Красноярський Державний
Педагогічний Університет

Реферат
Тема: Як гени людини наносять на карту

роботу виконав:студент групи 40факультету інформатики
Шишканов Д.В.перевірив:
Нікольський

Красноярськ 2000р.
Введення

Генетика людини як фундаментальна, так і прикладна наука. Якфундаментальна наука - це область генетики, яка вивчає закониспадковості і мінливості у найцікавіших організмів --людських істот. Наукові результати, отримані при цьому, є цінними длянас не тільки в теоретичному плані. Ось чому генетика - це також іприкладна наука. Важливість її для благополуччя людства дуже велика,успіхи, досягнуті в цій області, приносять вченим більшу радість, ніжнові відомості, отримані у суто теоретичних або чисто прикладнихдослідженнях.

За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я, близько 2,5%новонароджених з'являються на світ з різними вадами розвитку. При цьому
1,5-2% з них зумовлені переважно несприятливими зовнішніми
(екзогенними) факторами, а інші мають переважно генетичнуприроду. Генетичні фактори вад розвитку відображають так званийзагальний генетичний вантаж популяції, що проявляється більш ніж у 5%населення планети. Приблизно 1% генетичного вантажу припадає на геннімутації, 0,5% - на хромосомні мутації, близько 3-3,5% відповідає хворобз вираженим спадковим компонентом (діабет, атеросклероз, ішемічнахвороба серця, деякі пухлини і т.д.). Якщо до цього додати, що близько
40-50% ранньої дитячої смертності та інвалідності з дитинства обумовленіспадковими факторами і приблизно 30% ліжок у дитячих стаціонарах зайнятідітьми із спадковою патологією, стає зрозумілою безумовнанеобхідність правильної та раціонально організованою ранньої діагностикивроджених і спадкових хвороб (пренатальної діагностики). Знання вгалузі генетики дозволили б не тільки встановити діагноз ще до народження,але й запобігти появу на світ дітей з важкими, невиправнийвадами розвитку, з соціально значимими смертельними генними іхромосомними хворобами.

Число генних хвороб, доступних молекулярної діагностики, вжеперевищує 1000 і продовжує швидко зростати. Створені та постійноудосконалюються всі нові ефективні і досить універсальні методи
ДНК-діагностики, такі, як метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), авторякої - американський вчений Кей Мулліс відзначений Нобелівською премією 1994року, метод гібридизації, увічнити ім'я його творця Ед. Саузерн
(1975 рік), і методи ДНК-секвенування (аналіз первинноїпослідовності нуклеотидів у ланцюжку ДНК), розроблені П. Сенджер.

Кілька років тому почалися дослідження за міжнародною програмою
"Геном людини", що об'єднала зусилля вчених багатьох країн. Кінцева мета її
- Створити детальну карту людського геному, тобто повного набору йогогенів. А мета пропонованого реферата набагато більш скромне: пробившиськрізь завісу незрозумілих термінів (в яке ставлення генетика - дисциплінанестравний навіть для самих генетиків), ввести читача в курс одного знайбільших наукових проектів століття.

Географія геному

Досі можливості науки дозволяли складати хіба щогенетичні карти зовсім простеньких організмів, на зразок кишкової палички.
Якщо всю послідовність її генів, що складають єдину замкнутухромосому, роздрукувати на папері у стовпчик дрібним шрифтом, присвоївши кожномугену коротку назву з трьох-чотирьох букв, вийде книжечка сторінок в 300звичайного формату. А якщо так само вчинити з людським геномом - загальнийпраця займають 200 томів по 1000 сторінок кожний.

Нині ця неосяжна "бібліотека", який швидше нагадує звалище книг:більшість листів не заповнено, решта переплутані, і взагалі далеко незавжди ясно, який тому за яким йде. Відомо, що геном людининалічує близько 80000 генів, які перебували у сумі приблизно з 3 млрд. парнуклеотидів (так називається мономер подвійної спіралі ДНК, подібно до того якамінокислота - мономер білкової молекули). Локалізовано ж всього 7000 генів
- Менше 10%. Для деяких районів геному, що становлять особливий інтерес,складені досить детальні карти, для інших - досить приблизніабо зовсім ніяких.

