"Бог створив людину за Своїм образом і подобою, отже,

Людина повинна жити вічно і нескінченно підвищувати свої знання

... клонування - лише один крок"

Річард Сід
Термін "клон" походить від грецького слова "klon", що означає --гілочка, втеча, держак, і має відношення перш за все до вегетативногорозмноження. Клонування рослин живцями, нирками чи бульбами всільському господарстві, зокрема в садівництві, відомо вже більше 4-х тис.років. При вегетативного розмноження і під час клонування гени не розподіляютьсяпо нащадкам, як у випадку статевого розмноження, а зберігаються у повномускладі протягом багатьох поколінь.
Однак у тварин є перешкода. У міру зростання їх клітин, вони в ходіклітинної спеціалізації - диференціювання - втрачають здатністьреалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі
Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана впочатку 50-х років в дослідах на амфібії. Досліди з ними показали, що серійніпересадки ядер і культивування клітин in vitro в якійсь мірізбільшує цю здатність.
Вже на початку 90-х була вирішена і проблема клонування ембріональних клітинссавців. Реконструйовані яйцеклітини великих домашніх тварин,корів або овець спочатку культивують НЕ in vitro, a in vivo - у перев'язаномуяйцепровід вівці - проміжного (перший) реципієнта. Потім їх звідтивимивають і трансплантують в матку остаточного (друга) реципієнта --корови чи вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до народженнядитинча.
Стаття Уілмут зі співавторами, що з'явилася на початку 1997 року сталасенсаційної саме тому, що вперше клонального тварина (вівця на прізвисько
Доллі) з'явилися в результаті використання донорського ядра клітини молочноїзалози дорослої вівці. У цього першого успішного експерименту єістотний недолік - дуже низький коефіцієнт виходу живих особин
(0,36%). Однак він доводить можливість повноцінного клонування, (абоотримання копії дорослої людини). Залишається лише вирішити технічні таетичні питання.
Найцікавіше, що методологія клонування, використана Уілмутбула підготовлена в СРСР ще в 1987-му році, але в Академії наук на цепрореагували мляво - не до того, мабуть ...
Але повернемося до клонування людини. Існує декілька способів обійтиетичні проблеми - вирашівать окремі органи з клітин рецепіента абовикористовувати тварин. Але це лише "косметичний" метод. Реальний крок добезсмертя - штучне зміна ДНК. У червні 2000 року і сталося те,чого так довго чекали і чого деякі так боялися. З'явилося повідомлення, щовченим з уже відомої своєю вівцею Доллі шотландської фірми PPL
Therapeutics (комерційного відділення Розлін Інституту в Единбурзі) вдалосяотримати успішні клони овечок із зміненою ДНК. Шотландські вчені змоглиздійснити клонування, при якому генетичний матеріал клону був
"підправлений" з кращу сторону. Однак саме цього, генетичноговтручання і бояться багато противники клонування.
Хоча Існує і вже узаконений шлях обходу заборони на клонуваннялюдини, яка називається "терапевтичне" клонування людськихістот. Мова йде про створення ранніх ембріонів - свого роду банкудонорських тканин для конкретних індивідуумів. Саме використовуючи, йогоамериканська компанія Advanced Cell Technology Inc. (ACT, місті Вустер,штат Массачусетс) оголосила в листопаді 2001 року про успішне клонуваннялюдського ембріона.
Цікаво відзначити, що ця компанія в жовтні отримала урядовийгрант 1.8 млн. $ на проведення досліджень в галузі біотехнології.
Порадувала і реакція конкурентів: "Я дуже рада, що ми не самотні. Миотримуємо ембріони, кожен день ", - заявила директор Clonaid Бріджит Боселье
(Brigitte Boisselier).
Для експерименту вчені використовували в цілому 17 жіночихяйцеклітин: видаливши з них ядра, вони впровадили на їх місце ядра,запозичені з клітин шкіри дорослої людини. У трьох яйцеклітинахпочався нормальний процес зростання і ділення. Коли ембріони складалися з 6-тиклітин кожен, вчені перервали їх подальший розвиток з тим, щобвикористовувати отримані клітини для подальших досліджень.
