Введення.

Проблема клонування тварин набула останнім часом нетільки наукове, але і соціальне звучання, тому воно широковисвітлюється в ЗМІ, часто некомпетентними людьми і з нерозуміннямсуті проблеми. У зв'язку з цим виникає необхідність висвітлитистановище.

Термін клон походить від грецького слова «klon», що означаєгілочка, втеча, нащадок. Клонування можна давати багато визначень,Ось деякі найпоширеніші з них, клонування - популяціяклітин або організмів відбулися від загального предка шляхом безстатевого розмноження, причому нащадок при цьому генетично ідентичним своємупредка.
Відтворення організмів повністю повторюють особина, можливотільки в тому випадку, якщо генетична інформація матері буде безбудь-яких змін передана дочкам. Але при природному статевомурозмноженні цьому перешкоджає мейоз. У ході цього незрілаяйцеклітина, що має подвійний, або диплоїдний набір хромосом - носіївспадкової інформації - ділитися двічі, і в результаті утворюються чотири гаплоїдний, з одинарним набором хромосом, клітини. Три з нихдегенерують, а четверта з великим запасом поживних речовин,стає яйцеклітиною. У багатьох тварин вона в силу гаплоїдногоне може розвиватися в новий організм. Для цього необхіднозапліднення. Організм, який розвинувся з заплідненої яйцеклітини,набуває ознак, які визначаються взаємодією материнськоїі батьківської спадковості. Отже, при статевому розмноженнімати не може бути повторена в потомство.
Як же всупереч цій суворої закономірності змусити клітинурозвиватися тільки з материнським диплоїдні набором хромосом?
Теоретично рішення цієї важкої біологічної проблеми знайдено.

Рослини.

Клонування, перш за все, від початку ставиться до вегетативногорозмноження. Клонування рослин живцями, нирками чи бульбамивідомо вже більше 4 тисяч років. Починаючи з 70-х рр.. нашогосторіччя для клонування рослин стали широко використовуватиневеликі групи і навіть соматичні (нестатеві) клітини.
Справа в тому, що в рослин на відміну від тварин у міру їхзростання, в ході клітинної спеціалізації - диференціювання - клітини невтрачають так звані тотіпотентние властивості, тобто, не втрачаютьсвоїй здатності реалізовувати всю генетичну інформацію,закладену в ядрі. Тому практично будь-яка рослинна клітина,зберегло в процесі диференціювання своє ядро, може дати початокновому оргазму. Ця особливість рослинних клітин лежить в основібагатьох методів генетики та селекції.
При вегетативного розмноження і під час клонування гени нерозподіляються по потоках, як у випадку статевого розмноження, азберігаються у повному складі протягом багатьох поколінь .. Всіорганізми, що входять до складу певного клону мають однаковийнабір генів і фенотипно не розрізняються між собою.
Клітини тварин, диференціюючись, позбавляються тотіпотенстності, і в цьому,одна з істотних відмінностей від клітин рослин. Як буде показано нижче саме тут головна перешкода для клонування дорослиххребетних тварин.

Клонування шовкопряда.