Карти геному, як і географічні, можна будувати в різному масштабі, зрізним рівнем дозволу - останній залежить від точності методуаналізу. Існує два різновиди карт геному - власнегенетичні, одержувані непрямими методами, і фізичні - результатпрямого дослідження молекули ДНК. Максимально можливий ступіньдеталізації - з точністю до пари нуклеотидів (далі П.М.). Іншими словами,сама великомасштабна карта - повна послідовність нуклеотидів ззазначенням, де кінчається один ген і починається наступний. Але це межамрій, і поки до нього далеко. А те, що ми сьогодні маємо, --головним чином дрібномасштабні карти всіх 23 пар людських хромосом звідстанню між окремими маркерами - дрібними "помітними намісцевості об'єктами "- 7-10 млн. П.М.

Почнемо з карт, що складаються за допомогою непрямих методів вивченнягеному.

Карти генетичного зчеплення

Насамперед зазначимо, що людська ДНК складається, строго кажучи, нетільки з генів. Ген, або екзонів, - це експрессіруемий ділянка молекули
ДНК, інакше кажучи, її відрізок, на якому, як на верстаті, "штампуються"молекули того чи іншого білка. Але переважна більшість нуклеотиднихпослідовностей в ДНК - інтрони, не кодують нічого. Не завжди ясно,навіщо вони потрібні й що роблять, але - явно потрібні і роблять, інакше б їх небуло.

Карта генетичного зчеплення складається так. Спочатку потрібно вибратимаркери - будь-які ознаки організму, про яких точно відомо, щовони спадкові, а не "благопріобретенниє". Правда, ознака годиться нароль маркера, лише якщо по ньому є відмінності між індивідами і якщоці відмінності легко виявити. Скажімо, колір очей, або група крові, абосхильність до якоїсь хвороби.

Після того як маркери вибрані, починається аналіз їх успадкування. Угенів є одна цікава властивість - вони можуть рекомбінувати, тобтоперерозподілятися. Або в процесі розвитку сперматозоїдів і яйцеклітинланцюжок ДНК випадковим чином розривається і возз'єднується в різних місцях,або просто дві хромосоми, що становлять пару (гомологічні), обмінюютьсявідповідними ділянками. В обох випадках виходить нове поєднанняознак - ті, що зазвичай успадковуються спільно, розділяються.

Так от, відома закономірність: чим ближче один до одного розташованідва гена на хромосомі, тим важче їм "розпрощатися" при рекомбінації --одна "тягне" за собою інший. На цьому і засноване побудова карт зчеплення.
Чим рідше відбувається рекомбінація між даними двома ознаками-маркерами,тим менше відстань між генами, що їх кодують.

Щоправда, таким шляхом можна з'ясувати лише взаємне розташування
"діючих" геном (екзонів) - вірніше, обчислити відстань між ними нахромосомі за частотою рекомбінації. Встановлено, що якщо остання дорівнює
1%, дистанція між генами складає приблизно 1 млн. П.М., або 1 Мб (однумегабазу - останнє слово і означає "мільйон підстав", тобтонуклеотидів). Одна мегабаза "на місцевості" відповідає 1 см на карті
(однієї сантіморганіде - назва цієї одиниці дали честь великого генетика
Т.Х. Моргана).

Але аналогічним способом можна картіровать і інтрони. Для них маркерамизвичайно служать так звані сайти впізнавання. Справа в тому, що існуютьспеціальні ферменти, призначені для розрізання ДНК, - рестріктази.
Це білкові молекули особливого пристрою. Грубо кажучи, вони просто
"шинкують" ДНК, ріжуть на відрізки, але не абияк, а в певних місцях.
Будь-яка рестріктаза може пізнати лише одну стандартну послідовністьз декількох нуклеотидів. Остання і стає сайтом впізнавання дляферменту. А вже як той "покремсаний" ДНК, залежить від того, як густо вона
"усіяна" сайтами пізнавання. Молекули рестріктази хімічно зв'язуються зними і в цих місцях рвуть ланцюг ДНК.

Є порівняно прості методи вимірювання довжин ділянок, наякі порізала молекулу ДНК рестріктаза. Будь-яка зміна сайту впізнаванняведе до того, що той стає "невидимим" для ферменту. А значить, ДНКрозрізається в інших місцях і утворюються інші по довжині фрагменти.