Слід зазначити, що стовбурові клітини, які, власне, і єпредметом інтересу вчених, що займаються дослідженнями в областітерапевтичного клонування, можна виділити тільки з ембріона, у своємурозвитку досягла стадії бластоцисти (близько сотні клітин). Однакфахівці ACT заявляють, що створені ними, в іншому експерименті,мавпячі зародки розвинулися до стадії бластоцисти. З ембріонів буливиділені стовбурові клітини, які в ході їх спеціалізації вдалосяперетворити на нейрони. Повідомляється, що ці нейрони опинилися в станівиробляти допамін і серотонін - два найважливіших гормону, яківиробляються мозком.
В інтерв'ю CNN президент компанії ACT доктор Майкл Вест сказав, що йогокомпанія не зацікавлена в клонування людей, і що вона не створювалаембріон людини для репродуктивних цілей "Ми лише хочемо допомогти хворимлюдям, які потребують допомоги, і в цьому полягає робота всього нашого центру "
Для цього використовуються стовбурові клітини (спрощено - клітини ранніхлюдських зародків.). Потенціал росту стовбурних клітин простофантастичний - досить згадати, що трілліонноклеточний організмновонародженої людини утвориться з однієї єдиної клітини всього лишеза 9 місяців! Але ще більше вражає потенціал диференціювання - один іта ж стовбурова клітина може трансформуватися в будь-яку (!) клітку людини,будь то нейрон головного мозку, клітина печінки або серцевий міоцену.
"Дорослим" клітинам така трансформація не під силу. Одне унікальневластивість цих клітин перетворює їх у воістину безцінний об'єкт длямедицини. "Чужі" стовбурові клітини, введені в організм людини,відторгаються набагато слабше, ніж пересаджені цілі органи, що складаються з вжедиференційованих клітин. Це означає, що в принципі можна вирощувати влабораторних умовах попередники самих різних клітин (серцевих,нервових, печінкових, імунних та ін), і потім трансплантувати їх важкохворим людям замість донорських органів.
Однак раптово виявився імовірний межа клонування - шістьпоколінь. А в січні 2001 року з'явилася інформація про відкриття, якеможе зробити клонування просто не потрібним. Вдалося повернути назадбіологічний годинник всередині людської клітини, змусивши її повернутися достану, в якому вона перебувала на момент утворення в зародку.
Але всі чекають - коли-ж з'явиться перше клоноване чоловік. І якщо Річард
Сід, який оголосив про цієї мети ще в 1998-му році ізчез в тіні. Інший
"найстаріший" гравець - секта "раелітів" - як і раніше активна. Раелітівпереконані в існуванні вісників з космосу, які вказали людствушлях до процвітання - експонентний зростання наукової потужності і все більшактивне втручання у природні процеси. Представники секти і недумають приховувати, що фінансують експерименти з клонування людини. Улютому 2002 го року глава і засновник секти 55-річний канадець Клод
Ворільон, колишній спортивний репортер, нині відомий як Раель, заявив, щодослідження компанії «Клонейд», який припинив свою діяльність зклонування людини через переслідування уряду США, тривають всекретної лабораторії: «Процес протікає успішно, дитина народиться через 12або 24 місяці ». Після цього ще кілька організацій заявило про те, щочекає появи людського клону. І ось, нарешті, на початку 2003-го року
Раелітів заявили про те що перше клоноване людина з'явилася, але, нажаль, поки що ніяких цікавих подробиць невідомо

КЛОНУВАННЯ. Історія та Методологія
Перші досліди на амфібія
Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана впочатку 50-х років в дослідах на амфібії. Американські дослідники Бріггс і
Кінг мікрохірургічних розробили метод пересадки ядер ембріональнихклітин за допомогою тонкої скляної піпетки в позбавлені ядра
(енуклеірованние) яйцеклітини. Вони встановили, що якщо брати ядра з клітинзародка на ранній стадії його розвитку - бластули, то приблизно в 80%випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється нанормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра,просунулася на наступну стадію - гаструла, то лише менш ніж у 20%випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. Ці результатипізніше були підтверджені і в інших роботах.