У винахід клонування тварин, поза сумнівом, треба віддати належне російським ученим. Сто років тому російський зоолог московськогоуніверситету А.А. Тихомиров вперше відкрив, що яєчка шовковичногошовкопряда в результаті різних хімічних та фізичнихвпливів починають розвиватися без запліднення.
Однак цей розвиток, назване партеногенезом, рано зупинялося:партеногенетичного ембріони загинули ще до вилуплення личинок зяєць. Але це вже була прелюдія до клонування тварин.
БЛ.Л. Астауров в 30-і рр.. в результаті тривалих досліджень,що одержали світову популярність, підібрав термічне вплив,яке, власне, активізувало незаплідненої яйце до розвитку і блокувало стадію мейозу, тобто перетворення диплоїдного ядраяйцеклітини в гаплоїдної. Розвиток з ядром, що залишилися диплоїдні,закінчувалося вилуплення личинок, точно повторюють генотип матері,включаючи і підлогу. Так, в результаті амейотіческого партеногенезу булиотримані перші генетичні копії, ідентичні матері.
Кількість вилупилися партеногенетичного гусениць знаходилося взалежності від життєздатності матері.
Тому в «чистих» порід билупленіе гусениць не перевищувала 1%, в тойчас як у значно більш життєздатних міжрасових гібридіввоно досягло 40-50%. Незважаючи на величезний успіх, автор цього методупережив гірке розчарування: партеногенетичного потомствохарактеризувалося зниженою життєздатністю на ембріональних іпостембріонального стадіях розвитку (гусениці, лялечки, метелики).
Гусениці розвивалися нерівномірно, серед них було багато потворних, азавиті ними кокони розрізнялися за масою. Пізніше Астауров поліпшивметод, застосувавши гібридизацію між селекційними лініями. Так він зміг підвищити життєздатність у нових клонів до норми, але довести доцього рівня інші кількісні ознаки йому не вдалося: наприклад маса партеногенетичного коконів не перевищувала 82% від масинормальних коконів такого самого генотипу.
Пізніше встановили причини партеногенетичного депресії і складнимиметодами, які дозволили накопичувати «гени партеногенезу», вивелинові високо життєздатні клони самок, а пізніше іпартеногенетичного самців. Схрещуючи таких самців зі своїми
«Матерями» або схильними до партеногенезу самками інших клонів,отримали потомство з ще більшою схильністю до партеногенезу. Відкращих в цьому відношенні самок закладали нові клони.
В результаті багаторічного відбору вдалося накопичити в генотипіселекціоніруемих клонів небачено велике число генів, що обумовлюють високу схильність до партеногенезу. Вилуплення гусениць досягло 90%,а їх життєздатність підвищилася до 95-100%, випередивши в цьомувідношенні звичайні породи і гібриди. Надалі «схрестили» здопомогою партеногенетичного самців дві генетично різко відрізняютьсяклону різних рас і від кращих гібридних самок вивелисверхжізнеспособние клони.
Нарешті, навчилися клонувати самців шовковичного шовкопряда. Це сталоможливим після того, як вдалося отримати самців, у яких усепарні гени були ідентичними, або гомозиготними. Спочатку таких самців клонували особливим чоловічим партеногенезом (андрогенезом). Для цьоговпливом гамма-променів і високої температури позбавляли ядро яйцяздатності до запліднення. Ядро що проник в таке яйцесперматозоїда, не зустрівши дієздатного жіночого ядра, само,подвоюючись, приступало до розвитку чоловічого зародка, якийприродно повторював генотип батька. Таким способом ведуться чоловічіклони в десятках поколіннях. Пізніше один з таких клонів бувперетворений в обоеполовую лінію, також складаються з генетичноідентичних (за винятком статевих хромосом) тепер вже самок ісамців. Оскільки що поклав початок цій лінії повністю гомозиготною батько виник в результаті розмноження, прирівняного досамозапліднення, то сам він і лінія двійників обох статей маютьзнижену життєздатність. Схрещуючи між собою дві такі лінії,стали без зусиль отримувати гібридних і високо життєздатнихдвійників в необмеженій кількості.
Підсумки клонування шовкопряда: отримані клони самок і самцівшовковичного шовкопряда для практичного шовківництва непридатні, але цене крах всіх надій. Доцільно використовувати клони не длянепостредственноо застосування в шелководческой практиці, а на плем'ядля видатного за продуктивністю потомства. Орієнтовна схемавикористання клонів в промисловому виробництві виглядає такимчином. З великої кількості коконів вибирають ті, з якихрозвиваються видатні за продуктивністю самки, і від кожної отримують партеногенетичного потомство, для подальшої роботи використовуютьпартеногенетичного клони, які повторюють високу продуктивністьматері і виявляють високу схильність до партеногенезу. За цимслід схрещування з певними клонованими самцями і зотриманого гібридного покоління вибирають два виробництва, тільки ті клони, які дали прекрасне в усіх відношеннях потомство. Йоговисокі якості обумовлені не тільки попередньою селекцією, аще й тим, що в процесі відбору особин на високу схильність допартеногенезу в їх генотипі утворюється комплекс генівжиттєздатності, що компенсує шкідливий вплив штучногорозмноження. При перекладі клонів на статеве розмноження цейкомплекс, опинившись незбалансованим, сильно підвищує гетерозис.

