Московський Державний Університет Інженерної Екології
Кафедра «Екологічна та промислова біотехнологія»
«Математичне моделювання біосинтезу продуктів метаболізму»
Реферат на здачу іспиту з кандидатського мінімуму за фахом:
03.00.23 - Біотехнологія.
Аспірант: Осипов Д.С.
Зав. каф.: д.т.н., проф. Бірюков В.В.
Москва - 2002
Введення.
МЕТАБОЛІЗМ - грецьке слово metabole, що означає зміна,перетворення.
У фізіологічному сенсі метаболізм - це проміжний обмін, тобтоперетворення певних речовин усередині клітин з моменту їх надходження доосвіти кінцевих продуктів (напр., метаболізм білків, метаболізмглюкози, метаболізм лікарських препаратів).
З точки зору промислової біотехнології метаболізм - це освітав процесі росту і розвитку клітин цінних біохімічних продуктів --деякі з них виділяються в середу (позаклітинні продукти), деякінакопичуються в біомасі (внутрішньоклітинні продукти). За допомогою метаболізмуотримують антибіотики, молочну та лимонну кислоту, харчові консерванти ібагато інших продуктів.
У природних умовах метаболізм налаштований так, щоб вироблятимінімальна кількість необхідних метаболітів. Промислове виробництво,спрямоване на отримання максимального прибутку, така ситуація ніяк невлаштовує. Тому, для максимізації прибутку необхідно зробитиоптимізацію наступних технологічних параметрів:
- виходу продукту в розрахунку на спожитий субстрат;
- концентрація продукту;
- швидкість утворення продукту.
Оптимізація технології біосинтезу метаболітів складається з наступнихосновних етапів [5]:
1) Первісна селекція штаму мікроорганізмів;
2) Визначення оптимальних значень температури, рН, тонічності іпотреби в кисні;
3) Визначення оптимального режиму харчування та накопичення біомаси;
4) Зміна генетичної структури організму для збільшенняосвіти продукту.
Розробка 3-го етапу, безпосередньо пов'язана з біосинтезу. Длязнаходження режиму харчування та накопичення біомаси, оптимального длябіосинтезу метаболітів необхідно математичний опис процесу
[1,2,3,4]. Крім знаходження оптимальних умов проведення процесу,математична модель використовується для автоматизації біосинтезу, що всучасної біотехнологічної промисловості не менш важливо.
Перш ніж приступити, до опису моделей наведемо прийнятіпозначення основних кількісних характеристик процесу біосинтезу.
Кінетичні характеристики процесу біосинтезу.
Зазвичай стан процесу визначається наступними основнимипараметрами:
- концентрація біомаси мікроорганізмів - Х, г/л;
- концентрація живильного середовища - субстрату (або його основногокомпонента) - S, г/л.
- концентрація продукту - P, г/л.
Кінетичні характеристики процесу відображають швидкість протіканнябіохімічних перетворень. Ці перетворення, природно, відображаються на всіхзазначених вище параметрах процесу - біомасі, продукт і субстраті.
Важливим показником процесу є швидкість росту біомаси. Дляопису швидкості росту використовується така характеристика, як загальнашвидкість росту - QX:
(1).
Більший інтерес для характеристики інтенсивності росту представляє невеличина QX, а питома швидкість росту в перерахунку на одиницю біомаси
(адже зростання біомаси пропорційний концентрації клітин). Вона позначаєтьсябуквою (:
(2).
Розмірність величини (- [1/ч].
Розглянемо тепер другий параметр процесу ферментації - концентраціюсубстрату S. За аналогією зі зростанням біомаси, можна ввести кінетичнухарактеристику - швидкість споживання субстрату QS:
(3).
Знак '-' означає, що швидкість споживання позитивна, коликонцентрація субстрату в середовищі падає (тобто швидкість зміниконцентрації негативна).
Аналогічно, питома швидкість споживання субстрату, яку позначимомалою літерою qS, дорівнює:
(4).
При біосинтезі метаболітів, поряд зі зростанням біомаси, відбуваєтьсянакопичення в середовищі продукту метаболізму (його поточна концентрація - Р).
Загальна швидкість біосинтезу продукту метаболізму QР в періодичномупроцесі дорівнює:
(5).
Питома швидкість біосинтезу продукту одиницею біомаси позначаєтьсяqР і дорівнює:
(6).
Для математичного опису біосинтезу продуктів метаболізмурізними дослідниками було запропоновано багато різних моделей. Всі цімоделі можна розділити на наступні групи:
1) Математичні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму якфункція від питомої швидкості росту;
2) Субстрат-залежні моделі кінетики біосинтезу продуктівметаболізму;
3) Моделі, засновані на концепції віку культуримікроорганізмів.
Під час біосинтезу відбувається також процес зменшення кількостіметаболітів, для опису цього феномена були запропоновані моделі деградації
(інактивації) продуктів метаболізму.