Великий внесок у цю область вніс англійський біолог Гердон. Він першим вдослідах з південноафриканськими жабами Xenopus laevis (1962) в якості донораядер використав не зародкові клітини, а вже цілком спеціалізувалисяклітини епітелію кишечнику плаваючого пуголовка. Ядра яйцеклітинреципієнтів він не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовимипроменями. У більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися,але приблизно десята частина з них утворювала ембріони. 6,5% з цихембріонів досягали стадії бластули, 2,5% - стадії пуголовка і тільки 1%розвинувся в статевозрілих особин (рис. 1). Однак поява кількохдорослих особин в таких умовах могло бути пов'язано з тим, що серед клітинепітелію кишечника розвивається пуголовка досить тривалий часприсутні первинні статеві клітини, ядра яких могли бути використанідля пересадки. У наступних роботах як сам автор, так і багато іншихдослідники не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.
Пізніше Гердон модифікував експеримент. Оскільки більшістьреконструйованих яйцеклітин (з ядром клітини кишкового епітелію) гинутьдо завершення стадії гаструли, він спробував витягнути з них ядра на стадіїбластули і знову пересадити їх у нові енуклеірованние яйцеклітини (такапроцедура називається "серійної пересадкою" на відміну від "первинноїпересадки "). Число зародків з нормальним розвитком після цьогозбільшувалася, і вони розвивалися до більш пізніх стадій в порівнянні ззародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер.
Потім Гердон разом з Ласки (1970) стали культивувати in vitro (позаорганізму в живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослихтварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер. Приблизно
25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули.
При серійних пересадках вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка.
Таким чином, було показано, що клітини трьох різних тканин дорослогохребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвитокпо крайней мере до стадії пуголовка.
У сною чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантації ядранедслящіхся і полносгью диференційованих клітин крові - еритроцитівжаби Rana pipiens. Після серійної пересадки таких ядер 10%реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка.
Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок (більше 100 клітиннихциклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка НЕрозвивалися.
Таким чином, у багатьох роботах показано, що у разі амфібій донорамиядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку. Деякі авториназивають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча правильнішеназивати їх клонуванням ембріонів амфібій, тому що в цьому випадку мирозмножуємо безстатевим шляхом не дорослих тварин, а зародків.
Диференціація клітин у ході розвитку хребетних супроводжуєтьсяінактивацією непрацюючих генів. Тому клітини втрачають тотіпотентность,диференціювання стає незворотною. Зрештою, в одних клітинвідбувається повне репресування геному, в інших - у тій чи іншій мірідеградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Однак порядз диференційованими Кочетков культивовані in vitro клітинні популяціїмістять малодиференційовані стовбурові клітини, які і можуть бутивикористані як донори ядер для клонування ссавців.
Досліди з амфібіями показали, що ядра різних типів клітин одного і тогож організму генетично ідентичні і в процесі клітинної диференціюванняпоступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованихяйцеклітин, однак серійні пересадки ядер і культивування клітин invitro в якійсь мірі збільшує цю здатність.
Невдачі експериментів з мишами
Успішні досліди з амфібіями змусили учених задуматися про клонуванняембріонів ссавців, зокрема мишей. МакКіннел в одній зі своїхробіт зазначав, що всі необхідні для цього методи вже існують, інезрозуміло, чому миша до цих пір не клонована. На його думку, першимиоб'єктами повинні були стати саме дрібні тварини, такі як миша абокролик. Однак пророкування МакКіннелла не збулося, хоча наприкінці 70-х роківдосліди на мишах дійсно почалися і протікали дуже драматично. До тогочасу, зауважу, дуже грунтовно були вивчені біологія і генетикаранніх етапів розвитку ссавців, і, зокрема, миші як модельногооб'єкта.
Робота методично виявилася досить важким, насамперед тому, щообсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж уамфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані. Експериментаторинавчилися мікрохірургічних видаляти пронуклеус з зигот (заплідненихяйцеклітин) миші і пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів.