Перші досліди на амфібія

Можливість клонування ембріонів хребетних вперше булапоказана в кінці 40-х початку 50-х рр.. в дослідах на амфібії, коли російський ембріолог Георгій Вікторович Лопашов розробив методпересадки (трансплантації) ядер у яйцеклітину жаби. У червні 1948року він відправив до «Журналу загальної біології» статтю, написану заматеріалами власних експериментів. Однак на біду Лопашова всерпні 1948 року відбулася сумнозвісна сесія ВАСГНІЛ,затвердила з волі комуністичних вождів безмежне пануванняв біології малограмотного агронома Т.Д. Лисенка, і набір статті
Лопашова, прийнятої до друку, був розсипаний, тому що вона доводилапровідну роль ядра і що містяться в ньому хромосом в індивідуальномурозвитку організмів. Роботу Лопашова забули, а в 50-х рр..американські ембріологи Бріггс і Кінг виконали подібні спроби, іпріоритет дісталася їм, як це часто траплялося в історії російської науки.

Бріггс і Кінг мікрохірургічних розробили метод пересадки ядерембріональних клітин за допомогою тонкої скляної піпетки в позбавлені ядра клітини (енуклеірованние клітини).

Вони встановили, що якщо брати ядра з клітин зародка на раннійстадії його розвитку - бластули (бластула - стадія у розвитку зародка,що представляє собою повний куля з одного шару клітин), то приблизно в 80% випадках зародки благополучно розвиваються далі іперетворюються в нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародківпросунулася на наступну стадію - гастулу, то лише менш ніж у 20% випадків оперовані клітини розвивалися нормально. Ці результатипізніше були підтверджені в інших роботах.

Великий внесок у цю область вніс англійський біолог Гердон. Вінперший в дослідах з південноафриканської жабою Xenopus laevis вякості донора ядер використав не зародкові клітини, а вжецілком спеціалізувалися клітини епітелію кишечнику плаваючогопуголовка. Ядра яйцеклітин-реципієнтів він не видаляв хірургічнимшляхом, а руйнував ультрафіолетовими променями. У більшості випадківреконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десятачастина з них утворювала ембріони, 5% з цих ембріонів достігалистадії бластули, 2,5% стадії пуголовка і тільки 1% розвивалося встатевозрілі особи (схема) проте поява кількох дорослихособин в таких умовах могло бути пов'язано з тим, що серед клітин епітелію кишечника розвивається пуголовка досить тривалеприсутні первинні статеві клітини, ядра, яких могли бутивикористані для пересадки. У наступних роботах, як самого автора,так і інших дослідників не змогли підтвердити дані цихперший дослідів.

Пізніше Гердон модифікував експеримент. Оскільки більшістьреконструйованих яйцеклітин з ядром клітини кишкового епітеліюгинуть до завершення стадії гастули, він спробував витягнути з них ядра на стадії бластули і знову пересадити їх в новіенуклеірованние яйцеклітини, така процедура називається «серійноїпересадкою ». Число зародків з нормальним розвитком після цьогозбільшилася, і вони розвивалися до більш пізніх стадій попорівняно з зародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер.
Потім Гердон разом з Ласки (1970 г од) стали культивувати invitro (поза організмом в живильному середовищі) клітини нирки, легені ішкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини якдонорів ядер. Приблизно 25% первинно реконструйованих яйцеклітинрозвивалися до стадії бластули. При серійних пересадках вонирозвивалися до стадії пуголовка. Таким чином, було показано, щоклітини 3-х різних тканин дорослого хребетного містить ядра,які можуть забезпечити розвиток по крайней може до стадіїпуголовка.
У свою чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантації ядра неделящіхся і повністю диференційованих клітин крові --еритроцитів жаби Rana Pipiens. Після серійної пересадки такихядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючогопуголовка. Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок
(більше 100 клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини далістадії пуголовка не розвивалися.
Таким чином, у багатьох роботах показано, що у випадки амфібійдонорами ядер можуть стати лише зародки на ранніх стадіяхрозвитку .. Деякі автори називають подібні експериментиклонуванням амфібій, хоча правильніше їх називати клонуваннямембріонів амфібій, тому що в цьому випадку розмножують безстатевим шляхомне дорослих тварин, а їх зародків.
Диференціація клітин у ході розвитку хребетних супроводжуєтьсяінактивації непрацюючих генів, тому клітини втрачають тотіпотентность,диференціювання стає незворотною. Врешті-решт, в однихклітин відбувається репресування генома, в інших у тій чи іншіймірою деградує ДНК, а в деяких випадках навіть руйнуєтьсяядро. Проте на ряду з диференційовними клітинами, культивуються in vitro клітинні популяції містять малодіфференціруемие стовбуровіклітини, які й можуть бути використані як донори ядер дляклонування ссавців.
Досліди з амфібіями показали, що ядра різних клітин одного ітого ж організму генетично ідентичні і в процесі діфференцірвкі поступово втрачають здатність забезпечувати розвитокреконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадки ядер ікультивування клітин in vitro в якоюсь мірою збільшують цюздатність.