Чим гарний метод картування з генетичного зчеплення - його можназастосовувати, не маючи ні найменшого уявлення про структуру генів тих чиінших ознак. Достатньо впевненості, що такі гени є, а подальшізаходи спрямовані на те, щоб дізнатися, ДЕ вони, а не ЯКІ вони.

Недоліки методу - досить низька роздільна здатність (7-10 Мб)і висока трудомісткість. Крім того, ген на карті постає не протяжнимвідрізком ДНК (який він "на місцевості"), а точкою на лінії, що зображує їїподвійну ланцюг.

Нарешті, на превеликий жаль, людина - не дрозофіла. Дуже легковважати частоту рекомбінації маркерів, схрещуючи дрібних мушок тисячами ідесятками тисяч. А з Homo sapiens такий спосіб зі зрозумілих причин негодиться, і щодо частоти рекомбінації доводиться судити за статистичнимиданими - скажімо, по захворюваності таким-то спадковим недугою встількох-то сім'ях за стільки-то десятиліть (а то й століть). До речі, самегенетичне картування допомогло знайти точне розташування на хромосомахгенів багатьох важких спадкових хвороб - муковісцидозу, серповидно -клітинної анемії, хореи Гентінгтона, хвороби Тея-Сакса, поликистоза нирок,міотоніческой дистрофії та інших.

Дрібномасштабні фізичні картки

До них відносять хромосомні і карти Комплементарна ДНК ( "до" означає "що кодує ").

Хромосомні картування досить грубо, але має сенс, коли потрібнийген тримають, що називається, в руках: відома його структура, він хімічновиділення, але невідомо, де він "сидить". Тоді хромосоми, витягнуті зядра клітини під час її поділу (коли вони товсті й добре помітні),обробляють особливими барвниками, що додають їм "смугастість": виходятьтак звані бенди - разноокрашенние ділянки хромосом. Бажаємий генрозмножують в пробірці і при цьому мітять його копії, підміняючи, наприклад,водень тритієм. За таким радіоактивним зондом дуже зручно стежити: якщопідмішати його до препарату хромосом і витримати деякий час, вінхімічно зв'яжеться з певним бендом певної хромосоми, встав "насвоє місце "(це називається" гібридизація in situ ", тобто" на місці "). Такбули картіровани гени альбуміну, колагену, гормону росту і деякіінші.

Середній розмір бенду - близько 10 Мб: така і точність хромосомноїкарти. Правда, пізніше удосконалення - гібридизація зфлуоресцентної міткою (FISH - fluorescent in situ hybridization) - підвищилодозвіл до 5-2 Мб. Більше того, розроблено навіть метод гібридизаціїмічених генів з хромосомами, витягнутими з ядра неделящейся клітини - ізначить, де конденсованим, "розхитаною", а не упакованими вкомпактні освіти. У результаті вдалося локалізувати ділянки до 0,1 Мб.

Карти Комплементарна ДНК відображають розташування експресуються нуклеотиднихпослідовностей. По-русски це означає наступне. Припустимо, в клітціактивно працює, виробляючи білок, ген. Що за ген - невідомо. Девін - теж. Тоді користуються тією обставиною, що при синтезі білка вклітинному ядрі спочатку "штампуються" молекули мРНК - точні копіїпрацюючого гена ( "м" - матричні). Цей проміжний продукт можнавиловити з клітки і розмножити в пробірці, помітивши тритієм аборадіоактивним фосфором. А далі все як при хромосомному картуванні: зондприлаштувався до ділянки N - значить, експресія йшла тут і, отже,тут розташований ген, що кодує цей білок.

Великомасштабні карти геному

Їх складають за загальним принципом: спочатку шматують ДНК на шматки,розганяють отримані фрагменти в електричному полі (електрофорез) іпотім гібрідізіруют з міченим зондом. У результаті фрагментиупорядковуються - відтворюється їх вихідна послідовність. Для цьоговикористовують різні методи пошуку перекриваються ділянок.

У будь-якому випадку необхідно перш за все отримати фрагменти ДНКкартіруемого ділянки у великих кількостях. ДНК розмножують зазвичай двомаспособами - клонуванням і ПЛР.