Проте всі отримані різними способами зародки мишей розвивалися лише достадії бластоцисти.
Пронуклеус - одне з двох гаплоїдний ядер в яйці ссавців у періодпісля проникнення сперматозоїда, але до злиття чоловічого і жіночогопронуклеус в ядро зиготи в процесі запліднення. Чоловіче ядроформується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче - з хромосомяйцеклітини.
Бластоциста (бластула) - зародок ссавців на одній з ранніх стадійрозвитку, ще до його імплантації в матку.
У 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Ілменсі про те, що вониотримали сім дорослих самок мишей, п'ять з яких мали голькомагерінскій, а два - батьківський геном. Це, нібито, залежало від гого, якийпронуклеус був залишений в яйці - жіночий або чоловічий, він і визначаврозвиток особи але типу гіногенеза або андрогенеза. Їх успіх був пов'язаний, алеопису авторів, з гем, що, видаляючи один нронуклеус, вони подвоювали числохромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощувалиотримані диплоїдні гомочіготние (з двома однаковими наборами генів)зародки in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самки -реципієнта для подальшого розвитку.
Здавалося, тепер можна буде швидко отримувати ссавців зі 100%-ноїгомозиготності за всіма генами. Це особливо важливо в селекції, тому що дляотримання сільськогосподарських тварин, зокрема, великої рогатоїхудоби, із закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібнідесятки років роботи.
Проте, на жаль, дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося, хочабагато хто намагався це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способомдиплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишей гинуть натих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетичного (розвиваються знезаплідненої яйцеклітини) ембріони.
Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх в клітку,
МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високийвихід живих мишей вони отримали, коли як донорів ядер використовувализиготи, але якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйованіяйцеклітини, як і раніше, розвивалися лише до стадії бластоцисти.
Метод МакГрата і Солтер став широко використовуватися різнимиекспериментаторами. Так, Манн і ловель-Бадж виділяли пронуклеус з яєць,активованих до партеногенезу, і пересаджували їх енуклеірованние зиготимишей. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо жнавпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць і пересаджували впартеногенетичного активоване та позбавлені ядра яйця, то такі зародкирозвивалися нормально до народження. Сурані зі співавторами встановили, що якщододати жіночий пронуклеус з зиготи миші до гаплоїдном набору хромосомяйцеклітини, то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічогоядра призводить до нормального розвитку. З іншого боку, рекомбінаціїчоловічого та жіночого пронуклеус з різних запліднених яйцеклітин мишейзабезпечує нормальний розвиток, а комбин?? ия двох чоловічих або двохжіночих пронуклеус зупиняє розвиток ембріона.
Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавців потрібнідва набори хромосом - батьківський і материнський. Тому ні в одного звідомих видів ссавців не описаний партеногенез. Тому роботи Хоппеі Ілменсі не вдалося повторити.
Проте ці дослідники ще двічі розбурхували наукове співтовариство. У 1982році вони пересадили ядра клітин партеногенетичного бластоцист мишей венуклеірованние зиготи Деякі з цих реконструйованих яйцеклітиннормально розвивалися, і нібито були отримані чотири дорослих самки. У світлівищесказаного ці результати досить малоймовірні.
Загибель партеногенетичного (гіногенетіческіх) і андрогенетичним зародківу ссавців пов'язана з різною активністю в онтогенезі материнського ібатькового геномів. Механізм, який регулює ці функціональні відмінності, бувназваний геномних імпрінтінг і вивчався у ряді робіт, де було показано,що для нормального розвитку ссавців потрібна наявність чоловічогогеному. Інша стаття Ілменсі і Хоппе мала ще більший резонанс.
Автори повідомили про пересадку ядер клітин внутрішньої клітинної масибластоцисти в енуклеірованние зиготи мишей та одержання трьох дорослих мишей
(двох самок та самця), генетично ідентичних донорської лінії мишей.
Введення ядер-донорів та видалення пронуклеус з зиготи проводили за одинприйом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro достадії бластоцисти і пересаджували в матку самок. З 16-ти пересадженихбластоцист три розвинулися у дорослих тварин. У наступній роботі (1982)ці ж автори використовували як донорів ядер клітини ембріонів щебільш пізніх стадій (7 діб) і ніби-то отримали трьох статевозрілих мишей.