Невдачі експериментів з мишами.

Успішні досліди з амфібіями змусили задуматися вчених проклонування ссавців, зокрема мишей.
МакКіннелл в одній зі своїх роботах зазначав, що необхідні дляцього методи вже існують і незрозуміло чому миша до цих пірНЕ клонована.
Однак пророкування МакКіннелла не справдилися, хоча наприкінці 70-х рр..досліди на мишах дійсно почалися і протікали дужедраматично. На той час досить грунтовно були вивчені біологія і генетика ранніх етапів розвитку ссавців і зокремамиші як модельного об'єкта.
Робота методично виявилася досить важкою, перш за все, томущо обсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше,ніж у амфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані.
Експериментатори навчилися успішно мікрохірургічним шляхом видалятипронуклеус (одне з двох гаплоїдний ядер в яйці ссавців, уперіод після проникнення сперматозоїда, але до злиття жіночої ічоловічого пронуклеус в ядро зиготи в процесі запліднення.
Чоловіче ядро формується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче з хромосом яйцеклітини) з зигот миші та пересаджувати в нихклітинні ядра ранніх ембріонів. Проте всі отримані різнимиспособом зародки мишей розвивалися лише до стадії бластули.
У 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Ілменсе проте, що вони отримали 7 дорослих самок мишей, п'ять з якихмали тільки материнський, а два батьківський геном. Це, нібито, залежаловід того, який пронуклеус був залишений в яйці - жіночий абочоловічий, він і визначав особи за типом гіногенеза або андрогенеза
(гіногенез - розвиток яйця без участі сперматозоїда, андрогенез --розвиток яйця, що мають тільки батьківські хромосоми - чоловічийпартеногенез). Їх успіх був пов'язаний, за описом авторів, з тим, що,видаляючи один пронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого,обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощували отриманідиплоїдні гомозиготні зародки in vitro до стадії бластули іпересаджували в матку самки-реципієнта для подальшого розвитку.
Здавалося, тепер можна буде швидко отримати ссавців зі 100%гомозиготності за всіма ознаками. Це особливо важливо для селекції,так як для отримання сільськогосподарських тварин, зокремавеликої рогатої худоби з закріпленими особливо цінними якостямизвичайними прийомами потрібні десятки років роботи.
Проте дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося, хоча багато хтонамагалися це зробити. Виявилося, що отриманібудь-яким способомдиплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишейгинуть, а тих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетичного
(розвиваються з незаплідненої яйцеклітини) ембріони.
Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх в клітку, МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів іповідомили, що високий вихід живих мишей вони отримали, коли вяк донорів ядер вони використовували зиготи, але якщо донорамибули ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як іперш, розвивалися лише до стадії бластули.
Метод МакГрата - Солтер став широко використовуватися різнимиекспериментаторами. Так Манн і ловель-банжо виділяли пронуклеус яєць,активованих до партеногенезу, і пересаджував їх у енуклеірованниезиготи мишей. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях.
Якщо ж, навпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць іпересаджували в партеногенетичного та позбавлені ядра яйця, то такізародки розвивалися нормально до народження.
Сурані зі співавторами встановили, що якщо додати жіночі пронуклеус з зиготи миші до гаплоїдном набору хромосом яйцеклітини, тонормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічого ядрапризводить до нормального розвитку. З іншого боку, рекомбінаціяжіночого і чоловічого пронуклеус з ранніх заплідненихяйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація 2-хчоловічих або 2-х жіночих пронуклеус зупиняє розвиток ембріона.
Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавцівпотрібно два набору хромосом - батьківський і материнський. Тому нів одного з відомого виду ссавців не описаний партеногенез.
Тому ж роботи Хоппе і Ілменсе не вдалося повторити.
Однак такі дослідження ще двічі розбурхували наукове співтовариство.
У 1982 році пересадили ядра клітин партеногенетичного бластулимишей в енуклеірованние зиготи. Деякі з цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито отримані чотири дорослихсамки, але у світлі вищесказаного ці результати малоймовірні.
Загибель партеногенетичного (гіногенетіческіх і андрогенетичним)зародків у ссавців пов'язана з різною активацією онтогенезуматеринського та батьківських геномів. Механізм, який регулює ціфункціональні відмінності, був названий геномних імпрітінгом і вивчавсяв ряді робіт, де було показано, що для нормального розвиткуссавців потрібна наявність чоловічого геному.
Інша стаття Ілменсе і Хоппе мала ще більший резонанс. Авториповідомили про пересадки ядер внутрішньої клітинної маси бластули венуклеірованние зиготи мишей та отримання трьох дорослих особин (двох самок і одного самця), генетично ідентичною донорської лініїмишей. Введення ядер-донорів та видалення пронуклеус з зиготипроводили за один прийом, потім реконструйовані яйцеклітиникультивували in vitro до стадії бластули і пересаджували в маткусамок. З 16 пересаджених бластули три розвинулися в дорослі особи.
У наступній роботі ці ж автори використовували як донори -ядер клітини ембріонів ще більш пізній стадії (сім діб) інібито отримали трьох статевозрілих мишей. Однак ніхто зпрацюють у тому ж напрямку не зміг домогтися подібнихрезультатів, і достовірність результатів Ілменсе і Хоппе знову булапоставлена під сумнів.
МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітинвнутрішньої клітинної маси бластули не забезпечують розвитку invitro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, якапередує стадії бластули. Найбільша частина (5%) 4-клітиннихзародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. Утой же час 19% реконструйованих яйцеклітин 2-ядерних клітиннихзародків, змогли спокійно досягти стадії морули або бластули.
Ці та інші дані показують, що в ембріогенезі у мишейклітинне ядро рано втрачає тотіпотентность, що пов'язано, очевидно, здуже ранній активізацією геному зародка - вже на стадіях двохклітин. У інших ссавців, зокрема у кроликів, овець івеликої рогатої худоби, активізація першої групи генів уембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16 клітинної стадії. Можливо,тому перші значні успіхи в клонування тварин булидосягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах.