КЛОНУВАННЯ - за сучасними поняттями порівняно примітивний метод.
Послідовність дій така: порізали рестріктазой досліджуваний ділянку
ДНК - вставили кожен її відрізок в молекулу вектора (бактеріальної,дріжджовий або іншої кільцевої ДНК), розрізану в одній точці тієї жрестріктазой: вийшла рекомбінантний кільцева ДНК з "чужий" вставкою.
Таку змішану ДНК "вселяють" в ядро клітини-господаря (зазвичай бактерії), і таприймається ділитися в культурі, завдяки рекомбінантний ДНК - в.о. їїгеному - розмножується практично до будь-якої кількості копій. Результат --набір клонів різних фрагментів картіруемой ДНК, або, як його зазвичайназивають, бібліотека клонів.

полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - лабораторний синтез фрагментів ДНКбез клітини-господаря. У пробірку до фрагмента, який треба розмножити,
"підсаджують": а) фермент ДНК-полімерази, який здійснює відтворення ДНК вживих клітинах; б) будматеріал, тобто окремі нуклеотиди; в) прамери - короткі ланцюжка нуклеотидів, відповідні кінцяхрозмножуємо фрагмента. Тут, як бачите, слабке місце методу: прозгаданий ділянку треба дещо знати наперед - а саме структурупраймерів ...

Потім пробірку нагрівають - фрагмент від спеки "розклеюється",розділяючись на два ланцюги; пробірку охолоджують - праймери приєднуються докінцях фрагменту і полімераза починає свою справу. Чергуючи нагрівання іохолодження, можна за півтори години довести кількість копій потрібного ділянки
ДНК до декількох мільйонів - в чому і полягає головна перевага ПЛРперед клонуванням. Але в неї є два недоліки. Один вже згаданий --потрібно знати праймери "в обличчя", інакше реакцію не вдасться запустити. Другий --технічна неможливість копіювати фрагменти довше 5-6 П.М.

Після того як всі фрагменти ДНК отримані в достатній кількостікопій, їх впорядковують, для чого спершу поділяють електрофорезом, а потімхімічно пов'язують (гибрідизуючою) з міченим зондом, щоб кожен фрагментстав на своє місце і, так би мовити, просигналив про себе: ось він я!

Великомасштабні фізичні карти геному бувають двох типів. Перший -
МАКРОРЕСТРІКЦІОННИЕ (за принципом "зверху вниз"): ДНК ріжуть редкощепящейрестріктазой на великі шматки, впорядковують їх, потім ділять на більшдрібні, які теж впорядковують. Така карта охоплює досить великіділянки геному - до 10 Мб - і не містить пробілів. Але її вирішенняпорівняно невелика - від 1 Мб до 100 кб.

Набагато вище точність у КАРТ КОНТІГ. Їх будують за зворотним принципом -
"знизу вгору". Хромосому шинкують на дуже короткі фрагменти, розмножують їхі впорядковують. Набір впорядкованих коротких фрагментів, що покриваютьпевну ділянку хромосоми, - це і є контіга. А де сама вонарозташована на хромосомі, можна встановити методом FISH.

Правда, карту контіг важко розширити до великих районів хромосоми,оскільки не можна розмножувати великі фрагменти ДНК - ні клонуванням, ні
ПЛР. Хоча в останні роки суттєвий успіх: вдалося створитигігантську молекулу-вектор, у яку можна вбудувати ділянку людської
ДНК розміром до мегабази. Цей вектор називається YAC - the yeast artificialchromosome, штучна дріжджова хромосома. До впровадження YAC яквекторів застосовувалися в основному бактеріальні плазміди - крихітні колечка
ДНК, що несли вставки чужорідного матеріалу максимум в 20-40 кб. Сенсзастосування YAC - значне зменшення числа клонів, які потрібновпорядковувати.

Прогулянка по хромосомі

Всі описані вище методи дозволяють створювати або приблизнікарти обширних регіонів геному, або докладні "топографічні плани"дрібних його ділянок. Як поєднати те і інше - закартировано великийрайон, але детально?

Сучасна стратегія заповнення прогалин - прогулянка по хромосомі. Їїпочинають з якого-небудь короткого ділянки, чия нуклеотиднихпослідовність вже розшифровано. По ній синтезують праймер,гібрідізіруют його з першого попалися клоном з невпорядкованою геномноїбібліотеки, а потім "підключають до справи" полімеразу - вона робить ланцюг,комплементарних даного?? лона. Потім цей ланцюг секвеніруют, а її хвостиквикористовують як праймера для наступного кроку по хромосомі.