Однак ніхто з працюючих у тому ж напрямку не зміг домогтися подібнихрезультатів, і достовірність даних Ілменсі і Хоппе була знов поставленапід сумнів.
МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітинвнутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitroреконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, яка передуєстадії бластоцисти. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків даєможливість розвиватися тільки до стадії морули. У той же час 19%реконструйованих яйцеклітин, що містять ядра 2-клітинних зародків,змогли досягти стадії морули або бластоцисти.
Ці та багато інших дані показують, що в ембріогенезі у мишей клітинніядра рано втрачають тотіпотентность, що пов'язано очевидно, з дуже раннійактивацією геному зародка - вже на стадії 2-х клітин. У іншихссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби,активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16 --клітинної стадії. Можливо тому перші значні успіхи вклонування ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а нена мишах. Тим не менш, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю,значно розширили наші уявлення про методологію клонуванняссавців.
Кролики, корови і свині
Американські ісследонателі Стік і роблю, використовуючи методику МакГрата і
Солтер, отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8клеточних ембріоніводнієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи. Фенотипнароджених повністю відповідав фенотипу донора.
Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися внормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, практично нещо дозволяє розраховувати на отримання таким методом клону генетичноідентичних тварин. Цінність цієї роботи тим не менш в тому. що вонапоказала можливість клонування ембріонів кроликів.
Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин, корівабо вівці, він іде дещо по-іншому. Їх спочатку культивують НЕ in vitro, ain vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (першого)реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в маткуостаточного (друга) реципієнта - корови чи вівці відповідно, деїх розвиток відбувається до народження дитинча. Уіладсін запропонував укладатиреконструйовані яйцеклітини в агарових циліндр, який він потімтрансплантували в перев'язаний яйцепровід вівці. За даними одних авторівреконструйовані зародки краще розвиваються в яйцеклітини, ніж укультуральной середовищі, хоча деякі дослідники отримали непоганірезультати і при культивуванні.
Американці Роблю і його працівники, використовуючи ощадливий спосіб витягання ядрабез проколювання мембрани яйцеклітини, запропонований МакГрат і Солтер,пересаджували в зиготи так звані каріопласти - чоловічий і жіночийпронуклеус разом з навколишнім їх цитоплазмою, а також ядра 2 -, 4 - або 8 --клітинних ебріонов корови. Спочатку зиготи центріфугіровалі щоб звільнитипронуклеус від оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра були добревидно під мікроскопом (мал. 2а), що значно полегшувало їх видалення
(рис. 2б). За допомогою маніпулятора і загостреною скляній мікропіпетківитягували один із бластомерів разом з ядром з ранніх зародків (рис. 2в)і переносили його в енуклеірованную зиготу (рис. 2г).
Реконструйовані зародки були укладені в агарових циліндр і пересадженів перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днів культивування їх вимивали,звільняли від агару і досліджували. Реконструктурірованние зародки в ційроботі розвивалися лише в тих випадках, коли в зиготи пересаджувалипронуклеус: 17% таких зародків досягли стадії морули або бластоцисти.
Два зародка були пересаджені другу реципієнту - в матку корови, ірозвиток їх завершилося народженням живих телят. Якщо в якості доноріввикористовували ядра 2 -, 4 - або 8-клітинних зародків, то реконструйованіяйцеклітини не розвивалися навіть до стадії морули.
Пізніше були і більш успішні роботи. Уіладсін, зокрема. повідомив, що йомувдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнской породив результаті пересадки в реціпіентние яйцеклітини ядер бластомерів одного 32 --клітинного зародка. Автор стверджував, що більшість ядер зберігаєтотіпотентность на 32-клітинній стадії, а значна їх частина навіть на 64 --клітинної стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованихяйцеклітин до стадії ранньої бластоцисти в яйцепровід вівці. Після пересадки вматку корів - остаточних реципієнтів, як вважає автор, вони можуть ідалі нормально розвиватися.