Тим не менше, особливий інтерес викликають досліди групи вчених зуніверситету в Гонолулу на чолі з Ріузо Янагімачі. Авторам вдалося удосконалити метод Уілмут, про який мова піде нижче, вонивідмовилися від електричної стимуляції злиття донорської соматичної клітини з яйцеклітиною і винайшли таку мікропіпетку, за допомогоюякої можна було б безболісно витягати ядро з соматичноїклітини і трансплантувати його в обез'ядренную клітку. Крім того,автори використовували в якості донорських відносно меншдиференційовані ядра клітин, що оточують ооцит. Нарешті, вдалося,як би синхронізувати процеси, що протікають в яйцеклітини ітрансплантуються в ньому ядрі, що дозволило забезпечити природніядерно-цітолазматіческіе взаємини між ядром і цитоплазмою,оскільки трансплантуються диференційоване в певномунапрямку ядро і цитоплазма яйцеклітини до того працювали як бив різних режимах.

Автори використали для трансплантації ядра клітин, що оточують ооцит
(клітин так званого cumulus oophorus), клітин Сертолі знасінників і клітин, виділених з мозку. Ядра, виділені зсоматичних клітин, инъецировали в енуклеірованное яйце з допомогоюмікропіпеткі. Яйце активували до розвитку, помістивши в спеціальнийрозчин (так званий HEPES-CZB), вільний від кальцію, і додаючистронцій і цітохалазін.Стронцій активував яйце, а кальцій придушувавутворення полярних тілець. Ембріонів культивували до стадії 2-8клітин, морули або бластули, а потім трансплантували в маткуназваної матері, де багато хто з них імплантували і деякі з них (15-16%) продовжували свій розвиток. Відсоток виходу народженихмишенят (їх витягали за допомогою кесаревого розтину на 18, 5-19-й днівагітності) був, проте, низький - у різних серіях експериментів від 2 до 2,8%. Молекулярні дослідження довели належність ядернароджених мишенят до клітин донора соматичних клеток.Такім чином,принаймні в деяких випадках доведена здатність ядерсоматичних клітин забезпечувати нормальний розвиток ссавців.
Тим не менш, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю,значно розширили наші уявлення про методологію ссавців.

Кролики та корови.
Американські дослідники Стік і роблю, використовуючи метод Солтер і
МакГрата, отримали шість живих кроликів, пересадивши ядра 8-клітиннихембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншийпороди. Фенотип народилися повністю відповідав фенотипу донора.
Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%)розвинулися в нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід,практично не дозволяє розраховувати на отримання таким способомклону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи, тим неменше, в тому, що вона показала можливість клонування ембріонівкроликів.
Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин,корів або вівці, він іде дещо по-іншому. Їх спочатку культивуютьНЕ in vitro, а in vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці --проміжного (перший) реципієнта. Потім їх звідти вимивають ітрансплантують в матку остаточного (друга) реципієнта - коровиабо вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до розвиненогодитинча. Уіландсін запропонував укласти реконструйовані яйцеклітинив агарових циліндр, який він потім трансплантували в перев'язаний яйцепровід вівці чи корови. За даними одних авторів реконструйованізародки краще розвиваються в яйцепровід, ніж у культивованої середовищі,хоча деякі дослідники отримали непогані результати і прикультивуванні in vitro.
Американці Роблю і його співробітники використовували ощадливий спосібвитягання ядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропоновані
МакГрат і Солтер, пересаджували в зиготи так званікаріопласти - чоловічий і жіночий пронуклеус разом з навколишнім їхцитоплазмою, а також ядра 2 -, 4 - або 8-клітинних ембріонів корови.
Спочатку пронуклеус центріфігуріровалі, щоб звільнити пронуклеусвід оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра було добре виднопід мікроскопом, що значно полегшувало їх видалення. За допомогоюманіпулятора і загостреною скляної піпетки витягували один збластомерів разом з ядром з ранніх зародків і переносили його в енуклеірованную зиготи
Реконструйовані зародки були укладені в агарових циліндр іпересаджені в перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днівкультивування їх вимивали, звільняли від агару і досліджували.
Реконструйовані зародки в цьому випадку розвивалися лише в тихвипадках, де зиготи в зиготи пересаджували пронуклеус: 17% такихзародків досягли стадії морули або бластули. Два зародка булипересаджені другого реципієнту - в матку корови і розвиток їхзавершилося народженням живих телят. Якщо в якості доноріввикористовували ядра 2 -, 4 - і 8-клітинних зародків, тореконструйовані яйцеклітини не розвивалися навіть до стадії морули
Пізніше були і більш успішні роботи. Уіландсін, зокрема, повідомив,що йому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичківхолстейской породи в результаті пересадки в реціпіентние яйцеклітиниядер бластули одного 32-клітинного зародка. Автор стверджував, щобільшість ядер зберігають тотіпотентность на 32-клітинній стадії, азначна їх частина 64-клітинної стадії, забезпечувати нормальнерозвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії морули в яйцепровід.
Після пересадки в матку корів - остаточних реципієнтів. Яквважає автор, вони можуть і далі нормально розвиватися.
Бондіолі і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16-64-клітинні зародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка вматку синхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живихтеля. Сім з них були генетично ідентичні, являючи собоюклон, отриманий в результаті пересадки ядер клітин одногодонорського ембріона.
Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худобидосить довго зберігають тотіпотентность і можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичнітруднощі клонування зародків великої рогатої худоби практичновирішені. Але залишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіють тотіпотентностью, для клонування дорослих тварин.

Клонування овець.