От і прозвучало слово "секвенування". Так називається новітній,прославлений, докладний, найточніший ... і, з дозволу сказати,тягомотнейшій метод картування геному. Його сутність - повна розшифровкапослідовності нуклеотидів. Щоб у деталях пояснити, як воназдійснюється, потрібна була б двогодинна лекція з молекулярноїбіології. Тому в двох словах: з бібліотеки клонів витягують фрагмент
ДНК, знову клонують, а що вийшли копії хімічно перетворять в набірвідрізків ДНК, що розрізняються за довжиною лише на один нуклеотид (ось саме цюстадію практично неможливо описати загальнодоступною мовою - настільки вонаскладна навіть для генетика-професіонала). Потім згадані відрізкиподіляються на гелевою платівці в пульсуючому електромагнітному полі
(пульс-форез). Послідовність нуклеотидів читають по фореграмме: коженвідрізок "їде" по гелевою платівці настільки далеко, наскільки велика йогодовжина, і займає місце в одному з чотирьох стовпців - в залежності відтого, на якій нуклеотид (а їх всього чотири типи) він довший сусіднього.

Хоча сучасні удосконалення дозволяють вивчати одночасно до
40 клонів на одному гелі, витрати часу та коштів все одно величезні. Навітьдосвідчена робоча група на кращому обладнанні секвенірует на рік не більше
100000 П.М. на рік. Якщо прийняти вартість аналізу кожної пари основ задолар - весь геном людини може бути секвенувати за 3000 років, іобійдеться його вивчення в 3 мільярди доларів. Сума за теперішніх часівцілком прийнятна хоча б на слух, але от час ... Зараз, правда,розвиваються технології секвенування другого покоління - високовольтнийкапілярний електрофорез, іонізаційні резонансна спектроскопія. Вониприскорюють процес на порядок - отже, вистачить трьох століть (за ті жгроші). Обнадіює, але не занадто.

Як видно, програма "Геном людини" буде успішно виконаналише з технологій третього покоління, нині існуючих в зародковомустані. До них зокрема, відноситься пряме читання послідовностінуклеотидів за допомогою скануючої тунельної або атомної мікроскопії.
Сьогоднішня наука робить ставку саме на такі методи - інакше прогулянкалюдським хромосомам загрожує затягнутися на тисячоліття.

Висновок

І ось на очі мені потрапила журнальний замітка, датована березнем 2000року, про те, що розшифровано послідовність ДНК 22-й людськоїхромосоми. Це перше найбільш повне розшифрування цілої структури вгенетичному апараті людини і - 1/23 частина глобального проекту "Геномлюдини ". Вражають масштаби колективного авторства - 216 вчених з
Великобританії, США, Японії, Канади та Швеції. Тільки ця хромосома міститьбільше 20 генів, зміни в яких приводять до певних захворюваньлюдини, зокрема (приблизно), і один з генів, що обумовлюютьшизофренію. Для повного розкриття геному людини трудитися ще доведетьсядовго. Однак, на думку керівника геномного проекту Френсіса Коллінза,нинішнє досягнення вже можна порівняти з "розщепленням атома або польотом на
Місяць ".
Жуль Верн у своєму романі "20 тисяч льє під водою" передбачав створеннямашини, що дозволяє людині вивчати морські глибини. Тепер батискафа,винайденими Жаком Івом Кусто, користується весь світ, удосконалюючи знання проморській флорі та фауні. У 1990 році Гаррі Гарріссон в романі "Рятувальнашлюпка "описав створення сильних, здорових, але генетично пригніченихрабів. А тепер ...
Може людству варто задуматися над іншими наслідками розшифровкигеному людини, крім викорінення спадкових захворювань. Адже нерівна година, коли вони, ці наслідки самі "звалиться нам на голову".
Згадуючи нацистські чистки, що начитався Ніцше, Гітлера, випробування
Водневої бомби, спроби Генріха Гіммлера створити надлюдини, виникаєцілком резонне питання: А ЩО ДАЛІ?

Список літератури

Журнал "Техніка Молоді". Різні матеріали за 1999-2000 р.;
Матеріали, опубліковані в мережі Інтернет на сайтах www.kulichki.ru,www.lenta.ru, www.nature.com.