Бондіолі і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16-64-клітиннізародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в маткусинхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих теля. Сім зних були генетично ідентичні, являючи собою клон, отриманий урезультаті пересадки ядер клітин одного донорського ембріона.
Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби доситьдовго зберігають тотіпотентность і можуть забезпечити повний розвитокреконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичні труднощіклонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені. Алезалишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіютьтотіпотентностью, для клонування дорослих тварин.
Клонування ембріонів свиней присвячена тільки одна невелика робота.
Мізерність даних, відімо.і пов'язана з певними труднощами роботи зцим об'єктом.
Клонування овець
Уіладсін ще в 1986 році показав, що і в ембріонів овець на 16-клітинноїстадії розвитку ядра зберігають тотіпотентность. Реконструйованіяйцеклітини, які містять ядра бластомерів 16-клітинних зародків, розвивалисянормально до стадії бластоцисти в перев'язаному яйцепровід вівці (в агаровихциліндрі), а після звільнення від агару і пересадки в матку вівці - другареципієнта - ще 60 днів. В іншому випадку донорами служили ядра 8-клітиннихзародків і були отримані 3 живих ягняти, фенотип яких соотнетстіовалпороду овець - донорів.
У 1989 році Сміт і Уілмут трансплантували ядра клітин 16-клітинногоембріона і ранньої бластоцисти в позбавлені ядра незапліднених яйцеклітиниовець. У першому випадку було отримано два живих ягняти, фенотип якихвідповідав породу овець - донорів ядер. У другому випадку один повністюсформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип такожвідповідав породу - донору. Автори вважали, що в ході диференціюванняембріональних клітин відбувається інактивація деяких важливих для розвиткугенів, в результаті якої ядра бластоцисти вже не можутьрепрограмміроваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальнерозвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, уяк донорів ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони абокультивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра яких маютьтотіпотентностью.
Пізніше, у 1993-1995 роках, група дослідників під керівництвом Уілмутотримала клон овець - 5 ідентичних тварин, донорами ядер яких булакультура ембріональних клітин. Клітинну культуру одержували наступнимчином: виділяли мікрохірургічних ембріональний диск з 9-денногоовечого ембріона (бластоцисти) і культивували клітини in vitro протягомбагатьох пасажів (принаймні до 25). Спочатку клітинна культуранагадувала культуру недиференційованих ембріональних стовбурових клітин, аленезабаром, після 2-3-х пасажів, клітини ставали ущільненими іморфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин з 9-денногозародка вівці була позначена як TNT4.
Щоб донорське ядро і реціпіентная цитоплазма знаходилися на східнихстадіях клітинного циклу, зупиняли поділ культивованих клітин TNT4на певній стадії (GO) і ядра цих клітин пересаджували венуклеірованние яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II).
Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували вперев'язані яйцепровід овець. Через 6 днів ембріони вимивали з яйцепроводаперший реципієнта і досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, якідосягли стадії морули або бластоцисти і пересаджували їх в матку вівці --остаточного реципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося
5 ягнят (самок) з них 2 загинули незабаром після народження, 3-й у віці 10днів, а 2 залишилися нормально розвивалися і досягли 8-9-місячноговіку. Фенотипом всі ягнята були схожі з породою овець, від якоїотримували вихідну лінію клітин TNT4. Це підтвердив і генетичний аналіз.
Ця робота, особливо в частині культури ембріональних клітин, - значнедосягнення в клонування ссавців, хоча вона й не викликала такийгаласливого інтересу, як стаття того ж Уілмут зі співавторами, опублікована впочатку 1997 року, де повідомлялося, що в результаті використання донорськогоядра клітини молочної залози вівці було отримано клонального тварина - вівцяна прізвисько Доллі. Остання робота методично багато в чому повторюєпопереднє дослідження 1996 року, але в ній вчені використовували не тількиембріональні, але ще й фібробластоподібних клітини (фібробласти - клітинисполучної тканини) плода і клітини молочної залози дорослої вівці. Клітинимолочної залози отримували від шестирічної вівці породи фін дорcет,що знаходиться на останньому триместрі вагітності. Всі три типи клітиннихкультур мали однакове число хромосом - 54, як зазвичай в овець.
