіології,закінчився і ХХ, разом з другим тисячоліттям, з лавиною відкриттів у всіхгалузях науки і техніки. Однак віз і нині там. До цих пір про причинирозвитку раку (по науковому - етіології), до цих пір нічого не відомо.
Звичайно, ми знаємо, що може служити фактором ризику, але чому і у когозавтра розвинеться пухлина - ніхто сказати, на жаль, поки не може.
Людина знайшов збудників багатьох страшних хвороб. Ще наприкінці ХІХ століття
Д. И. Ивановский відкрив світ вірусів, а на самому початку XX століття один зперший вірусологів Європи А. Боррель вперше у пресі висловив гіпотезу: ане фільтруються чи віруси викликають злоякісні пухлини?

Незабаром В. Еллерман і О. Бангі повідомляють, що лейкози у курей дійсноможуть мати вірусне походження. І готові експериментально підтвердитице ... Втім, тоді лейкоз не зараховували ще до злоякіснихновоутворень, так що питання начебто зовсім неясний. Незрозумілий длявсіх, крім ... І. І. Мечникова. Ще в 1910 році цей великий провидець наукидрукує в газеті "Українське слово" статтю, в якій пише буквальнонаступне: "Одна причина раку, безумовно, знаходиться в самому організмі, алеінша потрапляє в нього у вигляді екзогенного початку, швидше за все - вірусу ".

Проходить всього лише один рік, та ветеринарний лікар П. Рауспредставляє докази вірусної природи щільною (інакше, солідної)пухлини курей, так званої саркоми Рауса. Це відкриття було зроблено в 1911році, а Нобелівська премія за нього була присуджена Рауса через ... півстоліття.
Щастя, що він встиг дожити до свого тріумфу!

Між відкриттям і його визнанням (і використанням) досить часто лежать
"дистанції величезного розміру". Згадаймо, що закони Г. Менделя булизовсім не оцінені сучасниками і по суті перевідкриття заново через
50 років, коли їх творця вже не було в живих. Вірус поліомієліту відкрив К.
Ландштейнер у Відні в 1909 році, а ефективна вакцина проти цьогострашного захворювання з'явилася на світ тільки в 50-і роки. Вірус грипувперше виділений від людини К. Ендрюсом в 1933 році, ефективних грипознихвакцин немає до цих пір, а вже Нобелівською премією за вирішення проблеми грипу,як то кажуть, і не пахне. Так що Раус - щаслива людина!

Втім, повернемося в початок ХХ століття. Промайнула в ті роки в роботах А.
Борреля, І. І. Мечникова, В. Еллермана, О. Банга, П. Рауса думку про вірусноїприроду раку, думка, значною мірою підказана полюванням за вірусами,погасла на цілу чверть століття.

Справді, були відкриті хвороботворні віруси, які викликають віспу,кір, грип, свинку, жовту лихоманку, але де він, вірус раку людини, іякщо він є, чому його ніхто і ніколи не зміг наздогнати і побачити?

... 14 грудня