Уіландсін ще в 1986 році показав, що ембріони овець на 16 --клетоной стадії розвитку зберігають свою тотіпотентность.
Реконструйовані яйцеклітини, які містять ядра бластомерів 16-клетонихзародків, розвивалися нормально до стадії бластули в перев'язаномуяйцепровід вівці (в агарових циліндрі), а після звільнення з агару,пересаджували в матку вівці - другий реципієнта - ще на 60 днів. Уіншому випадку донорами служили ядра 8-клетоних зародків і булиотримані три живих ягняти, фенотип яких відповідав породівівці-донора.
У 1989 році Сміт і Уілмут трансплантували ядра клітин 16 --клетосного ембріона і ранньої бластули в позбавлені ядранезаплідненої яйцеклітини овець. У першому випадку було отримано два живих ягняти, фенотип яких відповідав породу овець - донорівядер.Во другому випадку один повністю сформувався ягня загинувпід час пологів. Його фенотип також відповідав породі-донору.
Автори вважали, що в ході диференціювання ембріональних клітинвідбувається інактивація деяких важливих для розвитку генів і врезультаті ядра бластули вже не можуть репрограмміроваться вцитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальний розвитокреконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, якдонорів ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони абокультивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра якихволодіють тотіпотентностью.
Пізніше, в 1993-95 рр.., Група дослідників під керівництвом
Уілмут отримала клон овець - п'ять ідентичних тварин, донорами ядеряких була культура ембріональних клітин. Клітинну культуруодержували наступним чином: виділяли мікрохірургічним шляхомембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластули) ікультивували клітини in vitro протягом багатьох пасажів (попринаймні, до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру диференційованих ембріональних стовбурових клітин, але незабаром, після 2 -
3 пасажів, клітини ставали ущільненими і морфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин з 9-денного зародка вівцібула позначена як TNT4.
Щоб донорське ядро і реціпіентная цитоплазма перебувала насхожих стадіях клітинного циклу, зупиняли поділ культивованих клітин TNT4 на певній стадії (GO) і ядра цих клітинпересаджували в енуклеірованние яйцеклітини (відповідно на стадіїметафази II). Реконструйовані ембріони укладали в агар ітрансплантували в перев'язані яйцепровід овець. Через шість днівембріони вимивали з яйцепровід проміжних реципієнтів ідосліджували під мікроскопом. Відбирали ті, які досягали стадіїморули і бластули і пересаджували їх в матку вівці - остаточногореципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося п'ятьягнят (самок), з них дві загинули незабаром після народження, третій ввіці десяти днів, а два що залишилися нормально розвивалися ідосягли 8-9-місячного віку. Фенотипом всі ягнята були схожі з породою овець, від якої отримували вихідну лінію клітин TNT4.
Це підтвердив і генетичний аналіз.
Ця робота, особливо в частині культури ембріональних клітин, --значне досягнення в клонування ссавців, хоча вона й невикликала особливого інтересу, як стаття того ж Уілмут зі співавторами,опублікована в 1997 році, де повідомлялося, що в результатівикористання донорського ядра клітини молочної залози вівці булоотримано клонального тварина - вівця на прізвисько Доллі. Остання робота методично багато в чому повторювала попередні дослідження 1996 року,але в ній вчені використовували не тільки ембріональні, але ще йфібробластоподібних клітини (фібропласти - клітини сполучної тканини)плода і клітини молочної залози дорослої вівці. Клітини молочної залози отримували від 6-річної вівці породи Фінн Дорсет, що знаходиться наостанньому триместрі вагітності.мали однакове число хромосом - 54, як зазвичай в овець.