Ембріональні клітини використовували як донорів ядер на 7-9-м пасажахкультивування, фібробластоподібних клітини плоду - на 4-6-м пасажах іклітини молочної залози - на 3-6-м пасажах. Ділення клітин всіх трьох типівзупиняли на стадії GO і ядра клітин пересаджували в енуклеірованниеооцити (яйцеклітини) на стадії метафази II. Більшість реконструйованихембріонів спочатку культивували в перев'язаному яйцепровід вівці, але деякіі in vitro в хімічно певному середовищі. Коефіцієнт виходу морула абобластоцист при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічівище, ніж при культивуванні в яйцепровід. (Тому, мабуть, немає рядканеобхідності в проміжному реципієнті і можна обійтися культивуваннямin vitro. Однак для повної впевненості в цьому потрібні додатковідані.)
Вихід морула або бластоцист в серії дослідів з культурою клітин молочноїзалози був приблизно втричі менше, ніж у двох інших серіях, коли вяк донорів ядер використовували культуру фібробластів плоду абоембріональних клітин. Число живих ягнят у порівнянні з числом пересаджених вматку остаточного реципієнта морула або бластоцист було також у два разинижче. У серії дослідів з клітинами молочної залози з 277 реконструйованихяйцеклітин був отриманий тільки один живий ягня, що говорить про дуженизької результативності такого роду експериментів (0,36%). Аналізгенетичних маркерів всіх семи народилися в трьох серіях експериментівживих дитинчат показав, що клітини молочної залози були донорами ядер дляодного, фібробласти плоду - для двох і ембріональні клітини - чотирьохягнят. Вівця на прізвисько Доллі розвинулася з реконструйованої яйцеклітини,донором ядра якої була культивовані клітини молочної залози вівці породифін дорсет і фенотипно не відрізняється від овець цієї породи, але сильновідрізняється від вівці-реципієнта (рис. 4). Аналіз генетичних маркерівпідтвердив цей результат.
Успіх авторів цієї роботи, насамперед пов'язаний з використанням тривалихклітинних культур, тому що після багатьох пасажів у культурі клітин моглибути відібрані малодиференційовані стовбурові клітини, які, ймовірно, ібули використані як донори ядер. Велике значення мав також той факт,що автори, з огляду на результати своїх попередніх робіт, синхронізувалистадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнтів і клітин донорів.
Коментар 2003-го року: У 2002 році у Доллі було відмічено розвитокартриту, який як передбачається, міг стати результатом генних мутацій,ініційованих процесом клонування. Крім артриту у твариниспостерігався цілий ряд відхилень від нормального розвитку і в лютому вченіприспали знамениту овечку з-за прогресуючої хвороби легенів. Долліпомерла у віці 6 років. Вчені мають намір детально проаналізуватистан організму тварини за результатами розтину
Висновок
Отже, роботи з клонування хребетних було започатковано на амфібія на початку
50-х років і інтенсивно тривають ось уже більше чотирьох десятиліть. Щостосується амфібій, то, як було сказано у відповідному розділі, незважаючина значні досягнення, проблема клонування дорослих особин залишаєтьсядо цих пір не вирішеною. Встановлено, що в ході клітинної диференціювання ухребетних відбувається або втрата певних генних локусів або їхнеоборотна інактивація. Судячи з усього, втрачається та частина генома,яка контролює не ранні, а більш пізні етапи онтогенезу, вЗокрема, метаморфоз амфібій. Механізм цього явища поки що не піддаєтьсянауковому поясненню. Але очевидно, що для клонування дорослих хребетнихнеобхідно використовувати малодиференційовані що діляться клітини. Цеметодично важливе положення було враховано в більш пізніх роботах.