Математичні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму як функції від питомої швидкості росту.
Математичний параметр - питома швидкість росту (- послужив основоюскладання багатьох математичних моделей біосинтезу продуктів метаболізму.
Процеси біосинтезу продуктів здавна ділять на два великих класи --пов'язані зі зростанням і не пов'язані зі зростанням. Як приклад першийкласу можна назвати біосинтез конститутивних ферментів клітини, а другийкласу - біосинтез багатьох антибіотиків, інтенсивний синтез якихвідбувається після припинення росту мікроорганізмів.
Питома швидкість біосинтезу пов'язаних із зростанням продуктів може бутивиражена простим співвідношенням [5]:
(7), де YP/X - вихід одиниці продукту з одиниці біомаси: (dP/dX).
Більш складне вираз було запропоновано Людекінгом і Пайрі [6]:
(8), де qP0 - емпірична константа.
У цьому випадку біосинтез продукту, з одного боку, асоційований ззростанням, а, з іншого, здійснюється спочиваючої клітиною [7]. Модель (8)вперше була запропонована для опису синтезу молочної кислоти.
Є ряд рівнянь, що враховують нелінійний характер зв'язку qP іпитомої швидкості росту:
(9),
(10), де а і в - емпіричні константи.
Рис. 1. Форма залежності qР (() для рівнянь (9) та (10).
На рис. 1 показані графіки функцій (9) та (10), ці рівняння даютьопуклу (9) та увігнуту (10) криві, що виходять з нуля, але ці функціїможуть мати також додатковий вільний член qP0:
(11),
(12).
Тоді графіки функцій (11) та (12) на відміну від (9) та (10) виходять нез нуля, а з деякої точки qP0 на осі y, що продемонстровано на рис.
2.
Рис. 2. Форма залежності qР (() для рівнянь (11) та (12).
Можливі також емпіричні рівняння типу [8,9]:
(13), < p> (14). де а, b, с - емпіричні константи.
Рис. 2. Форма залежності qР (() для рівнянь (13) і (14).
За аналогією з рівняннями (11) та (12) рівняння (14) починається, не з
0 по осі ординат, а з деякої точки a, що означає початок синтезупродукту без зростання біомаси.
Субстрат-залежні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму.
З точки зору математики, рівняння, в яких як аргументвиступає (, припускають, що зовсім неважливо, яким чином формується теабо інше значення (. Наприклад, величину (можна змінювати шляхом зменшенняконцентрації вуглецевого субстрату або азотного субстрату, або шляхомзниження температури або підвищення величини рН. Для процесів, пов'язанихтільки з ростом, можливо швидкість біосинтезу при цьому буде однакова. Длянезв'язаних зі зростанням процесів небайдуже, яким шляхом ми будемо змінювативеличину (. Лімітування вуглецем, лімітування азотом, підвищення рНабо зниження температури, даючи одне і те ж значення швидкості росту, можутьдавати зовсім різні швидкості біосинтезу продукту метаболізму.
Іншими словами, зв'язок між qP і (не має строго причинно-наслідковогохарактеру, а обумовлена впливом на обидві ці кінетичні характеристикиодних і тих же факторів зовнішнього середовища. Для таких процесів необхідновикористовувати рівняння, які в якості аргументів містять незалежнощо впливають первинні фактори: концентрація того чи іншого субстрату,температура чи величина рН.
Біосинтез продукту може описуватися однофакторний абобагатофакторним рівняннями. Крім того, було встановлено, що структуризалежностей qP від S, P, температури і величини рН аналогічні структурамтаких же рівнянь для зростання біомаси, наприклад: Моно, Андрюса, Перта,
Хіншельвуда і т.д. Наприклад, якщо субстрат впливає на qP по Андрюса, томаємо [10]:
(15), де qm - максимальна питома швидкість біосинтезу продукту;
K'S - константа насичення;
Ki - константа інгібування продуктом.
Багатофакторні залежності тут найчастіше бувають мультиплікативний, ніжадитивними. Наведемо залежність мультиплікативного [11] і аддитивноговпливу концентрації субстрату за механізмом Моно:
(16),
(17).
Застосовуються також рівняння з не розділяються ефектами факторів,наприклад, типу Контуа [10] або неконкурентного гальмування продуктом [5]:
(18),
(19).
На жаль, неможливо викласти всі кінетичні залежностібіосинтезу продуктів від первинних чинників в настільки короткій роботі. Данийматеріал докладно викладено в монографії [14], в якій наведені не тількикілька десятків рівнянь, але і проведений їх аналіз.
Моделі, засновані на концепції віку культури мікроорганізмів.