Ембріональні клітини використовували як донорів ядер на 7-9пасажах культивування, фібробластоподібних клітини плоду на 4-6пасажах і клітини молочної залози на 3-6 пасажах. Ділення клітинвсіх трьох типів оставлівалі на стадії GO і ядра клітинпересаджували в енуклеірованние ооцити (яйцеклітини) на стадіїметафази II. Більшість реконструйованих ембріонів спочаткукультивували в перев'язаному яйцепровід вівці, але деякі ембріоникультивували in vitro в хімічно певному середовищі. Коефіцієнтвиходу морула і бластули при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічі вище, ніж при культивуванні в яйцепровід
(тому мабуть немає суворої необхідності в проміжному реципієнті і можна обійтися культивуванням in vitro).
Вихід морула і бластули в серії дослідів з культурою клітин молочноїзалози, був приблизно втричі менше, ніж у двох інших серіях, колияк донорів ядер використовували фібропластов плоду абоембріональних клітин. Число живих ягнят у порівнянні з числомпересаджених в матку остаточного реципієнта морула або бластулибуло також у два рази нижче. У серії дослідів з клітинами молочноїзалози і 277 реконструйованих яйцеклітин був отриманий тільки один живий ягня, що говорить про дуже низької результативності такогороду експериментів (0,36%). Аналіз генетичних маркерів всіх семищо народилися в трьох серіях експериментів живих ягнят показав, щоклітини молочної залози були донорами ядер для одного, фібропластиплоду - для двох і ембріональні клітини чотирьох ягнят .. Вівця Доллірозвинулася з реконструйованої яйцеклітини, донором ядра якої була культивовані клітини молочної залози вівці породи Фінн Дорсет.
Доллі фенотипно не відрізняється від овець цієї породи, але сильновідрізняється від вівці-реципієнта породи шотландська черномордая. Аналізгенетичних маркерів підтвердив цей результат.
Успіх авторів цієї роботи, перш за все, пов'язаний з використаннямтривалих клітинних культур, тому що після багатьох пасажей вкультурі клітин могли бути відібрані малодиференційовані стовбуровіклітини, які ймовірно й були використані як донори ядер.
Велике значення мав також той факт, що автори, з огляду нарезультат своїх минулих робіт, синхронізували стадії клітинногоциклу яйцеклітин реципієнта і донора яйцеклітин.
Своєю роботою Уілмут з колегами продемонстрували, що ядра клітин молочної залози дорослої вівці можуть бути за певних умов репрограмміровани цитоплазмою ооцита і дати розвиток новомуорганізму. Отримані дані примусили по-новому подивитися напроцес клітинної диференціювання. Цей процес, як виявилося, неносить безповоротний характер. Абсолютно ясно, що цитоплазматичнічинники здатні ініціювати розвиток нового організму на основігенетичного матеріалу ядра дорослої повністю диференційованоюклітини. Таким чином, біологічні годинники можуть бути поверненіназад, і розвиток організму може початися з генетичногоматеріалу дорослої диференційованої клітини, що повністюсуперечити раннє загальноприйнятої біологічної догмі.
Якщо результати останньої роботи Уілмут і співавторів остаточнопідтвердяться і буде підвищений коефіцієнт виходу живих тварин привикористанні як донорів ядер клітин дорослих тварин, тоце може мати революційне значення як в біотехнології тварин і тваринництві. Клонування дозволить зберегти не тільки генотипцінних і видатних у виробничому ставленні до тварин, а йбезмежно розмножувати їх.