У 1979 році американський біолог МакКіннел, що вніс великий внесок в роботу замфібіями, стверджував, що отримані результати не дозволяють серьерноговорити про можливість клонування людини - тоді це здавалосянедоступним для експериментальних ембріологів. Однак ще в той час багатовчені, письменники і навіть політики стали активно обговорювати возможносттклонування людини, а деякі дослідники навіть приступили до такихекспериментів. Наприклад, Шеттлз повідомив, що пересадив ядросперматогоніальной клітини (диплоїдного попередника зрілого гаплоїдногосперми) в позбавлену ядра яйцеклітини людини. В результаті триреконструйовані яйцеклітини почали дроблення, і виникли схожі наморули скупчення клітин, які пізніше деградували. Шеттлз вважав, щоякщо трансплантувати такі групи клітин у матку жінки, то вони могли бнормально розвиватися. МакКіннел тоді справедливо заперечив, що такеприпущення малоймовірно і абсолютно необгрунтовано.
Ще 5-6 років тому ніхто із учених, а їх працювало досить багато в ційобласті, не ставив питання про використання в якості донорів ядер клітиндорослих ссавців. Роботи зводилися, в основному, до клонуванняембріонів домашніх тварин, і багато хто з цих досліджень були не дужеуспішні. Тому так вразило, що з'явилося на початку 1997 року несподіванедля всіх повідомлення авторського колективу під керівництвом Уілмут, що їмвдалося, використовуючи соматичні клітини дорослих тварин, п?? лучітьклонального тварина - вівцю на прізвисько Доллі. Насправді, однак,дослідники пройшли довгий шлях, і Уілмут з співробітниками довелося зібративоєдино всі існуючі на той час досягнення, перш ніж вони змоглиповідомити про сенсаційне результаті своєї роботи.
У цього першого успішного експерименту є істотний недолік - дуженизький коефіцієнт виходу живих особин (0,36%), і якщо врахувати також високийвідсоток загибелі розвиваються реконструйованих яйцеклітин в плодовий періодрозвитку (62%), який в 10 разів вище, ніж при звичайному схрещуванні (6%), топостає питання про причини загибелі зародків. Чи всі пересаджені донорськіядра мали тотіпотентностью? Зберігався чи повністю їх функціональнийгеном (набір генів, необхідних для розвитку), чи всі потрібні для розвиткугени були дерепрессіровани? Це дуже важливі питання, і по одному твариніне можна зробити остаточні висновки. Тим більше, що результати дослідженьна амфібії говорять про необоротний характер інактивації, репресії генів уході клітинної диференціювання. Можливо, авторам крупно повезло, і вонидосить випадково в трьох різних клітинних популяціях відібрали за короткийтермін стовбурові клітини, для яких характерна низька диференційованість іздатність до поділу. Щоб підтвердити результат цієї, у буквальномусенсі слова с.енсаціонной роботи, необхідні додаткові дослідження.
У найближчі роки головне завдання дослідників, що працюють в даній області
- Це, мабуть, створення культивованих in vitro лініймалодиференційовані стовбурових клітин, що характеризуються високоюшвидкістю поділу. Ядра саме таких кліток повинні забезпечити повне інормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин, формування не тількиморфологічних ознак, але й нормальних функціональних характеристикклонованої організму.
Дослідження Уілмут і співробітників мають не тільки практичне, але йвелике наукове значення для генетики розвитку. По суті, вони знайшлиумови, за яких цитоплазма ооцитів ссавців можерепрограмміровать ядро соматичної клітини, повертаючи їй тотіпотентность.
Після публікації цієї роботи відразу і широко став дискутуватися питання проможливості клонування людини. Щоб його обговорювати, має сенсвиділити два аспекти: методичний та етичний.
З викладеного вище випливає, що методично або технічно клонуваннядорослих ссавців розроблено ще недостатньо, щоб можна було вжезараз ставити питання про клонування людини. Для цього необхіднорозширити коло досліджень, включивши до нього. крім овець. представників іінших видів тварин. Уілмут зі співробітниками, наприклад, плануєпродовжити свої роботи на корів і свиней. Такі роботи необхідні, щобвстановити, чи не обмежується чи можливість клонування дорослихссавців особливостями або специфікою якого-небудь одного абодекількох видів.
Потім необхідно суттєво підвищити вихід життєздатнихреконструйованих ембріонів і дорослих