Для біосинтезу продуктів метаболізму часто буває недостатньо тількисприятливих "зовнішніх" факторів середовища. Тому що в біосинтезі беруть участьвнутрішньоклітинні ферменти мікроорганізмів, проміжні продукти,зміст яких у клітці залежить від передісторії розвитку культури.
Занадто швидко виросла культура часто неефективна з точки зорубіосинтезу продукту. У мікробіологів є вираз "культура пішла вбадилля ", що означає біомаси - багато, продукту - мало або взагалі немає.
Однак, враховувати ці внутрішньоклітинні компоненти при моделюванні дужепроблемно - їх важко вимірювати і відповідно знаходити кінетичнікоефіцієнти.
Замість цього запропоновані деякі феноменологічні підходи до оцінкифізіологічного стану мікробної біомаси, засновані на оцінцівікового стану популяції клітин.
Є кілька підходів для обліку віку культури. Один з нихполягає у визначенні розподілу клітин мікроорганізмів по віку
[12]. Тоді значення питомої швидкості біосинтезу продукту можна вважатияк би сумою швидкостей, що даються різними віковими фракціями біомаси:
(20), де? Xi - концентрація біомаси i-ої вікової групи; qi - питома швидкість біосинтезу біомасою i-ої віковоїгрупи.
При цьому, цілком можливо, що значення q1, q2, ... , qn не будутьоднаковими: "молодь" не синтезує потрібний продукт, дуже старіклітини - теж.
Японським вченим Аібой був запропонований більш простий підхід, використовуватидля оцінки віку культури так званий середній вік популяціїяк параметр, що визначає Біосинтетичними активність культури [13].
Біологічно термін цілком зрозумілий - це сума віку всіх клітин,поділена на їх кількість:
(21), де? i - вік i-ої вікової групи.
Якщо послідовно зменшувати Піддіапазони? t і? X, довівши їх донескінченно малих dX і dt, то для середнього віку можна отриматиінтегральну формулу:
(22), де Х0 - початкова концентрація біомаси;
- середній вік культури в початковий моменткультивування.
Іншим способом спрощення вікової залежності є поділвікового діапазону клітин на 2 класу - продуктивний (вище деякогозначення) і не продуктивний [14]:
(24), де? * - вік зрілості; qP * - питома швидкість біосинтезу клітини, після досягнення неювіку зрілості.
Тепер залишається розглянути форму залежності питомої швидкостібіосинтезу продукту qР від середнього віку культури:.
Якщо залежність має зростаючий характер з насиченням, тозалежність зручно виразити у формі, схожій на рівняння Моно:
(25).
Якщо, навпаки, вона падає з віком, то краще підходить вислів,подібне рівняння Єрусалимського:
(26).
Якщо залежність має екстремум, то воно може бути виражена,наприклад, за допомогою апроксимує поліноміальною рівняння [15]:
(27).
Однозначна залежність між qР і на практиці зустрічаєтьсярідко, часто залежність швидкості біосинтезу продукту від віку враховуютьу вигляді мультиплікативного співмножники, сполученого з основною частиноюрівняння, що враховує впливу інших факторів.
Моделі деградації (інактивації) продуктів метаболізму.
Не завжди синтезовані продукти метаболізму залишаються стійкими;часто вони настільки нестабільні, що руйнуються вже в процесі самоїферментації. Тому, описуючи матеріал баланс по продукту метаболізму,необхідно враховувати кінетику його інактивації:
(28), де - швидкість деградації продукту метаболізму.
При розгляді синтезу метаболітів, використовувалася питомашвидкість, у разі деградації, вводити питому швидкість не коректно, тому щопродукт існує окремо від біомаси, і його деградація не залежить взагальному випадку від її концентрації.
Розглянемо моделі кінетики деградації:
(29), деградація відсутня.
(30), деградація йде з постійною швидкістю. Таке вираження дивновиглядає на початку процесу, коли продукту ще немає; з рівняння жвиходить, що концентрація продукту знижується нижче нуля, що не маєфізичного змісту.
(31), реакція розкладу першого порядку, пропорційно кількостіутвореного продукту [16].
(32), реакція розкладу n-ого порядку, при чому n може бути як більше 1,так і менше і не бути цілим числом.
(33), реакція розкладу залежить не тільки від концентрації продукту, а й відконцентрації біомаси.
(34), швидкість реакції розкладу залежить від концентрації біомаси тазростає з концентрацією продукту до якоїсь межі.
Наведені рівняння інактивації (29) - (34) найбільш поширені,існують також і інші більш складні залежності.
Модель накопичення продукту метаболізму на прикладі лейцину.
L-лейцин-незамінна амінокислота, необхідна для промисловогоотримання лізину. Виробництво лізину базується на лейцінозавісімихштамах. Річне виробництво лізину складає приблизно 500000 т/м.
Лізин широко використовується в с/х в якості кормової добавки. Лейцин такожзастосовується в спортивному харчуванні, тому що є попередникомнезамінних жирних кислот, що входять до складу клітинних мембран.