Тканинне клонування.

Вчені хочуть створювати людські ембріони в лабораторіях івикористовувати їх для отримання спеціальних клітин, які можутьзастосовуватися в революційних методики лікування. Правда клонування не дуже підходить для назви цієї операції, тому що викликаєнерозуміння у людей, що ж насправді відбувається? Вчені некопіюють ембріони, вони беруть генетичний матеріал з клітини тіладорослої людини і пересаджують його в яйцеклітину, з якоїзнищений генетичний матеріал.
При дотриманні певних умов ця нова яйцеклітина можерозвиватися в ембріон. Ця та сама технологія, яка булавикористана для створення овечки Доллі.
Чому вчені так цікавляться цією технологією? Це даєможливість отримати так звані стовбурові клітини різнихтканин, абсолютно ідентичних клітин людини, у якої був узятийгенетичний матеріал. Наприклад, вчені можуть отримати нервову тканину,кров, серцевий м'яз і навіть біле і сіра речовина мозку.
Вчені намагалися виділити стовбурові клітини певних тканин наПротягом багатьох років, коли, нарешті, це вдалося в 1998 році.
Вчені стверджують, що стовбурові клітини можуть забезпечити медиківповністю сумісної трансплантаційної тканиною. Спочаткупланується імплантувати клітини в організм для відновленнядефектів тканин, викликаних хворобою, наприклад, відновлення серцевоїм'яза після інфаркту. У майбутньому планується домогтися можливостівирощений