Елементна формула L-лейцину (L-(-аміноізокапроновая кислота):
C5H10NH2COOH.
Основним способом виробництва L-лейцину є мікробіологічнийсинтез з використанням штаму Corynebacterium glutamicum. Біосинтезпроводився у лабораторному біореактори. У відбираються пробах визначаласяоптична щільність - Х, зміст лейцину - P і зміст редукуючихречовин (РВ) з Бертрану - S.
Отримані результати наводяться в таблиці 1.
Таблиця 1.
Найпростішим припущенням про механізм мікробіологічногоБіосинтетичними процесу є узагальнення даних про те, що біосинтез,з одного боку, асоційований з зростанням, а з іншого, здійснюєтьсяспочиваючої клітиною.
Тому було вирішено використовувати наступне співвідношення (8):
(35), де P - концентрація продукту (лейцину), г/л; aP, bP - емпіричні константи . aP, bP були визначені методом найменших квадратів: aP = 13.27,bP = 1.249, сума квадратів відхилень QP склала 0,884, а середняквадратична помилка SP дорівнює ± 0.6648.
На рис. 3 показані експериментальні значення концентрації лейцину імодельні, з малюнка видно, що модель (8) в даному випадку достатньодобре описує біосинтез продуктів метаболізму.
Рис. 2. Графічна інтерпретація моделі біосинтезу лейцину (35).
Список літератури.
1. Арзамасцев А.А., Андрєєв А.А Математичні моделі кінетикимікробного синтезу: можливості використання і нові підходи до розробки
//Вестн. Тамба. ун-та. Серія: Єства. і техн. науки .- 2000 .- т.V., № 1 - с.
111-130.
2. Renss M. Моделювання та оптимізація процесів// 8th Int.
Biotechnol. Symp., Paris-1988 .- vol. 1 .- p. 523-536.
3. Zeng An-Ping Кінетична модель одержання продуктів мікробнихклітин і клітин ссавців// Biotechnol. and Bioeng .- 1994 .- vol. 45.,
N 4 .- p. 314-324.
4. Vanrolleghem P.A. Структурний підхід для вибору серед кандидатів умодель схеми метаболізму та встановлення невідомих стехіометричнихкоефіцієнтів// Biotechnol. and Bioeng .- 1998 .- vol. 2., N 3 .- p. 133-138.
5. Перт С.Дж. Основи культивування мікроорганізмів і клітин .- М.:
Світ .- 1978.
6. Luedeking R., Piret E.L. A kinetic study of the lactic acidfermentation: Batch process at controlled pH// J. Biochem. Microbiol.
Technol. Eng .- 1959 .- vol. 1., N 4 .- p. 393-412.
7. Осипов Д.С., Гусельникова Т.В. та ін Математична модельбіосинтезу L-лейцину// Праці МГУІЕ .- 2001 .- т.V. - с. 19-23.
8. Mori A., Terui G. Kinetic studies on submerged acetic acidfermentation: Inhibition by ethanol// J. Ferment. Technol .- 1972 .- vol.
50, N 11 .- p. 776-786.
9. Музиченко Л.А., Валуєв В.І. Використання полунепреривногокультивування мікроорганізмів для одержання продуктів біосинтезу// Вкн.: Теорія і практика безперервного культивування мікроорганізмів .-
Красноярськ .- 1978 .- с. 112-113.
10. Bajpai R.K., Reuss M. A mechanistic model for penicillinproduction// J. Chem. Technol. and Biotechnol .- 1980 .- vol. 30, - p. 332 -
344.
11. Баснакьян І.А., Бірюков В.В., Крилов Ю.М. Математичний описосновних кінетичних закономірностей процесу культивуваннямікроорганізмів// В кн.: Підсумки науки і техніки. Мікробіологія. Т. 5.
Кероване і безперервне культивування мікроорганізмів .- М. - 1976 .- с.
5-75.
12. Shu P. Mathematical model for product accumulation inmicrobiological processes// J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng .- 1961 .-vol. 3, N 1, - p. 95-109.
13. Aiba S., Hara M. Conception of average cumulative age ofmicroorganisms// J. Gen. and Appl. Microbiol .- 1965 .- vol. 11, - p. 25-41.
14. Бірюков В.В., Кантер В.М. Оптимізація періодичних процесівмікробіологічного синтезу .- М.: Наука .- 1985.
15. Фишман В.М. Математичний опис і оптимальне управлінняпроцесом біосинтезу антибіотиків// Дис. канд. техн. наук .- М.: Московськийінститут хімічного машинобудування-1970.
16. Ettler P., Votruba J. Determination of the optimal feeding regimeduring biosynthesis of erythromycin// Folia microbiol .- 1980 .- vol. 25, --p. 424-429.
-----------------------
